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O N T 纳米孔测序 Nanopore Sequencing "任何一项技术从概念到成熟需要你我的等待，支持和包容"      在自己整理和回看纳米孔测序的发展历程时，心中还是有很多感慨的。从1989年David Deamer的"灵光一现"，到2014年的MinION Access Programme的启动，再到今天2026年8月，整整过去了37年。直到最近自己在围绕纳米孔测序平台做应用开发，才深刻的领会到一个大胆设想变成可稳定交付的产品是需要多少人的参与、努力、坚持和无数次看似偶然的 "机缘巧合" 。序    虽然从事纳米孔测序有些时日了，但从未去详细的了解和整理其发展的历史，也曾 "稀里糊涂" 和Mark Akeson在2024年的London Calling上合了个影，这些对于一个研究人类进化历史出生的我来说是很不应该的。因此，最近初步整理了纳米孔测序的起源和发展历史，为自己后面更详细了解提供一个大纲，也为想了解纳米孔测序技术的人作一个参考。捋顺完整个发展历程，让我对纳米孔测序技术，包括其它生物技术，从想法到产品化的历程产生了更多的敬畏之心！     许多参与纳米孔测序发展的科学家都曾强调，这项技术并不是某一位研究者某个瞬间的偶然顿悟，也不是沿着一条清晰、线性的路线发展起来的。相反，这是一个长期而渐进的过程，涉及来自学术界和产业界的众多参与者。不同团队从不同方向、不同学科出发，分别为这项技术的发展贡献了重要成果。参与纳米孔测序演进的每一位研究者，也都有属于自己的故事。    这段历史也很好地说明了学术研究与产业研发协同的重要性。学术界的贡献往往可以从论文中追踪，而企业研发的很多关键进展，则更多体现在专利、工程设计和产品迭代中。纳米孔测序最终能够走向商业化，正是基础科学发现与长期工程开发共同作用的结果。    如果继续向前追溯，纳米孔测序之前还有一个更早的重要技术基础——单离子通道电流记录 (single-channel recording)。1976年前后，Erwin Neher和Bert Sakmann开发了后来著名的patch-clamp (膜片钳) 技术，使研究人员第一次能够直接记录单个离子通道开启和关闭时产生的微弱电流。    其基本原理是利用装有电解液的微玻璃电极与细胞膜形成高阻密封，再与外部电极组成电路，从而测量离子通过单个膜通道时产生的电流变化。经过多年的不断改进，Neher和Sakmann的方法最终能够记录并测量单个离子通道在开启和关闭过程中流过的电流大小，也因此获得了1991年诺贝尔生理学或医学奖。     从技术脉络来看，纳米孔测序正是在这一基础上继续向前发展：研究人员不再只是观察离子通道自身的开启和关闭，而是进一步利用分子进入或穿过孔道时引起的电流变化，判断究竟是什么分子经过，最终实现对DNA和RNA序列信息的读取。 一、 概念起源     这是一个被David Deamer曾多次讲述的故事：灵感闪现于1989年春夏之交的6月，时任美国加州大学戴维斯分校 (University of California , Davis) 教授的他在驾车去探亲的途中，行驶到俄勒冈州一条森林公路上时，突然产生了一个新的设想：将蛋白质通道嵌入脂质膜中，让单个核苷酸依次通过孔道，并通过记录不同核苷酸引起的离子电流变化来识别DNA序列。     当时，Deamer研究重点之一是构建人工细胞，即将核酸包裹在由脂质双层构成的囊泡中，模拟天然细胞膜包裹遗传物质的状态。与此同时，他已经开展了在脂质膜中构建微小通道的研究，使离子能够通过膜形成可测量的电流。Deamer还受到了当时一种名为Coulter counter (库尔特计数器) 技术的启发——红细胞通过膜上的微孔时会短暂扰动离子电流，通过记录这种电流变化，就可以判断细胞是否通过并进行计数。     驾车途中，Deamer一直在思考一个问题：核酸分子如何穿过几乎不透过这类大分子的脂质膜？他突然意识到，天然存在的微小蛋白孔道或许可以解决这个问题。进一步地，如果让离子电流通过这个孔道，那么核酸分子穿孔时就可能对电流产生可检测的影响，相当于构建了一个 "分子尺度的库尔特计数器"。     更关键的一步随之而来：DNA和RNA中的A、C、G、T（或U）在结构和大小上存在差异，因此不同碱基通过孔道时，理论上可能产生不同的电流信号。后来Deamer回忆到，当时这个想法突然变得如此清晰，以至于他立即把车停在路边，用红笔在记事本上画下了纳米孔测序最初的概念草图。这个看似简单的想法，后来成为纳米孔测序技术最早的概念基础之一，也开启了此后数十年的技术探索。 David Deamer于1989年绘制的纳米孔测序概念草图 二、 梦想逐步照进现实     但是，此后的两年里，这个想法一直留在Deamer的笔记本中，几乎没有被进一步讨论。一个重要原因是，当时Deamer手中还没有一个足够大、能够容纳DNA通过的纳米孔，因此很难真正开展实验验证。到1991年前后，他开始了解到美国国家标准与技术研究院 (National Institute of Standards and Technology, NIST) 物理学家John Kasianowicz关于蛋白孔道的研究，这为后续实验提供了的可能。     也正是在1991年，哈佛大学教授Daniel Branton受邀到访加州大学戴维斯分校。Branton曾是Deamer在UC Berkeley期间的博士后导师，两人在交流中发现，他们其实都在思考一个相似的问题：能否让DNA链穿过某种界面，并利用这一过程产生的信号读取序列信息。相比自己的设想，Branton更看好Deamer提出的 "让DNA通过膜上超微小孔道" 的思路，因此欣然接受Deamer的邀请，两人决定正式合作，开始推进纳米孔传感和核酸测序相关研究。 Daniel Branton     1992年，团队进一步明确由哈佛大学牵头相关知识产权工作。也正是在专利推进过程中，Deamer和Branton发现，哈佛医学院的George Church与Richard Baldarelli也在独立探索利用纳米尺度孔道读取DNA的类似思路。此后，两条研究路线逐渐汇合，Church和Baldarelli也进入了早期纳米孔测序的专利体系 (1998年, 获批的美国专利US5795782的发明人包括George Church, David Deamer, Daniel Branton, Richard Baldarelli和John Kasianowicz)。      1992年末，随着相关专利申请工作启动，Deamer前往马里兰州的盖瑟斯堡市 (Gaithersburg)，与John Kasianowicz一起测试α-hemolysin (α-溶血素) 纳米孔。Deamer随身带去了两种商业合成RNA：一种是由腺苷酸重复组成的poly(A)，另一种是由尿苷酸重复组成的poly(U)。这两种RNA都由多核苷酸磷酸化酶合成，而Deamer此前在脂质体实验中也使用过这种酶。     实验中，Kasianowicz首先在平面脂质双层膜中插入单个α-hemolysin 孔道，随后加入其中一种RNA，并以每次10 mV的幅度逐步提高膜两侧电压。随着电压升高，离子电流也逐渐增加，但起初并没有出现明显变化。直到电压升至约100-120 mV时，情况突然发生了变化：他们开始观察到大量短暂的离子电流阻断事件，每次持续数毫秒，有些情况下电流甚至下降了约 90%。当他们换用另一种RNA重复实验时，也观察到了类似现象。     这些短暂的电流阻断正是他们所期待看到的结果——它意味着带负电的单链核酸可能在外加电场驱动下进入甚至穿过蛋白孔道。对Deamer而言，这是一个极其关键的实验节点。后来他曾回忆，如果这次实验没有成功，纳米孔测序这一设想很可能就此被放弃。看到这一结果后，Deamer立即邀请Daniel Branton参加下一轮实验。1993年3月，三人再次开展实验，并再次获得成功。这让Deamer和Branton更加确信这一方向值得继续推进，于是决定申请美国国家科学基金会（National Science Foundation，NSF）的小额探索性研究资助。     1994年，在获得NSF (1994-1995) 5万美元资助后，Deamer和Branton得以继续与Kasianowicz合作开展为期两年的研究。团队在此前实验基础上进一步扩展研究，并发现：较长的RNA分子穿过纳米孔时，会产生持续时间更长的离子电流阻断，而较短RNA产生的阻断时间则相对更短。 这一结果表明纳米孔不仅能够检测核酸分子的通过，还可能根据电流阻断特征对单个核酸分子进行计数和表征。同年，Deamer转至加州大学圣克鲁兹分校（UCSC）任研究教授，在NSF等项目支持下，相关研究开始在UCSC、哈佛大学和NIST等机构之间持续推进。与此同时，Deamer与Branton也着手推动纳米孔测序相关知识产权和专利申请。     1996年，团队已经积累了足够多的证据证明，外加电场能够驱动单链DNA和RNA穿过α-hemolysin纳米孔，而双链DNA由于双螺旋结构尺寸过大，无法直接通过。研究还表明，当卷曲的单链核酸进入孔道时，纳米孔能够将其逐渐展开，使核苷酸以近似单列的方式依次通过。更重要的是，不同类型核苷酸对离子电流的阻断程度存在差异，这进一步支持了利用电流信号识别核酸组成的可能性。     不过，这项工作最初并没有立即得到顶级期刊认可。团队先后向《Nature》和《Science》投稿，但均未被接收。最终，这项研究于1996年12月发表在《PNAS》，论文题为 "Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel" ，作者包括John Kasianowicz、Eric Brandin、Daniel Branton和David Deamer。这篇论文后来成为纳米孔测序发展史上的标志性工作之一。至此，纳米孔测序从最初的概念设想，真正进入了具有实验依据的技术发展阶段。 纳米孔核酸检测的实验性概念验证的文章     1997年，曾在Deamer实验室接受训练、当时正在NIH从事博士后研究的Mark Akeson加入早期纳米孔测序项目。最初，Akeson其实并不相信纳米孔测序这一设想能够真正实现。转折点出现上面提到的《PNAS》论文的发表，Akeson后来回忆，正是这一关键实验改变了他的判断，也直接促使他携家人迁往Santa Cruz，加入Deamer团队。     来到UCSC后，Akeson主要负责推进纳米孔测序所需的分子生物学和实验体系建设，并在巴斯金工程学院 (Baskin School of Engineering) 实验室搭建早期纳米孔检测装置。在 "核酸可以穿孔" 已经得到验证的基础上，他进一步把研究重点推进到更关键的问题：不同核苷酸通过纳米孔时，是否能够产生可区分的电流信号。     加入项目后，Akeson首先合成了一条由 30个腺嘌呤（A）和70个胞嘧啶（C）组成的RNA分子。当这条RNA被电场驱动穿过α-hemolysin纳米孔时，他观察到明显的两段不同电导水平，分别对应RNA中的C区段和A区段。虽然当时还无法分辨单个碱基，但这一结果表明纳米孔已经能够识别核酸分子中化学性质或结构不同的区域，进一步支持了利用离子电流读取核酸序列信息的可行性。1999年，团队发表相关研究，并在论文中将α-hemolysin这样的纳米尺度通道称为 "nanopore (纳米孔)"，此后的工作也使他逐渐成为早期纳米孔测序技术开发中的核心成员之一。 Mark Akeson     1998年，由哈佛大学团队提交的重要专利 "US Patent 5795782" 获得授权，专利名称为 "Characterization of Individual Polymer Molecules Based on Monomer-Interface Interactions"。该专利围绕利用单体分子与纳米尺度界面相互作用产生的信号，对单个聚合物分子进行表征，成为早期纳米孔测序技术知识产权体系中的重要基础之一。     随后，Deamer和Akeson迎来了团队的第一位研究生Wenonah Vercoutere。起初，她加入Deamer实验室并非专门从事纳米孔研究，而是参与其他科研项目，但很快便被招募到Akeson的实验工作中，正式参与纳米孔测序技术的早期研发。 早期UCSC 纳米孔研究小组：David Deamer (最左边) , Hugh Olsen, Wenonah Vercoutere, Mark Akeson (最右边）     2001年，Vercoutere以第一作者在《Nature Biotechnology》发表论文，团队进一步证明，不同DNA碱基在通过α-hemolysin纳米孔时会产生可区分的离子电流阻断特征。这项研究不仅观察到DNA发卡结构进入纳米孔、在孔道中解链并继续穿过的动态过程，也进一步证明了纳米孔具有识别不同核酸组成的潜力。对于当时仍抱有怀疑态度的学界而言，这是一项重要的说服性证据。     与此同时，在UCSC基因组学研究者David Haussler及其学生Stephen Winters-Hilt的帮助下，团队开始引入计算方法和机器学习，对复杂的离子电流信号进行自动识别，并尝试将其转化为DNA碱基组成信息。至此，纳米孔测序的发展已经不再只是 "让DNA穿过孔道"，而是开始进入"如何从电信号中读取序列信息" 的阶段，实验生物学与计算分析也由此逐渐结合起来。     随着纳米孔测序概念逐步得到验证，研究人员很快面临两个核心技术难题：一是纳米孔的孔径还不够理想，需要让孔道最狭窄的位置一次只容纳少数几个碱基，以提高碱基识别能力；二是DNA穿孔速度过快，必须想办法将其显著减慢。早期实验中，DNA通过纳米孔的速度大约只有每个碱基2微秒，而要获得足够清晰、可解析的电流信号，最好将这一过程放慢到毫秒级，也就是慢约1000倍。     对于如何减慢DNA的问题，Mark Akeson率先取得了重要突破。他发现，可以利用聚合酶结合DNA链，并借助酶与DNA之间的相互作用来控制分子的运动速度。这个思路后来发展成为纳米孔测序中 "利用分子马达控制核酸通过孔道" 的关键技术基础。     几年后，NIH推动的 "1000美元基因组计划" 吸引了更多研究人员进入纳米孔测序领域，其中包括华盛顿大学的物理学家Jens Gundlach。他的团队发现并工程化改造了来源于耻垢分枝杆菌的蛋白纳米孔MspA。与此前常用的α-hemolysin相比，MspA具有更短、更狭窄的孔道收缩区域，更适合分辨DNA通过时产生的细微电流差异。随后，Gundlach团队围绕MspA纳米孔及其测序应用申请了相关专利，并将其发展为另一条重要的纳米孔测序技术路线。 三、 另一条通向纳米孔测序的路径     在David Deamer团队不断推进核酸穿孔实验的同时，其他研究者也在沿着不同方向探索纳米孔技术，其中最重要的人物之一就是英国化学家Hagan Bayley。Bayley长期从事α-hemolysin和膜蛋白孔研究，是蛋白纳米孔工程领域的重要科学家。 Hagan Bayley     20世纪90年代初，Bayley在美国马萨诸塞州伍斯特实验生物学基金会(Worcester Foundation for Experimental Biology，WFEB) 工作期间，与Eric Gouaux等人研究α-hemolysin的结构（1990-1996），并帮助阐明了这种蛋白孔的三维构型。α-hemolysin整体呈类似 "蘑菇" 的形状，由较大的 "帽部" 和狭长的 "茎部" 组成，其中茎部形成直径约2 nm的跨膜孔道。这种结构让Bayley意识到，蛋白纳米孔不仅可以作为物质运输通道，也可以成为一个天然的单分子传感器。 α-溶血素的三维结构示意图     基于这一认识，Bayley开始发展后来被称为stochastic sensing (随机传感) 的技术：在蛋白孔两侧施加电压形成稳定离子电流，当单个分子进入孔道或与孔内特定位点发生短暂结合时，会产生特征性的电流阻断，从而可以据此判断分子的种类和浓度。值得一提的是，这项研究最初并不是为DNA测序而设计。20世纪90年代初，美国海军研究办公室（ONR）的Harold Bright看中了其在金属离子检测等领域的潜力，希望其未来能够用于环境或军事传感（例 如果能够利用蛋白纳米孔检测水中的金属离子，就有可能进一步用于监测潜艇航行过程中留下的相关化学信号），因此，Bright为Bayley提供研究资助，同时鼓励其申请相关专利，他认为这种单分子传感方法的应用显然不会局限于军事领域。此后，美国能源部也对Bayley的随机传感研究给予了支持。   这一阶段，Bayley还曾与John Kasianowicz合作，通过基因工程改造α-hemolysin，使其能够作为金属离子生物传感器，同时探索其在材料合成等领域的应用。也就是说，在Kasianowicz后来与Deamer团队共同证明核酸能够穿过α-hemolysin之前，他已经在Bayley的研究体系中积累了丰富的蛋白孔工程和单通道电流检测经验。     2001年前后，Bayley已在Texas A&M University继续发展基于蛋白纳米孔的高灵敏生物传感器，应用方向涵盖生物战剂 (biological warfare agents) 检测、环境污染监测和药物筛选等，并希望将纳米孔传感器与微流控技术结合，发展“lab-on-a-chip”系统。也正是在这一时期，随着Deamer、Branton和Church等人提出的纳米孔测序概念不断发展，Bayley也开始思考，自己长期研究的工程化蛋白孔是否可以真正用于DNA识别。2001年，Bayley与Stefan Howorka、Stephen Cheley在《Nature Biotechnology》发表研究，将DNA探针固定在工程化α-hemolysin纳米孔内部，并通过离子电流变化识别进入孔道的单链DNA。研究表明，这种传感器能够区分长度不超过30个核苷酸、仅存在一个碱基差异的DNA分子，证明了工程化纳米孔具有单碱基差异识别能力。     真正促使Bayley将研究重心进一步转向DNA测序，是2003年前后的两个因素。一方面，美国NIH/NHGRI启动了“1000美元基因组”计划，希望推动更快速、更低成本的基因组测序技术；另一方面，他与老朋友、任职斯克利普斯研究所 (Scripps Research Institute) 的化学家Reza Ghadiri开始深入讨论纳米孔测序的可行性。两人在一次ONR项目会议上听到DNA和RNA穿过α-hemolysin纳米孔的研究报告后，很快意识到，纳米孔测序真正需要解决的并不是 "核酸能不能穿孔"，而是两个更核心的问题：能不能在DNA经过孔道时识别单个碱基，以及能不能把DNA的移动速度精确控制到单碱基步进的水平。 Reza Ghadiri     随后，Bayley和Ghadiri开始围绕这两个问题展开合作。2003年Bayley转至牛津大学任化学生物学教授后，这项研究继续推进。到2005年前后，他们已经能够将单条DNA暂时捕获在α-hemolysin孔道中，并识别DNA链特定位置上的单个腺嘌呤。同年，两人的联合项目获得NIH "1000美元基因组" 计划约420万美元资助，用于进一步开发工程化纳米孔、分子适配器（molecular adapter）以及DNA过孔速度控制技术。     2006年，Bayley团队又取得重要突破：利用工程化α-hemolysin纳米孔结合分子适配器，证明不同核苷酸可以产生可区分的电流信号，并进一步提出了exonuclease sequencing (外切酶测序) 的思路，即先由外切酶从DNA末端逐个切下核苷酸，再让这些游离碱基依次进入纳米孔进行识别。     与此同时，团队还在攻克另一个关键难题——DNA穿孔速度过快。2007年前后，Bayley和Ghadiri进一步证明，可以利用DNA polymerase（DNA聚合酶）控制DNA在纳米孔中的运动，使其以接近单核苷酸步进的方式通过孔道。相关成果随后在2008年正式发表。这意味着，纳米孔测序最核心的两个问题——碱基识别和DNA过孔速度控制——都开始出现可行的解决方案。     到这一阶段，Bayley已经不再只是将蛋白纳米孔作为单分子传感器，而是在系统地把它改造成真正可以用于DNA测序的工具。如果说Deamer团队首先证明了 "核酸能够穿过纳米孔并留下可检测的电信号"，那么Bayley团队的关键贡献，就是进一步证明经过工程化改造的蛋白孔可以识别单碱基差异，并通过分子马达控制DNA运动，为真正实现连续测序奠定技术基础。 四、 从实验室到成果转化     随着纳米孔测序逐渐显示出真正的技术潜力，Bayley也开始意识到，仅靠大学实验室已经很难完成后续的大规模工程开发。幸运的是，他此前已经积累了一些科研成果产业化的经验。     早在 Texas A&M University 任职期间，Bayley就曾尝试将自己的随机传感 (stochastic sensing) 技术商业化。他与德国同行Christian Schmidt和Bernhard Seitz在德国Jena共同成立了STS Diagnostics GmbH，希望将工程化蛋白纳米孔用于不同类型的分子检测。不过，这家公司由于融资和当地行政审批等方面的困难，并没有真正发展起来。     2003年夏天，已经转到牛津大学任职的Bayley，在新建的化学研究实验楼里与科技投资机构IP2IPO Group Plc的Spike Willcocks第一次正式讨论创业。当时，Bayley的重要知识产权仍主要来自Texas A&M University，牛津大学并不拥有这些专利，因此合作空间一度有限。到2004年夏天，STS Diagnostics迟迟无法筹集资金完成TAMU专利许可，而Bayley在牛津的新研究又已经产生了一批新的知识产权，这才为在英国重新组建公司创造了条件。     Bayley和Willcocks随后设计了一套新的商业方案：由牛津大学成立一家新的衍生 (spin-out) 公司，引入IP2IPO作为股东和种子投资方，同时收购STS Diagnostics，以争取保住Bayley此前在Texas形成的相关知识产权许可。就在这一过程中，Willcocks偶然遇到了正在寻找创业机会的Gordon Sanghera。 Gordon Sanghera     Sanghera具有生物电子工程背景，此前曾在Oxford大学衍生公司MediSense及其后来所属的Abbott Laboratories负责新一代血糖检测设备开发。他很快意识到，纳米孔传感和血糖传感器之间存在明显的技术相似性：两者本质上都需要将微弱的生物或化学信号转化为稳定、快速、可规模化读取的电子信号。Sanghera的工程经验和产业背景，也成为后来公司能够真正把纳米孔技术做成仪器和芯片平台的重要因素。     在Bayley的知识产权、Sanghera的产业经验以及Willcocks的融资推动下，牛津大学最终同意成立新的衍生 (spin-out) 公司，并命名为Oxford NanoLabs。与此同时，原STS Diagnostics的德国团队则以Jena NanoLabs的形式继续发展，并计划与英国的新公司保持合作。 五、 Oxford NanoLabs的成立与融资     2005年初，Bayley、Sanghera和Willcocks向IP2IPO提交了最初的商业计划。最初的目标并不是直接开发DNA测序仪，而是先从诊断和生物标志物检测切入，以此建立核心平台，包括检测设备和一次性芯片；随着技术成熟，再逐步拓展到离子通道筛选以及更具长期价值的 "1000美元基因组" 测序市场。     这一计划获得批准后，Oxford NanoLabs于2005年5月13日正式注册成立，并获得IP2IPO首笔50万英镑投资。最初团队只有Bayley、Sanghera和Willcocks几人，公司甚至一度在牛津化学系一栋准备拆除的旧实验楼中办公。2006年1月，Willcocks离开IP2IPO，正式加入公司，负责商务和企业发展。 Gordon Sanghera和Spike Willcocks在Oxford NanoLabs      公司成立后，融资能力迅速成为其发展的关键。Bayley获得的NIH "1000美元基因组" 计划420万美元科研资助，也成为说服投资者的重要背书。到2005年底，公司已经完成两轮种子融资；2006年6月又获得约770万英镑投资，使团队得以快速扩张并迁入牛津Begbroke Science Park的孵化空间。 Begbroke Science Park ， University of Oxford     2008年3月，公司再次融资约1000万英镑。此时，团队规模、研发能力和商业目标都已经明显扩大，公司名称也逐渐由Oxford NanoLabs转变为后来广为人知的Oxford Nanopore Technologies（ONT）。 六、 专利布局     随着融资能力增强，Oxford Nanopore Technologies很快开始大规模布局纳米孔相关知识产权。对Gordon Sanghera来说，这几乎是公司成立后的首要任务之一。他此前在MediSense工作的经历让他深刻认识到，核心专利储备不足会严重限制一家技术公司的长期竞争力，因此ONT从早期就采取了非常积极的专利许可策略，希望尽可能将全球重要的纳米孔技术纳入公司的知识产权体系。     2007年，Gordon Sanghera和Spike Willcocks主动找到David Deamer、Daniel Branton和Mark Akeson，希望获得他们此前积累的纳米孔测序相关专利许可。对于这几位长期依靠科研经费推进技术的科学家而言，这一提议很有吸引力，因为ONT不仅愿意投入资金，而且对纳米孔测序漫长的技术成熟周期表现出了足够耐心。     这点尤其重要。此前，Deamer等人曾获得分析仪器公司Agilent Technologies的支持，但由于数年内未能迅速形成成熟产品，合作最终中止。相比之下，ONT更清楚地认识到，纳米孔测序并不是简单购买天然α-hemolysin蛋白就能够直接实现的技术，而是需要长期进行蛋白工程、分子马达、芯片、电路和信号分析等一系列系统性开发。     到2008年前后，ONT已经与多位国际领先的纳米孔研究者签署了多项独家专利许可协议，并建立了一系列外部科研合作。公司一方面吸收关键知识产权，另一方面直接资助全球科研团队开展更基础、更前沿的研究。由此，原本分散在不同实验室中的多条纳米孔研究路线开始逐渐汇集到ONT这一商业平台之中。     从这个阶段开始，ONT的优势已经不再只是Bayley团队自身的蛋白孔技术，而是通过专利许可、科研合作和持续融资，把Deamer、Branton、Akeson以及其他国际团队长期积累的关键技术逐步整合起来。这也为后来真正建立完整的商业化纳米孔测序平台奠定了基础。 七、 从纳米孔传感走向核酸测序     Oxford Nanopore Technologies成立之初，并没有把DNA测序设定为唯一目标，公司最早的商业设想还包括利用纳米孔平台开发分子诊断产品。为此，Sanghera和Willcocks曾在欧洲和美国寻找诊断企业合作，希望共同开发基于纳米孔的新型检测项目。但结果并不理想：多数公司虽然认可这项技术很有吸引力，却认为在缺少成熟检测项目、临床验证和监管批准的情况下，介入仍然为时过早。     这段经历最终促使公司重新思考发展方向。2007年5月，ONT决定调整原有商业计划，将“1000美元基因组”测序作为首要应用方向，而把FDA批准的诊断产品放到更长期的发展阶段。 从这一刻开始，DNA测序正式成为公司的核心战略。     这一转向在2008年进一步得到强化。6月，遗传学家和计算生物学家Clive Brown，以及药物化学家John Milton加入ONT管理团队。两人此前都曾在Solexa工作，而Solexa正是后来Illumina短读长测序技术的重要来源之一，因此他们带来了非常宝贵的测序平台开发和产业化经验。     其中，Clive Brown此前长期参与测序技术和生物信息学开发。Solexa被收购后，他曾加入Wellcome Trust Sanger Institute，参与建设大规模Solexa/Illumina测序平台，并服务于当时正在推进的千人基因组计划（1000 Genomes Project）。加入ONT后，他开始将自己在下一代测序、生物信息分析和大规模测序平台建设方面的经验带入纳米孔技术开发。 Clive Brown，CTO     至此，ONT的定位开始发生根本变化：它不再只是一家围绕蛋白纳米孔和单分子传感建立的平台公司，而是逐渐明确要把纳米孔技术发展成一种全新的DNA测序方式。Bayley提供蛋白纳米孔和单分子传感基础，Sanghera推动商业化和工程开发，而Brown等人则进一步补上了测序平台和生物信息学能力。 ONT后来真正成为一家测序公司，正是在这一阶段逐步成形。 八、 向测序市场发起挑战     当ONT决定将DNA测序作为公司的核心方向时，这其实是一场风险很高的选择。2007年前后，下一代测序市场已经逐渐被少数几家公司主导，其中最具代表性的就是Solexa/Illumina。Solexa由剑桥大学的Shankar Balasubramanian和David Klenerman等人推动建立，其核心的边合成边测序 (Sequencing By Synthesis，SBS）技术通过可逆终止核苷酸和大规模并行的DNA簇扩增，实现了数百万条DNA分子的同时测序。2007年1月，Illumina正式完成对Solexa的收购，此后这一技术逐渐成为短读长测序市场的主流。     与传统Sanger测序相比，SBS已经极大提高了测序通量，但在ONT团队看来，当时的测序平台仍然存在明显局限：仪器体积较大、购置成本高，需要持续消耗昂贵试剂，而且产生的主要是短读长数据。对于很多实验室来说，测序仍然需要依赖大型中心化平台，样本被送往测序中心，完成测序和分析后再返回结果。     Gordon Sanghera和Clive Brown等人认为，纳米孔测序技术有机会从根本上改变这种模式。 与通过DNA合成反应间接读取序列不同，纳米孔可以直接检测单个DNA或RNA分子通过孔道时产生的电信号，理论上不需要荧光标记和复杂的光学成像系统，也没有由合成循环本身决定的固定读长限制。ONT希望借此建立一种成本更低、速度更快、能够实时读取，并最终可以小型化甚至便携化的全新测序平台。ONT后来也一直将 "实时、可扩展和便携" 作为其技术路线的重要特征。     这种想法背后还有一个更大的目标——让DNA测序从少数大型测序中心走向普通实验室，甚至走出实验室。 如果测序设备能够足够便宜和便携，研究人员就不必再把所有样本送到少数大型中心，而可以直接在实验现场获取序列信息。对于病原体暴发监测、野外生态调查等需要快速获得测序结果的场景，这种模式尤其具有吸引力。     但要实现这一目标，ONT几乎需要从零开始建立整套纳米孔测序系统。与已经成熟的SBS平台不同，纳米孔测序不仅需要解决蛋白孔和DNA运动控制，还需要自己开发膜体系、传感芯片、微弱电流检测电路、流控系统以及后续的数据分析和碱基识别算法。它并不是对已有测序仪进行简单改进，而是一次从底层原理开始的重新设计。     早在2006年4月，ONT工程师就已经做出了第一台非常原始的纳米孔检测设备，并将其带去向投资人展示。那是一台由电池供电、大小接近计算器的盒子，内部插入一块塑料芯片，芯片上只有一个纳米孔，用来检测环糊精等分子。设备甚至只有一个施加电压的按钮，想要关机，只能把它拆开。Willcocks后来回忆，当他们提出要把这台设备带到伦敦、当着一批投资人的面进行现场演示时，Bayley觉得他们"简直疯了"。但在Sanghera向第一批投资人介绍公司的过程中，Willcocks真的让这台装置运行了起来，并现场展示了单分子检测信号。由于设备没有正常的关机方式，他们甚至只能让它一直开着，再带去见下一批投资人。     这次演示连团队自己都感到意外：原本只能在实验室中完成的纳米孔单分子检测，竟然第一次被带出了实验室，而且还能继续工作。 虽然这台设备看起来十分简陋，却足以让早期投资人看到其中的潜力。对于当时的ONT而言，这个小盒子的意义并不在于它已经是一台测序仪，而在于它第一次让团队看到了另外一种可能：未来的核酸测序仪，也许不必是一台昂贵而庞大的实验室设备，而可以被做得足够小，甚至由个人研究者随身携带。这一设想后来逐渐成为ONT最鲜明的技术理念之一，并最终在多年后的MinION上真正实现。 九、 打造真正可用的纳米孔测序平台     要把纳米孔测序真正做成一套稳定、可重复使用的商业平台，ONT还需要解决一长串工程难题。公司科学家一方面独立开展研发，另一方面继续与学术界保持紧密合作。正如Clive Brown后来所说，从 "论文中证明原理可行" 到 "让别人拿到手里也能稳定工作"，中间存在巨大的鸿沟。很多在实验室里可以接受的条件，一旦进入商业产品，就必须变成可制造、可运输、可保存、可重复运行的标准化体系。     要打造一套真正稳定、可商业化的纳米孔测序平台，ONT需要解决的远不只是 "DNA能不能穿过纳米孔" 这一个问题，而是一整套此前从未有人真正解决过的科学与工程难题。公司科学家一方面独立开展研发，另一方面与学术界保持紧密合作，双方在实验结果、技术路线和基础研究上不断相互反馈、彼此推动。     Clive Brown后来特别强调，从 "发表一篇证明原理可行的论文"，到 "做出一台交到别人手里也能稳定工作的商业产品"，中间存在着巨大的鸿沟。而学术界从来不理解这些，曾有学者开玩笑地认为，学术界已经完成了95%的工作，企业只需要完成最后5%。但在Brown看来，现实恰恰相反：证明一个原理可行，往往只是开始，真正艰难的是把它变成稳定、可靠、可制造、可运输、可重复使用的产品。     最早遇到的一个核心问题，就是如何为蛋白纳米孔提供足够稳定的膜支撑。此前学术研究通常使用脂质双层膜：研究人员先在类似聚四氟乙烯的材料上制作一个微小孔洞，再手工"涂"上一层脂质膜，然后将蛋白纳米孔插入其中开展实验。虽然这种方法能够用于基础研究，但膜结构非常脆弱，对温度、pH和机械扰动都十分敏感。     这种脆弱性在实际实验中尤为明显。早期脂质膜往往只能维持几秒到几分钟，一旦膜破裂，整个纳米孔检测体系就必须重新搭建。研究人员有时一天需要反复制作数十甚至上百次膜，才能获得少量可用数据。后来加入ONT的化学家James Clarke回忆，他在Bayley实验室做博士后时，甚至可能花上一整天搭建膜体系，却只能获得半小时左右的有效实验数据。     对于商业化测序仪来说，这显然无法接受。ONT因此开始寻找新的膜材料和构建方式，希望开发一种能够批量制造、长期稳定，并且可以运输到用户手中的膜体系。经过大量化学和材料研究，团队最终利用表面张力等物理性质，在芯片阵列上形成了非常稳定、寿命更长的超薄膜。James Clarke曾形象地将这种膜比作 "肥皂泡"：它同样依赖液体界面的物理性质，但膜本身只有大约两个分子厚，却需要横跨约100微米的空间。他把这种尺度比作 "人们手拉着手跨越大峡谷"——薄得惊人，却必须保持完整和稳定。     最终得到的膜体系远比早期学术实验中的脂质膜坚固。Clive Brown后来回忆，这些带有纳米孔的膜可以在室温下运输，甚至能够随火箭进入国际空间站，并在数月后仍保持功能。他甚至曾把一块芯片放在汽车杂物箱里半年，取出后依然能够使用。把一个只能维持几分钟的实验膜，变成能够保存、运输并稳定工作数月的芯片膜体系，是ONT将纳米孔测序从实验室推向商业产品的重要工程突破之一。     ONT面临的第二个关键问题，就是寻找真正适合测序的蛋白纳米孔。一个理想的孔道不仅要能够让单链DNA稳定通过，还需要具有足够狭窄、明确的检测区域，使核酸经过时产生的细微电流变化能够被准确区分。学术界曾探索过多种蛋白孔，其中很重要的一种是MspA（Mycobacterium smegmatis porin A），来源于耻垢分枝杆菌的外膜孔蛋白。2008年，华盛顿大学Jens Gundlach团队证明MspA具有用于纳米孔DNA检测的潜力。与呈 "蘑菇状" 的α-hemolysin不同，MspA更像一个漏斗，具有短而狭窄的收缩区，因此同一时间影响电流信号的核苷酸数量更少，更有利于提高序列识别的分辨率。     ONT早期同样使用过α-hemolysin，但很快开始寻找新的孔蛋白，并通过蛋白工程不断改造其结构和电学性质。为此，公司筛选了数十种不同类型的纳米孔以及数千个突变体。在这一过程中，CsgG逐渐进入研究人员的视野。CsgG是一种存在于大肠杆菌等细菌外膜中的蛋白，天然参与细菌生物膜和curli纤维形成相关过程。2014年，比利时Flanders Institute for Biotechnology的Han Remaut团队解析了CsgG的结构。它具有一个非常狭窄而且边界明确的孔道收缩区域，这种结构非常适合让单链DNA通过并产生稳定的离子电流信号。经过大量筛选和工程化改造后，CsgG表现出了优于ONT此前测试的一些孔蛋白的性能，并逐渐成为其后续测序化学的重要基础。之后，ONT还继续对这一孔蛋白体系进行工程化，通过改变孔道中的识别区域等方式进一步提高信号质量和测序准确度。     但有了稳定的膜和合适的孔，仍然不够。每一个纳米孔产生的电流变化都极其微弱，而且商业化测序平台需要同时读取大量纳米孔的信号。因此，ONT还必须从头开发专用的专用集成电路 (Application-Specific Integrated Circuit，ASIC）。     早期学术研究通常使用Axopatch等高灵敏度电生理设备记录单个离子通道的电流，这类仪器能够获得非常低噪声的信号，却一次只能监测少量甚至单个孔道。ONT需要做的，是把接近这种实验室 "金标准" 的电流检测能力压缩进一块很小的芯片里，同时布置大量独立检测电路，使成百上千个纳米孔能够并行工作。     这项工作对电子工程的要求极高：芯片既要以很高的速度采集信号，又必须把背景噪声控制到极低水平，从极其微弱的离子电流变化中识别DNA经过孔道产生的信号。没有ASIC，就不可能把单个纳米孔实验扩展成真正的并行测序平台。     第三个核心难题则是马达蛋白。DNA如果仅依靠电场自由穿过纳米孔，速度过快且运动不规则，根本无法稳定读取碱基。因此团队需要找到一种能够抓住DNA并像 "分子棘轮" 一样逐步释放DNA的酶，使核酸以可控速度穿过检测区域。除了这些核心部件，ONT还需要从头设计flow cell（流动池）。一个商业化flow cell中包含大量微孔，每个微孔对应一个纳米孔传感单元，并与底部ASIC电路连接，同时还需要温控、流体输送和软件监测系统。     公司早期其实同时探索了两条测序路线。第一条被称为BASE（Bayley Sequencing），延续Bayley提出的外切酶测序思路：先让外切酶从DNA末端逐个切下核苷酸，再由纳米孔逐一识别。第二条则是Strand Sequencing (链测序），也就是延续Deamer和Branton最初的设想，让整条DNA链直接穿过纳米孔并连续读取。     早期来看，BASE路线一度非常有希望。2009年，Bayley实验室与ONT团队的研究表明，工程化纳米孔不仅能够区分A、C、G、T四种标准碱基，还可以识别甲基化碱基，为直接检测表观遗传修饰提供了可能。也正因为如此，Illumina在2009年向ONT投资1800万美元，并获得这一外切酶测序平台的独家商业权利。     但真正把这套方法做成连续测序系统时，问题变得异常复杂。外切酶切下来的核苷酸如何按原来的顺序逐个进入孔道，如何保证不丢失、不扩散、不乱序，以及如何让生物化学过程与电子检测完全同步，都成为难以解决的问题。经过大约三年的大量投入，ONT最终在2011年前后放弃了BASE路线。     不过，外切酶测序路线受挫并不意味着ONT失去了方向。过去几年里，公司一直没有放弃另一条Strand Sequencing (链测序) 路线，同时也持续资助相关学术研究。到2009年底，ONT开始明显加大对链测序的投入，并与外部学术团队频繁交流实验进展和技术反馈。     James Clarke后来回忆，这种公司与学术界之间的互动，某种程度上形成了一场相互推动的 "竞赛"：ONT内部不断取得新的工程进展，合作实验室也随之加快研究节奏，而学术界的新发现又反过来推动公司的技术迭代。正是在这种彼此促进的过程中，链测序逐渐从一条备选路线，发展成为ONT后来真正押注的核心技术方向。    在推进链测序的早期阶段，ONT曾评估过Reza Ghadiri团队首先展示的酶促逐步转运方案，但最终没有沿用这一路线。相反，公司把重点放在Mark Akeson团队关于DNA聚合酶的研究上，尤其是大肠杆菌DNA polymerase I的Klenow fragment，并将其与Hagan Bayley团队工程化改造的α-hemolysin纳米孔结合。     到2010年6月，ONT已经确认，Klenow fragment具有作为DNA "马达" 的潜力，能够控制DNA在孔道中的运动速度，而工程化α-hemolysin则能够对不同核苷酸产生可区分的电流响应。James Clarke后来回忆，把 "孔" 和 "酶" 真正组合到一起，是公司内部一个非常振奋的时刻，因为这意味着他们第一次看到了一套有可能发展成商业测序仪的完整测序化学体系。     同年9月，Clarke将这一进展带到加州，与Akeson等学术团队交流。不久之后，研究人员又将马达蛋白升级为来源于φ29噬菌体的DNA聚合酶。Akeson团队在Kate Lieberman等人的研究中证明，φ29 DNA聚合酶能够显著降低DNA通过纳米孔的速度，使其控制在大约每秒50个核苷酸的量级。     在尝试DNA聚合酶作为马达蛋白的同时，ONT也开始重点研究Helicase（解旋酶）。解旋酶天然能够沿双链DNA移动并将两条链逐步解开，因此非常适合承担 "解链+控速" 的双重任务。团队希望利用解旋酶将双链DNA逐步拉开，使其中一条单链以受控速度从膜的cis侧穿过纳米孔，到达另一侧的trans侧。当DNA经过孔道最狭窄的检测区域时，不同碱基组合会以不同方式影响离子电流，从而形成可用于推断序列的电信号。     事实上，解旋酶作为纳米孔测序马达蛋白的可能性，早已在Deamer团队的一些早期专利中被提出。相比DNA聚合酶，解旋酶还有一个明显优势：聚合酶正常工作通常需要四种dNTP作为底物，而许多解旋酶只需要ATP作为能量来源，反应体系相对更简单。ONT随后验证发现，解旋酶确实能够有效控制DNA通过纳米孔的运动，这也为后来以解旋酶类马达控制DNA穿孔速度的技术路线奠定了基础。     但即使解决了 "孔" 和 "马达"，纳米孔测序还缺少最后一个关键环节——Basecaller (碱基识别算法)。纳米孔直接记录的并不是A、C、G、T字母，而是一条随时间连续变化的离子电流曲线。真正的序列信息隐藏在这些复杂的电流变化之中，因此必须通过算法把原始电信号转换成DNA碱基序列。     这项工作主要由ONT内部完成。要训练可靠的Basecaller，需要获得大量 "已知DNA序列—对应纳米孔电流信号" 的训练数据，而早期学术实验中脆弱的脂质膜很难持续产生如此规模的数据。ONT此前解决的稳定膜和芯片阵列问题在这里发挥了关键作用：研究人员终于能够长时间连续运行大量纳米孔，迅速积累训练数据。团队花费大约一年时间建立大规模训练集，并据此逐步构建能够自动解析纳米孔电流信号的碱基识别算法。     至此，现代纳米孔测序最核心的几个模块开始逐渐成形：工程化蛋白孔负责感知DNA碱基变化，解旋酶等马达蛋白负责解链和控制过孔速度，ASIC负责采集微弱电流，而Basecaller则负责把电信号重新翻译成A、C、G、T序列。 这些环节的结合，才真正让纳米孔测序从一个单分子实验，发展成可以连续读取DNA的完整测序平台。 十、 开发一款便携的仪器     在ONT开始为Basecaller积累大规模训练数据的同时，Clive Brown也开始重新思考纳米孔测序仪应该是什么样子。他希望把设备做得尽可能小、尽可能简单，让普通科研人员甚至偏远地区的临床工作者也能够直接使用。公司此前在稳定膜体系上的突破给了他很大启发：纳米孔测序不依赖传统测序仪所需要的激光、相机、复杂泵路以及大量试剂和废液系统，因此理论上完全可以被做成一种更小、更便宜的电子设备。    到2011年，Brown已经设计出一个可以放在手掌中的便携式原型。它主要由一块电路板和金属外壳组成，几乎没有复杂机械结构，后来被命名为MinION。这一设想在当时相当激进，因为它与市场上体积庞大、价格昂贵的主流测序仪完全不同，甚至一度受到质疑。但ONT董事会最终支持了Brown的方案。     真正的挑战随后才开始：团队不仅要证明这个小型设备能够稳定运行，还必须把纳米孔、膜、ASIC芯片、马达蛋白、流动池以及Basecalling算法等多个环节真正整合到同一平台上，并进一步解决批量制造问题。     2011年3月，Brown及其团队首次使用MinION原型成功读取了一段人工合成DNA。大约一年后，团队又使用该设备成功解析了 φX174噬菌体约4.8万碱基的基因组。他们将双链DNA两端连接起来，使两条链能够依次通过同一个纳米孔，从而在一次连续测量中获得整个基因组的信息。     这一结果具有重要意义。此前许多纳米孔实验主要是在已知序列DNA上观察电流变化，再把信号与已知序列进行对应；而ONT这次开始真正从纳米孔产生的未知电流信号中反推出DNA序列。因此，ONT是第一个真正利用纳米孔技术实现 DNA 测序的团队，也就是说，纳米孔技术开始从 "识别已知分子" 真正跨入了 "读取未知DNA序列" 的阶段。  MinION原型机 十一、 纳米孔测序公开亮相     2012年2月，纳米孔测序迎来了一个重要的公开亮相节点。在佛罗里达举行的Advances in Genome Biology and Technology（AGBT）大会上，学术界和ONT团队几乎同时展示了各自在纳米孔测序上的最新进展。     学术界方面，Mark Akeson和Jens Gundlach展示了一套由两方团队共同构建的纳米孔测序体系：使用Gundlach团队开发的MspA纳米孔(Reading DNA at single-nucleotide resolution with a mutant MspA nanopore and phi29 DNA polymerase，2012 March, NBT)，配合Akeson团队研究的φ29 DNA聚合酶控制DNA移动速度，相关成果随后于2012年4月发表在《Nature Biotechnology》，并成为当期封面研究之一。  Mark Akeson et al. 'Automated forward and reverse ratcheting of DNA in a nanopore at five angstrom precision'     与此同时，ONT的Clive Brown在会上公布了公司利用纳米孔技术获得的φX174噬菌体完整基因组序列数据，并首次公开展示了公司正在开发的两类测序设备。其中一款是桌面式GridION，设计中包含约8000个纳米孔；另一款则是体积更小、可以直接连接计算机使用的MinION。 在AGBT大会上展示的MinION原型机     但真正吸引全场目光的，是他随后公布的MinION。Brown预测，这款只有手掌大小的设备未来能够在6小时内读取接近10亿个DNA碱基，而售价仅约900美元。对于当时仍以大型、昂贵测序仪为主的行业来说，这一设想极具冲击力和颠覆性。Sanghera后来回忆，Brown公布MinION时，现场甚至传出了明显的惊叹声；Brown本人也形容，当时的反响远远超出了预期。     MinION的亮相很快在测序圈引发讨论。伯明翰大学微生物基因组学和生物信息学教授Nick Loman随后在博客中介绍了这一消息，而当时正在Illumina工作的工程师Joshua Quick读到后深受触动。此前几年，他一直在尝试让Illumina的测序设备变得更小、更便宜，但MinION所展示的路线让他看到了另一种可能：一台极小型、运行过程中无需复杂额外试剂系统的测序设备，或许才是DNA测序真正走向便携化和现场化的未来。    然而，MinION引发轰动后不久，ONT便遭遇了一次严重的工程挫折。公司发现其微芯片设计存在重大缺陷，而这个问题最终花了近两年时间才得到解决。漫长的延期严重影响了外界对公司的信心，Brown后来回忆，当时甚至有人指责ONT只是在兜售既无实物又无科学依据的 "未来科技" 骗局。与此同时，ONT与Illumina之间的合作关系也逐渐破裂。2013年11月，Illumina正式终止与ONT的合作协议，并出售了所持ONT股份，当时价值约5640万美元。 对ONT来说，这无疑是公司发展早期的一次重大打击，也意味着MinION必须在失去这一重要产业合作伙伴后继续独立推进。但ONT并没有因此放弃MinION路线，相反，公司继续修复芯片、优化纳米孔体系和测序化学，为后来真正将MinION交到科研人员手中做准备。 十二、 纳米孔测序正式走向科研一线     尽管此前遭遇芯片设计问题和合作关系破裂，ONT并没有停止MinION的推进。2014年4月，公司正式启动MinION Access Programme（MAP），邀请全球研究人员提前试用这款设备，并探索它在不同研究场景中的实际应用。距离David Deamer在1989年画下最初的纳米孔测序原理草图，已经过去了整整25年。     与此前商业化的测序设备相比，MinION的形态几乎完全不同。它重量不到100克，可以直接拿在手中，具有体积小、便携、成本相对低和操作简单等特点。纳米孔测序也由此第一次真正从大型实验室设备，走向可以由普通研究人员随身携带和独立使用的平台。 MinION     MAP计划很快引发广泛关注。到2014年6月，已有超过3000名研究人员申请试用，其中约500人获准加入。参与者支付1000美元可退还押金，即可获得MinION以及配套的芯片 (flow cell)、建库试剂等，并可以自由开展实验和发表研究结果。     对ONT而言，这不仅是一次产品测试，更是一种开放式研发模式。公司希望通过全球用户的真实使用反馈不断改进MinION，而研究人员也开始尝试把这款设备用于微生物测序、病原体检测、基因组组装以及现场测序等不同场景。此后MinION的许多改进，也都与这一早期用户社区的反馈密切相关。 十三、 纳米孔测序走向更多场景     随着MinION逐步成熟，纳米孔测序开始从基因组研究工具扩展到更多应用场景。凭借便携、实时和长读长等特点，ONT平台陆续被用于人类、植物、动物、微生物和环境基因组研究，也进入食品安全和公共卫生等领域。其便携性甚至让测序技术走出了地面实验室——研究人员曾将MinION带上国际空间站，用于验证在微重力环境下直接开展DNA测序的可行性。     2019年底，COVID-19疫情的暴发，也为ONT重新进入诊断领域提供了一个契机，尽管公司的核心业务仍然是基因组测序。2020年，由于传统PCR检测一度面临试剂供应紧张，英国政府与ONT接洽，希望评估纳米孔技术能否用于新冠病毒的大规模检测。     同年5月，由Dan Turner领导的ONT团队开始尝试将纳米孔测序与环介导等温扩增 (loop-mediated isothermal amplification，LAMP) 相结合。与传统PCR相比，LAMP不依赖复杂的温度循环设备，反应体系相对简单、成本较低，而且能够在短时间内产生大量目标核酸扩增产物。更重要的是，它所依赖的部分试剂和供应链与常规PCR不同，在疫情期间具有一定的供应优势。ONT希望利用LAMP快速扩增病毒核酸，再通过纳米孔测序对大量样本进行并行读取和识别，从而建立一种兼具高通量、快速和可扩展性的检测体系。     ONT最终开发出的检测方案被命名为LamPORE。该方法通过LAMP扩增结合纳米孔测序，对SARS-CoV-2 RNA进行检测。其设计同时覆盖病毒基因组中三个相对保守的靶区域，并加入人源β-actin作为内部对照，用于判断样本采集和扩增过程是否正常，从而提高检测结果的可靠性。 LamPORE  simple workflow     早期一项包含500余份样本的研究显示，LamPORE检测SARS-CoV-2的灵敏度约为99.1%，特异度约为99.6%。随后，英国NHS实验室又在超过2.3万份鼻拭子和唾液样本中进行了更大规模评估，结果表明，该体系对于有症状和无症状感染者均具有较高的检测准确性。     在新冠疫情之外，ONT当时也希望进一步扩展LamPORE的应用范围，例如用于流感病毒和呼吸道合胞病毒（RSV）等其他呼吸道病毒的筛查。也就是说，LamPORE不仅是ONT在疫情期间的一次应急技术开发，也让公司重新看到了纳米孔平台进入临床和公共卫生诊断领域的可能性。     LamPORE的另一个重要优势，是具有较强的可扩展性和部署灵活性。它既可以在传统高通量实验室中运行，也可以借助ONT的小型化设备部署到基层或偏远地区。2021年1月，ONT协助在英国四个地区建立了移动式LamPORE检测单元，用于补充偏远地区的新冠病毒检测能力。根据当时的方案，LamPORE与桌面式GridION平台结合时，每天可处理约1.5万份样本；如果使用便携式MinION，每天也可完成约2000份样本的检测。     除了LamPORE，ONT也在不断拓展纳米孔平台的测序规模。其中一个重要方向就是PromethION。它采用与MinION相同的纳米孔测序原理，但通过更大规模的并行化设计，将长读长DNA测序、直接RNA测序等能力提升到更高通量。 PromethION Beta  PromethION P24 2019 PromethION于2018年前后通过早期使用计划逐步推出，主要面向人类全基因组和大规模基因组研究。相比便携式MinION，它更适合连续处理多个高数据量样本，也使纳米孔技术开始从 "小型、现场测序" 进一步进入高通量人类基因组研究领域。     这一能力对于遗传病、肿瘤和个体化医疗研究尤其重要。快速获得完整的人类基因组信息，不仅有助于发现结构变异和复杂基因组异常，也能够为疾病分型、治疗选择和大规模人群基因组研究提供新的技术手段。     2019年，UC Santa Cruz基因组研究所Benedict Paten等研究团队报道，利用一台PromethION在9天内完成了 11个人类基因组的纳米孔测序，进一步展示了这一平台在人类全基因组高通量测序方面的潜力。至此，ONT的产品体系也逐渐形成了两个互补方向：MinION代表便携化和现场测序，PromethION则代表高通量和规模化测序。 十四、 心得总结     回望纳米孔测序的发展历程，从David Deamer在1989年画下最初的概念草图，到John Kasianowicz证明核酸能够穿过蛋白孔并产生可检测的电流信号，再到Hagan Bayley对蛋白纳米孔的持续工程化，Mark Akeson等人对碱基识别和DNA运动控制的推进，以及后来ONT对膜、ASIC芯片、马达蛋白、Flow cell和Basecalling算法的不断完善，二十多年时间，才真正从一个大胆设想变成可以握在手中的测序仪。     而这一路的发展，也是迂回曲折中不断推进。外切酶测序思路曾被寄予厚望，最终却被放弃；早期MinION曾因芯片问题遭遇质疑；不同孔蛋白、马达蛋白以及不同测序策略也经历了反复筛选和迭代。但正是这些不断的试错，让纳米孔测序逐渐找到了自己的技术路线。     更值得注意的是，纳米孔测序从一开始就不是单一学科能够完成的技术。它把膜生物物理学、蛋白质工程、分子生物学、微电子学、材料科学和计算算法连接到了一起，也把学术界几十年的基础研究与企业长期的工程开发连接到了一起。理论研究证明 "它可以工作"，而真正让技术进入实验室、医院甚至野外现场的，是随后漫长而复杂的工程化过程。     今天，纳米孔测序已经可以读取超长DNA、直接测序RNA，并同时获得甲基化等碱基修饰信息；设备既可以小到放入口袋，也可以扩展到大规模人类基因组测序。从疫情现场到国际空间站，从微生物基因组到遗传病和肿瘤研究，它的应用边界仍在不断扩大。     或许这也是这段技术史最值得回味的地方：1989年俄勒冈森林公路旁的一次停车、一张用笔画下的草图，并没有立即改变世界。真正改变世界的，是此后三十多年里，一群来自不同领域的人不断把 "不可能" 拆成一个又一个可以解决的问题。 想了解更多纳米孔测序技术的发展，尤其是最近十年，包括国产纳米孔的测序技术的发展，可以参考阅读张天缘/刘永鑫的综述：Zhang, Tianyuan, Hanzhou Li, Mian Jiang, Huiyu Hou, Yunyun Gao, Yali Li, Fuhao Wang, Jun Wang, Kai Peng, and Yong-Xin Liu. "Nanopore sequencing: flourishing in its teenage years." Journal of Genetics and Genomics (2024), 51(12): 1361-137.     也请大家多支持我们国产纳米孔测序平台的发展：齐碳科技，普译生物，华大序风，今是科技....（排名不分先后) 后面也希望能出几期咱们国产纳米孔测序公司发展的历史故事。 参考文献: 1. From concept to commercializatin how UCSC researchers revolutionized DNA seuqencing：https://news.ucsc.edu/2022/08/nanopore-feature/ 2. Company history: https://nanoporetech.com/about/history 3. What is Biotechnology? Nanopore sequencing. https://www.whatisbiotechnology.org/index.php/science/summary/nanopore/nanopore-sequencing-makes-it-possible-to-decode-the 4. Deamer, D., Akeson, M., & Branton, D. (2016). Three decades of nanopore sequencing. Nature biotechnology, 34(5), 518-524. 5. Sketch to Concept: Unraveling the Invention of Nanopore Sequencing: https://www.goldengooseaward.org/01awardees/nanopores 6. Manrao, EA, Berrington, IM, Laslo, KW, Hopper, MW et al (2013) 'Reading DNA at single-nucleotide resolution with a mutant MspA nanopore and phi29 DNA polymerase', Nature Biotechnology. 7. Cherf, GM, KR Lieberman, KR, Rashid, H, Lam, CE, Karpus, K, Akeson, M (2014) 'Automated forward and reverse ratcheting of DNA in a nanopore at five angstrom precision', Nature Biotechnology.     本人理解和资料搜集难免有所疏漏，如有不妥之处欢迎大家批评、指正和评论！！部分图片和资料来源于网络公开资源，主要用于学习和记录，如无意间侵犯了版权，请第一时间联系我。 三代测序说   简书｜视频号 腾讯云开发者社区｜抖音 对三代测序感兴趣的老师同学不妨转发给更多需要的同胞，共同学习和进步是我更新的不竭动力，同时也欢迎大家留言讨论交流~！