LRP1

“Targeting uPAR with an antibody-drug conjugate suppresses tumor growth and reshapes the immune landscape in pancreatic cancer models” 发表于Science Advances，开发了一种新型抗尿激酶型纤溶酶原激活剂受体（uPAR）的抗体偶联药物（ADC）——FL1-PNU，并在胰腺癌模型中进行了临床前验证，为胰腺癌治疗提供了新的潜在方案 。胰腺癌治疗现状与研究背景：胰腺癌预后差，5 年生存率低于 10%。肿瘤间质会阻碍药物递送和免疫细胞浸润，导致对化疗和免疫疗法耐药。ADC 在多种实体瘤治疗中展现潜力，但在胰腺癌治疗方面尚未成功，且针对胰腺癌的 ADC 靶点研究较少。FL1是通过用重组可溶性人uPAR（huPAR）免疫uPAR缺陷小鼠产生的，并发现其能以高亲和力结合人和小鼠uPAR（muPAR）。               因为内吞是非常重要的筛选抗体的方法，文中用多种方法做了内吞验证，首先通过流式细胞术评估了这些mAbs的内吞效率，挑选出最高的内化能力的FL1单抗；    流式细胞术方法通过共聚焦免疫荧光显微镜（confocal）也证实了FL1的细胞摄取。作为阳性对照，高表达uPAR的三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞，每细胞有1.3×106个受体和阴性对照；两个通过CRISPR RNA引导的Fokl核酸酶介导的基因编辑从亲本KPC细胞衍生的uPAR敲除（KO）KPC细胞系（KPC1KO和KPC2KO），每个细胞表面值检测到四五百个受体。    为了研究这些细胞中FL1的内化特性，采用了多种方法。在两对匹配的KPC和KPC uPARKO细胞系中进行了定性免疫荧光染色，随后进行共聚焦显微镜检查。在37°C下与A647标记的FL1孵育4小时后，两种亲本KPC细胞系的细胞质中出现了明显的红色细胞内斑点，表明抗体被摄取并暗示其被运输至溶酶体，这与U937细胞中的发现一致。膜结合的荧光显示KPC2细胞表面有残留的未内化的FL1。通过在添加FL1之前用溶酶体蛋白酶抑制剂E64d预孵育细胞来确认FL1的溶酶体运输。E64d通过溶酶体硫醇蛋白酶阻碍抗体清除，导致积累。相应地，两种KPC细胞系中观察到了更明显的斑点信号。在所有测试条件下，相应的uPARKO细胞中均未检测到荧光。    这项研究包括了五种细胞系，根据它们的uPAR表达水平，这些细胞系被分类为高（MDA-MB-231、KPC1和AsPC-1）、低（MIA PaCa-2）或不表达（KPC1 uPARKO）。使用Incucyte活细胞分析系统和与pH敏感的红色标签（Incucyte Red Fabfluor-pH染料）耦联的FL1，实时监测内化。这能够可视化并测量单克隆抗体进入酸性早期内体和溶酶体的运输。在20小时孵育期间检测到的红色荧光强度的时间过程分析。    uPAR介导的FL1内化的机制：第一个涉及一种依赖网格蛋白的内吞途径，该途径在与LRP1（低密度脂蛋白受体相关蛋白1）结合后，介导uPAR•uPA•PAI-1复合物的清除；第二个机制是一种不依赖配体和LRP1的大吞噬体样过程，调节uPAR的组成性内吞和循环。FL1-PNU在PDAC细胞系中表现出强大且依赖于uPAR的细胞毒性为了成功靶向像PDAC这样的治疗抵抗性恶性肿瘤，需要强大的细胞毒性冲击。选择了PNU-159682作为抗uPAR ADC的细胞毒性载荷。采用化学酶促糖基共轭方法（GlyClick，来自Genovis）,DAR2.0实验显示，FL1-PNU具有明显的剂量依赖性细胞毒性，效率在皮摩尔级别。FL1-PNU和NC ADC（aTNP-PNU）相比具有很明显的靶向性。为了验证FL1-PNU内化和溶酶体处理的机制，在LRP1和溶酶体蛋白酶抑制剂存在的情况下进行了细胞活性实验。如图所示，预先用E64d（溶酶体蛋白酶抑制剂）处理消除了FL1-PNU对靶细胞的抗肿瘤效果。相比之下，RAP的存在并没有减轻毒性。这些结果表明，FL1-PNU像其母体单克隆抗体一样，独立于LRP1进入溶酶体，并且需要可切割连接子的活性溶酶体处理来释放其细胞毒性。    FL1-PNU在体外诱导旁观者细胞毒性使用了双室Transwell培养皿，将uPAR阳性的成纤维细胞接种在上层通透性插件中，将uPARKO KPC2癌细胞接种在下层孔中。FL1-PNU在不同PDAC小鼠模型中诱导肿瘤消退在PDAC的异种移植和同种异体移植小鼠模型中评估了ADC的治疗效果，利用FL1对huPAR和muPAR的跨物种反应性。免疫缺陷的Balb/c裸鼠皮下移植了人类AsPC1细胞。在第二次剂量后，所有接受FL1-PNU治疗的小鼠（n=12）都显示出显著的肿瘤消退，11只动物在第20天第三次剂量后实现了完全的肿瘤根除）。    FL1-PNU治疗后肿瘤中uPAR表达得以保留从异种移植和原位移植模型中切除的肿瘤经过苏木精-伊红（H&E）染色和免疫组化（IHC）检测。正如预期的那样，与两个对照组相比，接受FL1-PNU治疗的肿瘤中存活细胞数量显著减少，这从它们较小的肿瘤尺寸中得以体现。在那些被治愈的小鼠的异种移植切除组织中，我们没有检测到任何癌细胞，这些组织主要由残留的类似瘢痕的组织构成，从而证实了组织学上的缓解。然而，对少数复发肿瘤部位的切除结果显示，癌细胞以及小鼠源性肿瘤激活的间质（特别是成纤维细胞）中uPAR表达明显。这与另外两个治疗组观察到的模式无法区分。对原位KPC2同种异体移植瘤的染色显示，经过FL1-PNU治疗后的部分消退后，剩余的肿瘤同样存在持续的癌细胞和间质uPAR表达。总之，这些发现表明，FL1-PNU治疗后的复发以及部分消退，是由于未能完全清除uPAR阳性细胞，而不是由于靶标Ag表达的缺失或下调导致的获得性耐药）。    FL1-PNU通过促进免疫调节重塑抑制性肿瘤微环境（TME）    大量的体内证据表明，某些抗体药物偶联物（ADC）可以通过激活抗肿瘤免疫来增强免疫疗法（ITs）的疗效，例如免疫检查点抑制剂（ICIs），通过诱导肿瘤浸润性淋巴细胞。这种效应似乎是由载荷诱导免疫原性细胞死亡的能力介导的。鉴于显著的致密间质是PDAC免疫原性差和对ITs抵抗的公认驱动因素，。通过IHC CD3染色定性和评估了T淋巴细胞在肿瘤中的存在和分布。观察到，在FL1-PNU治疗的肿瘤中，T细胞在间质和癌细胞区域都有显著浸润，这与对照组中典型的稀疏浸润形成对比。为了进一步证实这一发现，并解读ADC对免疫景观的总体影响，在更大的样本量上进行了免疫表型分析，重点关注主要的淋巴系和髓系谱系标记物。令人惊讶的是，这一分析显示，在FL1-PNU治疗的样本中，T细胞和B细胞显著增加，而在磷酸盐缓冲液（PBS）组中这些细胞几乎不存在。这一结果表明，FL1-PNU促进了适应性细胞免疫。    当观察髓系（CD11b+）细胞群时，我们注意到这一群体在对照样本中几乎占免疫细胞的90%，而在FL1-PNU组中几乎减少了一半。同样地发现Ly6G+/Ly6Clo/int细胞（即中性粒细胞/多形核髓系来源的抑制细胞，PMN-MDSC）的数量也有所减少，这些细胞在对照组的髓系细胞群中占主导地位。此外，Ly6Chi细胞（识别具有经典炎症表型的单核细胞或巨噬细胞，iMono/Mø）在对照组肿瘤中缺失，而在ADC治疗组中显著增加。这些发现表明，FL1-PNU的强效抗肿瘤活性有助于通过促进适应性和先天免疫细胞的浸润以及减少髓系抑制细胞来重塑免疫抑制性TME。文章的结论           1.uPAR作为ADC治疗靶点的潜力：本研究首次在临床前验证了uPAR作为胰腺导管腺癌（PDAC）抗体-药物偶联物（ADC）治疗的潜在靶点。新开发的抗uPAR ADC（FL1-PNU）在多种PDAC模型中表现出强大且特异性的抗肿瘤反应，包括皮下异种移植和原位同种移植模型，且具有可接受的安全性。   2.FL1-PNU的抗肿瘤效果：FL1-PNU在体外和体内均显示出显著的抗肿瘤活性，能够诱导肿瘤消退并延长生存期。在免疫活性小鼠模型中，FL1-PNU还能重塑肿瘤微环境（TME），增强免疫效应细胞的浸润并减少免疫抑制细胞。3.免疫调节作用：FL1-PNU通过促进淋巴细胞和炎症细胞的浸润，同时减少抑制性髓系细胞，显示出免疫调节作用。这表明FL1-PNU可能通过诱导免疫原性细胞死亡来增强抗肿瘤免疫反应。          4.未来研究方向：研究结果表明，FL1-PNU作为一种uPAR靶向的ADC，具有进一步临床转化的潜力，无论是作为单一疗法还是与其他免疫疗法（如免疫检查点抑制剂）联合使用。未来的研究应进一步探索FL1-PNU在uPAR阴性或异质性表达的肿瘤模型中的疗效，并评估其与免疫疗法的协同作用。        5.诊断和治疗监测：现有的临床阶段uPAR成像剂可用于非侵入性评估uPAR表达，为患者筛选和治疗监测提供可靠的诊断工具，从而为PDAC及其他uPAR阳性癌症的精准医学奠定基础。          总之，FL1-PNU在PDAC治疗中显示出显著的抗肿瘤和免疫调节作用，具有进一步临床开发的潜力。但是个人认为选择的毒素PNU-159682也许不是最佳选择，因为毒性太大了，在药效试验中也有老鼠死亡的现象发生。    推文用于传递知识，如因版权等有疑问，请于本文刊发30日内联系医药速览。原创内容未经授权，禁止转载至其他平台。有问题可发邮件至yong_wang@pku.edu.cn获取更多信息。©2021 医药速览 保留所有权利往期链接“小小疫苗”养成记 | 医药公司管线盘点 人人学懂免疫学| 人人学懂免疫学（语音版）综述文章解读 | 文献略读 | 医学科普|医药前沿笔记PROTAC技术| 抗体药物| 抗体药物偶联-ADC核酸疫苗 | CAR技术| 化学生物学温馨提示医药速览公众号目前已经有近12个交流群（好学，有趣且奔波于医药圈人才聚集于此）。进群加作者微信（yiyaoxueshu666）或者扫描公众号二维码添加作者，备注“姓名/昵称-企业/高校-具体研究领域/专业”，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。简单操作即可星标⭐️医药速览，第一时间收到我们的推送①点击标题下方“医药速览”  ②至右上角“...”  ③点击“设为星标

一项新的研究表明：携带PCSK9 V474I变体的患者在15年内面临22%的转移风险，而没有这种变体的患者只有2%的风险。 90%的癌症死亡是由于癌症的扩散，而不是原发肿瘤的并发症。因此，50多年来，科学家们一直在寻找肿瘤内哪些恶性突变允许流氓细胞脱离原发肿瘤，并通过血液和淋巴系统转移到全身。 但是，一项新的研究表明，另一种机制被忽视了——驱动转移的难以捉摸的突变可能不是在肿瘤本身扭曲的DNA中发生的，而是在患者的正常遗传DNA中发生的。这一发现首次证明了乳腺癌转移的遗传易感性，具有深远的临床意义，有可能提供一种潜在的预防方法。 相关研究结果于2024年12月9日在线发表在Cell期刊上，论文标题为“A commonly inherited human PCSK9 germline variant drives breast cancer metastasis via LRP1 receptor”。 论文通讯作者、洛克菲勒大学的Sohail Tavazoie教授说，“我们认为转移至少在一定程度上是一种遗传性疾病。我们如此专注于癌细胞，即‘种子（seeds）’，以至于忽略了生殖系（germline）——‘土壤（soil）’。如今很明显，关注土壤是至关重要的。” 问题的根源 尽管科学家们几十年来一直在严格研究转移，但是对转移性肿瘤的广泛基因组测序却一无所获。患者肿瘤充满了突变基因，但没有一个被证明能特异性地驱动转移。Tavazoie说，“因此，我们假设可能是宿主自身的遗传，而不是肿瘤，提供了这些突变。” 事实上，Tavazoie及其同事之前已证实，APOE的多种生殖系等位基因可以增强或抑制黑色素瘤的转移。为了查明乳腺癌转移是否以类似的方式进行，Tavazoie实验室对来自多个国家的大量患者群体进行了人类遗传学研究。 PCSK9基因的一种常见变体（V474I）立即引起了他们的注意。在70%的白人女性生殖系中，这种变体与乳腺癌症生存率降低有关。当Tavazoie及其团队对小鼠进行基因改造使之携带人类PCSK9的相关变体形式时，它们的乳腺癌转移率增加了。 瑞典隆德大学的同事们通过对斯堪的纳维亚早期乳腺癌患者的大量队列分析进一步验证了这些结果。他们的发现很明显：携带PCSK9 V474I变体的患者在15年内面临22%的转移风险，而没有这种变体的患者只有2%的风险。 论文第一作者、Tavazoie实验室的研究生Wenbin Mei说，“我们的研究结果强调了涉及来自多个国家的研究人员和患者群体的国际合作的重要性。此外，这表明人类遗传学已经变得多么强大。有了将计算分析与实验模型相结合的新技术，我们正处于一个回答难题的伟大时代。” 深入挖掘 这项新的研究还揭示了PCSK9 V474I变体如何驱动转移。通过降解癌细胞表面上的LRP1受体，这种变体似乎引发了一系列适合于转移起始的基因激活。有趣的是，Tavazoie实验室之前对黑色素瘤的研究已发现，促进或抑制转移的APOE等位基因也作用于LRP1。Tavazoie说，“值得注意的是，在两种不同的癌症中，转移机制都集中在这一受体上。”该实验室未来的研究工作将集中于LRP1在转移中发挥的潜在一致的作用。 尽管如今有证据表明这种PCSK9变体与转移性疾病有关，但Tavazoie澄清说，携带这种变体的患者不应感到恐慌。他们的数据表明，携带这种变体的患者有22%的转移风险，而没有这种变体的风险为2%。他说，“大多数携带任何一种PCSK9变体的早期乳腺癌患者仍然不会发生转移。” 但是，他如今对减少22%不幸人群的转移性疾病的可能性持乐观态度。这项研究还表明PCSK9可以用一种阻断PCSK9活性的抗体来抑制，该抗体已经批准用于治疗高胆固醇。 Tavazoie说，“这是一种安全且耐受性良好的药物。”他同时提醒说，临床试验对于证明它在癌症中的疗效是必要的。“我们希望有一天，携带这种变体的高危患者能够得到积极治疗，通过靶向引发这一结果的特定信号来减少转移的机会。”（生物谷 Bioon.com） 参考资料： Wenbin Mei et al. A commonly inherited human PCSK9 germline variant drives breast cancer metastasis via LRP1 receptor. Cell, 2024, doi:10.1016/j.cell.2024.11.009.

▎药明康德内容团队编辑 癌症导致的死亡中有90%归因于癌症的转移，而不是原发肿瘤。因此，科学家一直致力于识别肿瘤中哪些恶性突变使癌细胞能够脱离原发肿瘤，通过血液和淋巴系统传播并扩散到全身。然而，新的研究表明，驱动癌症转移的关键突变或许并非来源于肿瘤本身的DNA，而是存在于患者正常细胞的DNA中。这项发表在《细胞》杂志上的研究提供了遗传易感性与乳腺癌转移之间的证据，并揭示了潜在的预防性疗法。 在这项研究中，洛克菲勒大学（The Rockefeller University）的科学家领衔的国际团队通过对来自多个国家的大型癌症患者队列的遗传数据的分析，发现PCSK9基因的一种常见变体与乳腺癌患者生存率降低相关。当研究团队对小鼠进行基因工程改造以携带人类PCSK9的相关变体形式时，乳腺癌转移率显著增加。而且，对早期乳腺癌患者大型队列的分析验证了这一结果。携带PCSK9变体的患者在15年内的癌症转移风险高达22%，而未携带该变体的患者转移风险仅为2%，前者风险是后者10倍以上。 进一步研究揭示了PCSK9变体如何驱动癌细胞转移的机制。通过降解癌细胞上的LRP1受体，该变体触发了适合转移启动的一系列基因的激活，包括XAF1和USP18。 ▲这项研究的图片摘要（图片来源：参考资料[1]） 值得一提的是，研究人员同时发现了潜在预防性治疗方法。他们的初步研究表明，已批准用于治疗高胆固醇的抗PCSK9抗体可以抑制PCSK9活性，从而降低肿瘤转移的风险。“这是一种安全且耐受性良好的药物，”论文的通讯作者，洛克菲勒大学的Sohail Tavazoie教授说，“我们的希望是，有一天高风险的患者可以通过这种方法进行预防性治疗，降低癌症转移的几率。”研究人员也同时表示，抗PCSK9抗体能否预防乳腺癌的转移仍然需要临床试验进行验证。 ▲欲了解更多前沿技术在生物医药产业中的应用，请长按扫描上方二维码，即可访问“药明直播间”，观看相关话题的直播讨论与精彩回放 参考资料： [1] Mei et al., (2024). A commonly inherited human PCSK9 germline variant drives breast cancer metastasis via LRP1 receptor. Cell, DOI: 10.1016/j.cell.2024.11.009 [2] Researchers discover a genetic predisposition increasing the risk of breast cancer metastasis. Retrieved December 12, 2024, from https://www.rockefeller.edu/news/36964-researchers-discover-a-genetic-disposition-increasing-the-risk-of-breast-cancer-metastasis/ 免责声明：药明康德内容团队专注介绍全球生物医药健康研究进展。本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表药明康德立场，亦不代表药明康德支持或反对文中观点。本文也不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。 版权说明：本文来自药明康德内容团队，欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。转载授权请在「药明康德」微信公众号回复“转载”，获取转载须知。 分享，点赞，在看，聚焦全球生物医药健康创新