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点击蓝字 关注我们 肝癌是全球第6位较常见的恶性肿瘤，也是导致人类死亡的第3位恶性肿瘤死因1。2022年登上Science的一项研究2首次在人类中发现KIR+CD8+ T细胞抑制致病性T细胞，为癌症靶向治疗提供了思路。 2025年2月10日，西湖大学/上海市免疫治疗创新研究院董晨院士、中国解放军总医院卢实春教授、深圳湾实验室张雷研究员联袂开展科研合作，在Cancer Cell杂志在线发表了题为“Contrasting cytotoxic and regulatory T cell responses underlying distinct clinical outcomes to anti-PD-1 plus lenvati-nib therapy in cancer”的研究论文3（IF=48.8），揭示了在接受抗PD-1联合仑伐替尼治疗的癌症患者中与临床预后相关的T细胞应答及耐药机制。该杂志还同期刊发了题为“Circulating T cells fuel anti-PD-1 and lenvatinib efficacy“的相关专家评论4。 免疫检查点阻断（ICB）疗法，尤其是靶向CD8+ T细胞上表达的程序性细胞死亡受体1（PD-1），是多种癌症的高效免疫疗法。然而，大多数患者未能从中获益。在抗PD-1单药疗法无效的癌症患者中，与其他疗法联合使用可能会改善疗效。值得注意的是，在肝细胞癌（HCC）和胆道癌等癌症中，将ICB与抗血管生成疗法相结合可提高疗效。抗PD-1联合仑伐替尼（一种靶向血管内皮生长因子[VEGF]受体的多靶点酪氨酸激酶抑制剂）可将HCC患者的缓解率从抗PD-1单药的17%升至45%。尽管如此，这种疗效和耐药性背后的免疫学机制仍然难以捉摸，限制了其进一步发展。 将ICB和联合疗法作为新辅助治疗，为通过时间序列样本观察肿瘤微环境（TME）中免疫细胞动态提供了契机。CD8+ T细胞作为PD-1阻断的主要靶点，在多种癌症类型中展现出良好应答特征，包括局部克隆扩增和循环T细胞募集。在HCC患者中，治疗前肿瘤内CD8+ T细胞的存在与HCC患者对ICB及抗PD-1联合仑伐替尼治疗的应答相关。然而在TME中，抗原持续暴露会导致T细胞耗竭，表现为效应功能逐步丧失。单细胞测序技术已在多种癌症中鉴定出具有不同耗竭程度的CD8+ T细胞亚群，包括终末耗竭T（tTex）细胞、TCF7+祖细胞样耗竭T（Tpex）细胞、GZMK+效应/效应记忆T（Teff/Tem）细胞以及CXCL13+ Tpex细胞等。这些亚群对抗PD-(L)1治疗呈现差异化应答，其中TCF7+ Tpex细胞在小鼠肿瘤模型和多种癌症中被证实对ICB应答至关重要，但在TCF7+ Tpex细胞丰度较低的癌症中（如HCC），仍需进一步探索T细胞应答机制。 尽管在多种癌症中已鉴定出可识别肿瘤相关抗原的T细胞，但在ICB治疗过程中追踪其动态变化仍具挑战。乙型肝炎病毒（HBV）作为病毒性肝癌的主要诱因，其基因组可整合至肝细胞，这使得HBV+肝癌肿瘤中的HBV特异性T细胞成为研究肿瘤特异性T细胞的理想模型。虽然已在HBV+ HCC肿瘤中发现细胞毒性HBV特异性T细胞，但其是否可被ICB激活尚不清楚。 调节性T（Treg）细胞能维持免疫稳态并预防自身免疫。CD4+ Treg细胞可抑制参与肿瘤控制的免疫细胞，与免疫治疗的耐药性相关。Treg细胞浸润在多种癌症中被广泛报道，且在接受抗PD-(L)1及其联合治疗的无应答患者中观察到Treg细胞积累。小鼠模型表明，清除Treg细胞可增强抗肿瘤免疫并与ICB产生协同效应，靶向其抑制功能可改善抗PD-1治疗效果。然而，ICB治疗过程中Treg细胞在不同癌症中的积累机制仍需深入研究。 近期研究发现，在自身免疫性疾病和感染患者中存在KIR+CD8+ Treg细胞亚群。这类细胞以表达抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIRs）为特征，可抑制致病性CD4+ T细胞。尽管在癌症患者外周血中也检测到高表达KIRs的CD8+ T细胞，但其在TME中的特征谱系、起源、分化及对ICB治疗的应答仍亟待阐明。 本研究为解析免疫治疗应答与耐药机制，对接受新辅助抗PD-1联合仑伐替尼治疗的HBV+ HCC患者进行T细胞动态分析，并采用HBV-Dextramer-barcode单细胞测序技术对HBV特异性CD8+ T细胞进行深度表征。通过系统比较接受联合治疗或抗PD-1单药治疗的HCC患者T细胞特征，鉴定了与联合治疗应答和耐药相关的特异性T细胞亚群。 CD8+T细胞在抗PD-1联合仑伐替尼治疗肝癌过程中的作用机制 研究发现，肿瘤浸润的GZMK+CD8+ Teff/Tem细胞对联合治疗呈现良好应答，该细胞群包括Tpex细胞以及此前未被充分认识的富集HBV特异性循环效应记忆T（cTem）细胞。进一步的整合分析表明，cTem细胞与联合治疗的应答特异性相关，而Tpex细胞则对联合治疗和抗PD-1单药治疗均有帮助。值得注意的是，KIR+CD8+ T细胞亚群和FOXP3+ CD4+调节性T细胞在联合治疗后的无应答者中特异性富集。 本研究阐明了与癌症免疫治疗中临床获益和耐药相关的T细胞亚群，发现一群富集HBV特异性的cTem细胞在联合治疗后的浸润是其相比于抗PD-1单药疗效提升的关键因素。此外，本研究发现的cTem细胞很可能广泛存在于不同癌症中。本研究刻画了KIR+CD8+ T细胞在TME中的特征，首次揭示了其与免疫治疗耐药的相关性，暗示了这群细胞在TME中发挥免疫抑制功能。这些发现加深了我们对免疫应答和耐药机制的理解，鉴定了一系列具有极大前景的潜在治疗性靶点和生物学标志物，为体外扩增肿瘤特异性T细胞贡献了新方法，更为后续开发新的靶向疗法、过继细胞疗法及其他联合疗法提供了宝贵的思路。 声明：本文由“肿瘤界”整理与汇编，欢迎分享转载，如需使用本文内容，请务必注明出处。 参考文献： 1. 缪伟刚, 周金意, 韩仁强. 全球肝癌流行数据解析 [J] . 中华流行病学杂志, 2024, 45(6) : 865-869.  2. Li J, et al. KIR+CD8+ T cells suppress pathogenic T cells and are active in autoimmune diseases and COVID-19. Science. 2022 Apr 15;376(6590):eabi9591. 3. Guo X, et al. Contrasting cytotoxic and regulatory T cell responses underlying distinct clinical outcomes to anti-PD-1 plus lenvatinib therapy in cancer. Cancer Cell. 2025 Feb 10;43(2):248-268.e9. 4. Matulich PJ,  et al. Circulating T cells fuel anti-PD-1 and lenvatinib efficacy. Cancer Cell. 2025 Feb 10;43(2):173-175.  编辑：lagertha 审核：松月

许多游离药物具有溶解度低、稳定相差和安全性低在内的诸多特点而限制了其临床应用，纳米技术的进步为使用纳米颗粒进行药物递送创造了无限可能。FDA已经批准了约100种纳米药物上市，通常用作药物输送系统的纳米颗粒有包括脂质体在内的多种体系，它们的粒径范围从几纳米到几百纳米不等。它们通过装载药物使之提高稳定性，克服组织细胞的摄取阻碍，增加药物在体内靶位的富集，提高了药物的安全性与治疗效果。 图1：通常用作药物输送系统的纳米颗粒。a 脂质体b 病毒载体c 自组装蛋白d 聚合物纳米颗粒e 金属纳米颗粒f 单壁碳纳米。g树枝状聚合物h 具有核/壳结构的聚苯乙烯涂层磁性颗粒i胶束制剂 在Pubmed上以“纳米”、“脂质体”、“药物”为相关关键词来搜索相关研究，纳米相关药物的发文量在2016年后超过脂质体且较为迅速增长，脂质体相关研究中的药物研究占了很大比重，相关发文量都呈现增长模式，预计在不久后会有更多的实验室产品走到工厂或是市场，为各种疾病带来新的治疗机会。 图2：以纳米、脂质体和药物相关关键词搜索近10年出现的文章数 脂质体纳米平台应用包括生物医学诊断和生物化学中的信号载体、疫苗佐剂和纳米医学中的递送载体等一系列领域。1995年FDA批准Johnson的包载有盐酸阿霉素脂质体抗肿瘤药物Doxil上市，目前美国食品药品监督管理局（FDA）批准了多款脂质体药物上市，适应症也从单一的肿瘤领域拓展到了感染、炎症和镇痛一系列领域。 表1：FDA批准上市的脂质体药物 表2：新型脂质体（LNP）上市核酸药物/疫苗 图3：脂质体/脂质纳米颗粒（LNP，一种新型脂质体）发展时间轴 脂质体最早由Bengham在1960年代发现，后来成为最广泛的药物输送系统之一。脂质体是由磷脂和胆固醇组成的球形结构，脂类有天然与人工合成两类，磷脂结构可以带有电荷以便控制其吸收排布。脂质体表面可以带有电荷，由于电荷排斥可以起到稳定脂质体的作用，负电荷的存在（如DMPG）使得脂质体容易被巨噬细胞识别并且能够通过内吞作用进入细胞（速率比中性脂质更快），从而缩短循环时间，而带正电荷的脂质体可能与血液中的阴离子成分（如血浆蛋白）相互作用，被MPS摄取清除。事实上，带正电荷脂质体与带负电的核酸作用而有利于核酸的递送，目前两款新型脂质体技术包载的核酸疫苗（两种阳离子脂质为：SM-102/ALC-0315）便是利用了这个原理而使脂质体在抗击新冠疫情中大放异彩。胆固醇控制磷脂堆积、膜流动性和脂质体表面电荷的能力，脂质体中胆固醇的添加使脂质体在血流中的稳定时间从几分钟延长到了几小时。脂质体也可由单个或多个脂质双分子层组装而成，目前FDA批准上市产品大都为100nm左右大小的单层小囊泡。添加聚合物如聚乙二醇则有延长的其循环的特性（增加脂质体与血液中其他成分的空间位阻），保护负载药物免受灭活或代谢降解，进一步增强稳定性并改善细胞内摄入。脂质体成分中特定靶向成分的添加或进行功能化（使用多糖、糖蛋白或特定受体的配体）来达到靶向的作用（被动靶向主要应用于肿瘤的治疗，依靠于肿瘤血管特性来实现，而主动靶向主要是通过脂质表面的功能化来达到目的）。脂质体产品结构比较复杂，环境或结构的变化可能对脂质体而言是引起其安全性和有效性的挑战，脂质体药物的辅料中一般会添加一些其他成分，如pH缓冲用的柠檬酸/柠檬酸盐体系、渗透压调节用的氯化钠体系、稳定用的糖类。 图4：载药脂质体的常见结构以及组分化合物结构示意图 目前对于脂质体的制备已经有了许多的技术方法：薄膜水合法、乙醇/乙醚注射法、反相蒸发法、洗涤剂去除法、微流控法、膜挤出法、均质化、超声法、冷冻干燥方法、超临界流体方法等。对于制备完成的脂质体特征（粒径、电位、形态、相位和层状性）的评价则有许多种技术。 表3：脂质体参数评估的方法 特征 技术 粒径 显微镜、纳米颗粒跟踪分析（NTA）、动态光散射（DLS）、扫描/透射电镜（SEM/TEM）、原子力显微镜（AFM）、低温透射电镜（Cryo-TEM） 电位 电泳迁移率、DLS 形态 Cryo-TEM、TEM、AFM 相位特性 差示扫描量热法 （DSC）、X射线衍射 （XRD）、热重分析 （TGA） 层状性 Cryo-TEM 、核磁 脂质体的粒径大小影响着药物吸收与分布（体循环、清除、外渗、转运摄取等），理想的粒径在50-200nm范围之内。脂质体所带的净电荷为Zeta电位，电位的大小的绝对值影响着脂质体的稳定性。脂质体电位收到外部环境和离子强度的影响，绝对值较小的脂质体之间排斥力较弱，随时间的推移聚集的可能性较大。显微镜检测是对于脂质体形态检测最直接的方式，其中Cryo-TEM技术检测可以较好的保留脂质体的原始结构，最大限度减小脂质体形态的扭曲变化；AFM技术是一种快速、强大和非侵入性的技术，在脂质体原生条件下提供到高分辨率三维图像。脂质体相行为影响着脂质体的稳定性，DSC是脂质体相行为检测最常见方法。脂质体的层状性影响着药物的释放，Cryo-TEM是最常用的方法，它提供了关于脂质体层状双层厚度和双层的距离等信息。当然，每种技术有自己的优缺点，多种方法联合使用才能从多角度将脂质体的性质进行更加全面的表征。 脂质体的疏水外壳包裹着亲水内核，亲水性药物一般包裹在亲水内核中，而疏水药物则包裹在疏水外壳中，目前已经开发出了脂质体的主动载药法（一般发生在脂质体制备完成后阶段）（如Doxil、Marqibo、DaunoXome和Onivyde）和被动载药法（一般发生在脂质体制备过程阶段）（如AmBisome、Visudyne、Arikayce、DepoCyte、DepoDur和Expel）。Vyxeos则采用了组合方式载药（阿糖胞苷和柔红霉素）。目前还有第三种脂质体载药技术---化学偶联技术，具有合适的化学官能团将药物与脂质体连接来控制药物的负载与释放。 图5：脂质体的药物装载 我们在临床试验资料库（https://clinicaltrials.gov/）上以“脂质体”（liposome）为关键词进行所搜来汇总目前脂质体相关研究的临床情况，2019年后的疫情几年完成的临床数呈下降趋势。我们发现2020年后（近3年）有35项实验已经完成，其中有4项附有研究结果。 图6：以“脂质体”（liposome）关键词搜索近10年临床情况 表4：临床研究部分信息 脂质体的临床研究主要方向是装载药物来对各种疾病进行治疗，研究1的试验调查了伊立替康脂质体和贝伐珠单抗在治疗对铂类治疗（铂类耐药）、复发（复发）或对治疗无反应（难治性）的卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌患者中的作用。研究2的目的是确定脂质体布比卡因与盐水在腰椎手术中减少阿片类药物使用的功效，并确定患者报告的结果和住院时间是否存在差异。研究3评估 Exparel、Exparel与盐酸布比卡因混合与盐酸布比卡因联合治疗下肢手术受试者术后镇痛的疗效、安全性和药代动力学。研究4探索Exparel（脂质体布比卡因）在内收肌管阻滞中的有效性（用于全膝关节置换术手术疼痛控制）。通过脂质体改善靶向部位的递送、提高疗效和降低的全身毒性，这是大多数进入临床试验脂质体新药的典型目标。 脂质体的出现，以其独特的性质而是许多药物为治疗疾病成为了可能，但是脂质体的组成（成分/纯度）、理化性质、稳定性、表征技术和一系列的临床药学研究（药代/药动/利用度等）仍有许多问题待解决，相信不久的将来在新方法的研究以及新技术的引入会刺激脂质体研究的进一步发展。 REFERENCE 1.     Beltrán-Gracia E et al., Cancer Nano. 2019 2.     Almeida B et al., Molecules. 2020 3.     Gote V et al., Int J Mol Sci. 2023 4.     Tenchov R et al., ACS Nano. 2021 药事纵横征稿启事

引言 CD8+T细胞是抵御感染性疾病和肿瘤的免疫系统关键介质。在遭遇抗原后，T细胞激活并浸润到感染部位。在感染灶处，T细胞实现抵御病原体功能，并产生持久的异质记忆T细胞亚群。尽管一些记忆T细胞 (包括中枢记忆和效应记忆性T细胞，也就是Tcm和Tem，统称Tcirc) 在血液和淋巴系统中循环，但其他记忆T细胞则永久驻留在外周组织和器官中。在不同物种的所有器官中，均发现这些不会进行迁移的组织驻留记忆T (tissue-resident memory T，简称TRM) 细胞【1,2】。 组织微环境、细胞因子暴露、抗原持久性和T细胞受体(TCR)信号强度变化等因素，促使T细胞处于不同效应阶段，最终演化成异质性CD8+T细胞亚群【3-7】。其中一些记忆性CD8+T细胞群表现出不同的干细胞样特性和功能，并提供不同程度的免疫保护。在某些情况下，如慢性感染或肿瘤病灶处，与稳健的记忆T细胞群相比，持续抗原识别诱导的T细胞活化，最终导致其演化为耗竭T细胞 (exhausted T，简称TEX)，表现出功能弱化和抑制受体表达增加。高通量测序技术的引入和迭代，也大幅提升了学界对T细胞演化和异质性相关的转录和表观遗传变化的理解。 通过Tcirc细胞发育过程中DNA甲基化和染色质可及性的动态全基因组测序和分析，证明小鼠和人类中效应T细胞和记忆T细胞命运决定因素的复杂网络。而通过单细胞表观基因组分析，确定了在不同的细胞亚群中，顺式和反式调控元件的变化与基因表达调控息息相关，从而可以实现重塑细胞分化相关轨迹。尽管已经明确Tcirc、TRM和TEX细胞存在异质性，并且这类异质性是由转录谱差异所决定的，但是，不同组织中CD8+T细胞的表观遗传谱变化，仍没有详细研究过。 近日，来自美国斯坦福大学的Ansuman T. Satpathy和澳大利亚墨尔本大学Laura K. Mackay研究组合作在Immunity上发表题为Distinct epigenomic landscapes underlie tissue-specific memory T cell differentiation的文章，通过分析来自多个器官的T细胞的染色质可及性变化和基因表达谱演化，揭示了记忆性CD8+T细胞的表观遗传状态，并鉴定了参与T细胞分化的器官特异性调节因子。 记忆性CD8+T细胞库中包含多种具有表型和转录异质性的亚群，它们承载特异的功能和再循环模式。作者在四种不同感染模型中，分离出七种非淋巴器官中的CD8+T细胞，并进行表观遗传谱分析。在急性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒 (acute lymphocytic choriomeningitis virus，简称LCMV) 感染过程中，作者观察到肝脏中TRM和Tcirc前体的早期表观遗传分化，并展示出不同的发育轨迹。这种效应细胞命运的早期转移以Fcgr2b可及性和FcgRIIB表达差异为标志，它们可以提升记忆性T细胞前体选择性产生肝脏TRM或Tcirc亚群的能力。 尽管TRM细胞在表观遗传谱上与Tcirc不同，但对从不同器官分离的TRM细胞，利用单细胞转座酶可及染色质可及性测序分析发现，TRM和Tcirc细胞沿着不同的表观遗传轨迹发育。而且，转录因子可以以器官特异性的方式调节TRM细胞的形成。作者还确定了TRM细胞发育的器官特异性转录调控因子，包括FOSB、FOS、FOSL1和BACH2，并定义了跨器官TRM细胞共有的表观遗传特征。此外，对每个器官内TRM细胞的单独分析，揭示了与转录因子保守网络相关的组织内异质性，包括KLF和HIC 元件。 最后，作者还发现在TEX细胞亚群中，终末期TEX 细胞在核心表观遗传特征谱中包含有独特的顺式调控元件可及性。 综上所述，作者检测了小鼠急性和慢性感染后从不同解剖部位分离的CD8+T细胞的转录和染色质可及性变化，通过不同的表观遗传谱定义不同TRM细胞亚群分化，这也是器官特异性表型和转录差异形成的基础。此外，作者还提供了公共基因组浏览器，用于查询CD8效应T细胞和记忆T细胞以及TRM和TEX细胞的染色质可及性谱，以支持未来的研究。 参考文献 1. Masopust, D., and Soerens, A.G. (2019). Tissue-Resident T Cells and Other Resident Leukocytes. Annu. Rev. Immunol. 37, 521–546. 2. Szabo, P.A., Miron, M., and Farber, D.L. (2019). Location, location, loca- tion: Tissue resident memory T cells in mice and humans. Sci. Immunol. 4, 1–12. 3. Christo, S.N., Evrard, M., Park, S.L., Gandolfo, L.C., Burn, T.N., Fonseca, R., Newman, D.M., Alexandre, Y.O., Collins, N., Zamudio, N.M., et al. (2021). Discrete tissue microenvironments instruct diversity in resident memory T cell function and plasticity. Nat. Immunol. 22, 1140–1151. 4. Mackay, L.K., Minnich, M., Kragten, N.A.M., Liao, Y., Nota, B., Seillet, C., Zaid, A., Man, K., Preston, S., Freestone, D., et al. (2016). Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lympho- cytes. Science 352, 459–463. 5. Kumar, B.V., Ma, W., Miron, M., Granot, T., Guyer, R.S., Carpenter, D.J., Senda, T., Sun, X., Ho, S.H., Lerner, H., et al. (2017). Human Tissue- Resident Memory T Cells Are Defined by Core Transcriptional and Functional Signatures in Lymphoid and Mucosal Sites. Cell Rep. 20, 2921–2934. 6. Beura, L.K., Wijeyesinghe, S., Thompson, E.A., Macchietto, M.G., Rosato, P.C., Pierson, M.J., Schenkel, J.M., Mitchell, J.S., Vezys, V., Fife, B.T., et al. (2018). T Cells in Nonlymphoid Tissues Give Rise to Lymph-Node- Resident Memory T Cells. Immunity 48, 327–338.e5. 7. Masopust, D., Choo, D., Vezys, V., Wherry, E.J., Duraiswamy, J., Akondy, R., Wang, J., Casey, K.A., Barber, D.L., Kawamura, K.S., et al. (2010). Dynamic T cell migration program provides resident memory within intes- tinal epithelium. J. Exp. Med. 207, 553–564. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2024.06.014 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述