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关注小药说药，一起成长！ 前言 基于T细胞的免疫疗法的出现显著改变了癌症患者的治疗模式。尽管取得了成功，但目前批准的免疫治疗方案仍然存在局限性。因此，需要对T细胞活化和抑制的分子机制有更深入的了解，以合理地扩大改善免疫治疗的靶点和可能性。 免疫信号通路下游的蛋白质泛素化对于几乎所有免疫反应，特别是T细胞激活的正调节和负调节至关重要。大量研究表明，泛素化通过控制蛋白质的功能、定位和稳定性发挥多种细胞和分子作用，对泛素依赖性通路的调节可以显著改变T细胞的活化并增强抗肿瘤反应。因此，人们正在积极开发有选择性地利用泛素相关酶用于癌症治疗的技术，靶向泛素化为推进T细胞免疫治疗提供了巨大的可能性。 蛋白质泛素化 泛素化是一种翻译后修饰，泛素是一种由76个氨基酸组成的小蛋白质，通常由一条泛素链与底物蛋白质内的赖氨酸残基共价连接。泛素化通过各种方式影响蛋白质功能，例如通过影响蛋白质稳定性、周转率、细胞定位，以及诱导影响与其他蛋白质相互作用的构象变化。 该过程由E1泛素激活酶启动，该酶使用ATP激活，然后将泛素单体转移到E2泛素结合酶。泛素最终在E3泛素连接酶的作用下从E2转移到底物。 泛素化是多方面的，底物蛋白可以仅用一个泛素（单泛素化）、多个单泛素（多个单泛素化）或多泛素链（多泛素化）标记。由于泛素本身有七个赖氨酸（Lys6、Lys11、Lys27、Lys29、Lys33、Lys48和Lys63）和一个N端甲硫氨酸残基（M1），可以进行泛素化，因此可以形成几种结构不同的同质/同型、混合/异型和分支多泛素链。 泛素化除了是通过蛋白质体降解蛋白质的主要调节器外，实际上是几乎所有细胞信号级联的多功能调节器。泛素化蛋白质的命运取决于添加的泛素数量和形成泛素连接的泛素氨基酸。通过这种方式，并且由于拓扑结构不同链的多种可能性，泛素构成了一种高度通用的信号。 单泛素化和多泛素化参与膜受体的内吞作用，以及蛋白质降解、定位和蛋白质-蛋白质相互作用，这些类型的链也与TGF-β信号传导有关。在同型多泛素链中， Lys48和Lys63连接的链是最丰富，它们分别驱动蛋白酶体降解和调节多种细胞信号事件。Lys11连接链调节细胞周期和线粒体自噬，M1连接链对炎症固有反应至关重要，特别是调节NF-κB信号。 由Lys6-、Lys27-、Lys29-、Lys33泛素连接链调节的细胞过程仍然不太清楚。Lys27连接链似乎对调节先天免疫、细胞周期和线粒体功能非常重要。Lys6链似乎参与DNA修复和线粒体自噬，而Lys29链与Wnt信号以及蛋白毒性应激和细胞周期相关。Lys33链在高尔基体后转运和T细胞受体（TCR）调节中起着关键作用。 此外，非常重要的是，泛素在底物上的组装可以通过去泛素化酶（DUB）的作用逆转，去泛素化酶水解并从底物上去除泛素，使泛素化成为一种瞬时修饰，DUB对于维持生理性泛素平衡是必不可少的。这种平衡的失调与人类疾病的发病机制有关，特别是癌症、感染、神经退行性变和免疫紊乱，因此，DUB已开始作为基于抑制剂的治疗成为有吸引力的药物靶点。 TCR/CD3激活中的泛素途径 E3连接酶 E3泛素连接酶Casitas B系淋巴瘤（Cbl-B）是最具特征的E3连接酶，是T细胞活化的主要参与者。在T细胞激活时，它在免疫突触处被招募到TCR中，在TCR下游发挥多种抑制机制。 Cbl-b通过其多个蛋白质相互作用结构域与关键TCR信号体分子（如LCK、SLP76、ZAP70、Vav1、PKCθ和PI3K）相互作用。Cbl-b与E3连接酶Itch协同作用，能够介导TCR-ζ的Lys33连接的多泛素化，其不针对TCR受体进行降解或内吞，而是阻止其磷酸化并进一步与下游ZAP70激酶结合。通过这些相互作用，以及一些信号体成分的泛素化，Cbl-b强烈抑制T细胞活化。Cbl-b敲除小鼠具有过度活跃的T细胞，其激活不需要CD28，此外，Cbl-b基因敲除小鼠中从未描述过自身免疫损伤。因此，Cbl-b具有多个检查点抑制作用和极小的自身免疫毒性，是未来靶向癌症免疫治疗的有力候选。 与淋巴细胞无能相关的基因（GRAIL）是一种跨膜E3连接酶，定位于内体，也对T细胞活化起负调节作用。TCR介导的T细胞活化促进GRAIL的表达，而GRAIL反过来又阻碍T细胞活化。机制上，GRAIL通过非降解泛素链稳定和激活Rho-鸟嘌呤解离抑制剂（RhoGDI），导致细胞骨架重排和IL-2分泌缺陷。 NRDP1是另一种损害TCR信号的E3连接酶。T细胞激活后，NRDP1将Lys33多聚泛素非降解链添加到ZAP70激酶。Lys33连接的泛素链有助于招募Sts1和Sts2磷酸酶，最终使ZAP70去磷酸化和失活。 除了作用于近端信号体外，E3连接酶还通过进一步作用于下游抑制T细胞活化，控制导致T细胞活化转录因子核易位的关键转导事件。例如，在TCR/CD28连接后，E3连接酶Pellino1（PELI1）通过用Lys48多泛素链标记c-Rel来阻止NF-κB通路，导致其蛋白酶体降解。 DUBs 去泛素化酶A20和CYLD，在调节天然免疫细胞中的NF-κB信号中具有重要作用，也能显著改变T细胞功能。外周T细胞中A20的条件性缺失导致CD8+T细胞具有增强的NF-κB信号，即使在低抗原剂量下也能更有效地被激活，以产生更高水平的IL-2和IFN-γ。 CYLD可以通过NF-κB损害T细胞活化，它是通过将CBM复合物下游TAK1激酶的Lys63泛素链进行去泛素化。CYLD缺陷小鼠出现结肠炎，T细胞频率和活化增加。 使用类似的作用机制，去泛素酶USP18对TAK1的去泛素化抑制TCR。USP18的基因缺失导致T细胞中NF-κB和NFAT的过度激活和IL-2的过度产生。相反，去泛素酶USP9X和USP12通过从BCL10中去除抑制性泛素链来积极调节NF-κB通路，从而阻断CBM信号复合物的组装。因此，缺乏USP9X或USP12的T细胞在TCR激活时表现出较低水平的NF-κB激活，以及增殖和细胞因子生成减少。 TCR内化 TCR信号幅度和持续时间由细胞膜受体的内化、再循环和降解的平衡决定。在抗原刺激下，TCR/CD3复合物是泛素化的，而泛素化对于表面受体的内化至关重要。据报道，Cbl-b可单独或与E3连接酶c-Cbl联合促进TCR的内化，Cbl-b还干扰激活和聚集，从而破坏免疫突触的稳定性，进一步减弱TCR信号。 类似地，E3连接酶GRAIL可以通过蛋白酶体多泛素化和降解CD3ζ分子来下调表面TCR/CD3复合物的表达。最近的研究表明，用于CAR-T治疗的CAR受体的表面表达也受到泛素介导的内吞和降解的影响。注入患者体内的CAR-T细胞持续性差是这种肿瘤免疫疗法的主要限制。最近的一项研究能够通过对细胞质结构域的所有赖氨酸残基进行突变来提高CAR的稳定性，这有效地绕过了CARs的泛素化依赖性溶酶体降解，因此，这些CAR-T细胞改善了CAR的持久性和来自内体的信号传导，同时增强了效应器功能，从而在小鼠模型中产生持久的抗肿瘤免疫反应。 共刺激受体下游的泛素途径 CD28 E3连接酶Cbl-b是CD28介导的信号传导的主要抑制剂，从机制上讲，E3连接酶Cbl-b通过结合和泛素化PI3K的p85β亚单位来抑制CD28依赖的PI3K途径。 E3连接酶不仅能阻碍CD28信号传导，而且能促进CD28信号传导。例如，TCR/CD28激活NFAT涉及E3连接酶TRAF6。TRAF6被招募到免疫突触与支架蛋白LAT相互作用，并通过Lys63泛素化增强LAT磷酸化和TCR信号。 为了充分激活T细胞，CD28共受体必须克服Cbl-b抑制。CD28信号通过触发Cbl-b的翻译后修饰来阻断Cbl-b抑制途径，最终导致其蛋白酶体降解。其中E3连接酶NEDD4发挥着重要作用，据报道NEDD4在CD28共刺激下结合并泛素化Cbl-b进行蛋白酶体降解。 其他共刺激受体 与CD28类似，肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族成员的共刺激受体4-1BB、CD40L、OX40和GITR与TCR协同促进T细胞活化，尤其是增殖和细胞因子的产生。作为TNFRs，它们缺乏内在的酶功能，依赖于几种E3连接酶，包括TRAF（TRAF1/2/3）、cIAP1/2和LUBAC，在导致NF-κB活化的信号转导级联中引导大量Lys63、Lys48和线性泛素化事件。去泛素酶A20、CYLD和OTULIN可以清除这些泛素化事件以阻止NF-κB的活化。 抑制性受体下游泛素途径 CTLA-4 到目前为止，没有任何E3直接泛素化CTLA-4的报道，也没有CTLA-4中泛素化位点的记录。然而，CTLA-4缺陷型T细胞的泛素修饰总体上显著减少，这有力地表明了泛素化事件在CTLA-4途径中的重要性。此外，实验证据表明，主要CTLA-4抑制功能由关键的T细胞抑制性E3连接酶介导，该连接酶也调节T细胞活化，即Cbl-b、ITCH和GRAIL。 此外，Cbl-b、ITCH和GRAIL是T细胞无能的基本驱动因素，而且这三种E3连接酶还通过调节Treg的发育和功能发挥重要的免疫抑制作用。Cbl-b和ITCH参与TGF-β介导的Foxp3调节，缺乏这两种E3连接酶都会损害TGF-β诱导的Foxp3+Tregs（iTreg）的发育，导致iTreg低表达，功能缺陷。 PD-1 与CTLA-4不同，一些报告强调了泛素化在PD-1/PD-L1系统中的关键作用。对于T细胞上的PD-1受体，Cbl-b也作为PD-1抑制途径的关键介质显著参与，缺乏Cbl-b的T细胞对PD-1抑制具有抵抗力。没有Cbl-b，PD-1在抑制IFN-γ产生或诱导T细胞活化后的细胞死亡方面效率低下。 另一种Cbl E3连接酶c-Cbl也影响PD-1，但与Cbl-b相反，它是一种负性调节因子。c-Cbl与PD-1的胞质尾部结合，并作为E3连接酶，泛素化PD-1进行蛋白酶体降解。因此，c-Cbl减少提高了CD8+T细胞和巨噬细胞中PD-1的表达。 同样，E3连接酶FBXO38通过介导PD-1降解来控制T细胞抗肿瘤反应。从机理上讲，FBXO38通过在Lys233处添加Lys48多聚泛素链来标记PD-1进行降解。缺乏FBXO38的黑色素瘤和结直肠癌小鼠模型具有更高的肿瘤负荷，这与肿瘤浸润性T细胞中PD-1的高表达有关。 PD-L1 PD-L1的肿瘤水平是肿瘤免疫的重要决定因素。几项研究已确定癌细胞利用EGFR信号稳定PD-L1表达以逃避T细胞免疫。E3连接酶识别并泛素标记PD-L1进行蛋白水解，主要依赖于糖原合成酶激酶3（GSK3α/β）。GSK3β磷酸化PD-L1的C端结构域，以招募E3连接酶β-TrCP用于PD-L1泛素依赖性降解。而EGFR信号通过诱导GSK3β磷酸化位点附近的PD-L1大量糖基化来对抗GSK3β/β-TrCP/PD-L1降解途径。 另一项研究进一步表明GSK3α/ARIH1是另一种诱导PD-L1蛋白水解的激酶/E3连接酶对。E3连接酶ARIH1识别S279/S283处PD-L1的GSK3α依赖性磷酸化，随后PD-L1 Lys48泛素化和降解。最近，还发现EGFR通过额外干扰膜结合MARCH8 E3连接酶增加PD-L1水平，该连接酶也以PD-L1为降解靶点。最后，c-Cbl过表达，单独或与Cbl-b联合，也可以降低STAT3/AKT/ERK磷酸化，从而下调PD-L1表达并增加抗肿瘤反应。 Cullin3 SPOP和TRIM21E3连接酶通过泛素化依赖性降解进一步破坏PD-L1的稳定性，它们的作用再次依赖于激酶，特别是细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4和CDK5。然而，CDK4通过稳定Cullin3 SPOP协助PD-L1降解，而CDK5则消极干扰TRIM21对PD-L1的作用。 此外，PD-L1也因其他几种去泛素化酶而稳定，即OTUB1、USP9X、USP7。这些研究具有潜在的治疗意义，因为它们证明，抑制或清除这些DUB中的任何一种都可以重新激发小鼠的抗肿瘤反应，并使癌细胞对T细胞杀伤敏感。 泛素依赖途径肿瘤药物的开发 到目前为止，针对泛素依赖的途径主要是基于小分子抑制剂，这些小分子可以通过直接结合或变构作用阻断泛素相关酶的催化结构域，或阻止其与底物或其他调节蛋白结合。目前，已经开发了200多种化合物，其中许多化合物正在进行癌症治疗的临床前和临床试验。 大多数基于泛素的小分子化合物被设计成靶向癌细胞中必需的泛素途径。随着以T细胞为基础的肿瘤免疫治疗的出现，针对选择性E3和DUB的靶向抑制已有研究，其中关键的细胞内检查点T细胞抑制剂Cbl-b具有巨大的潜力。已有研究利用RNA干扰成功地下调了T细胞中的Cbl-b水平，这在不同的过继性T细胞转移肿瘤模型中产生了出色的体外和临床前结果，并且癌症患者对其耐受性良好，目前已进入临床试验（NCT02166255和NCT03087591）。此外，针对IAPs、MDM2和USP7的小分子已经进行了临床前试验，并证明单独使用或联合使用时，至少部分增强体内抗肿瘤免疫。 调节癌细胞中PD-L1降解的泛素化依赖途径也正在进行测试。例如，一种竞争性棕榈酰化抑制剂（CPP-S1），以防止PD-L1棕榈酰化，进而促进PD-L1泛素介导的降解。控制PD-L1泛素化和降解的EGFR信号通路也通过不同的方式在体内被有效阻断，包括EGFR小分子抑制剂、铜螯合剂和靶向CSN5的小分子，都显著增强T细胞抗肿瘤反应。 基于邻近性的治疗方法，包括PROTAC或分子胶技术，也正在迅速发展，以针对几种特定肿瘤蛋白质的蛋白酶体降解，目前有十几项临床试验正在验证这些基于泛素化技术的治疗潜力。 小结 数据表明，调节几种泛素依赖性途径，特别是所涉及的泛素依赖性酶，可以释放强烈、持久和靶向的抗肿瘤反应。目前，泛素领域也取得了巨大进展，开发出了多种新技术和新方法，可以专门针对几乎所有泛素依赖的酶，或者利用它们针对感兴趣的底物蛋白，包括肿瘤蛋白。展望未来，相信这些重要的泛素依赖途径的调节很快将成为改善靶向肿瘤免疫治疗的可行替代方案。 参考文献： 1.Ubiquitination in T-Cell Activation andCheckpoint Inhibition: New Avenues for Targeted Cancer Immunotherapy. Int J MolSci. 2021 Oct; 22(19): 10800. 公众号内回复“疫苗篇”或扫描下方图片中的二维码免费下载《小药说药疫苗篇》的PDF格式电子书！ 公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。

NETs（Neutrophil extracellular traps）即中性粒细胞胞外陷阱，是中性粒细胞在特定条件下释放到胞外的一种网状结构，在免疫应答和疾病发生发展过程中具有重要作用。 定义：NETs 是中性粒细胞在受到病原体、细胞因子、免疫复合物等刺激时发生的一种特殊的细胞死亡方式（NETosis）过程中释放到细胞外的纤维状结构。 组成成分：主要由DNA骨架、组蛋白以及多种中性粒细胞颗粒蛋白组成。其中，DNA为NETs 提供了结构基础，组蛋白具有抗菌活性，能够直接杀伤病原体；中性粒细胞颗粒蛋白包括髓过氧化物酶（MPO）、弹性蛋白酶、组织蛋白酶G等，这些蛋白赋予了NETs多种生物学功能，如杀菌、调节炎症反应等。 NETs促进肿瘤转移 最近，“Neutrophil extracellular traps promote pre-metastatic niche formation in the omentum by expanding innate-like B cells that express IL - 10” 的研究论文发表于Cancer Cell，揭示了中性粒细胞胞外陷阱（NETs）通过诱导网膜间皮细胞表达 CXCL13，招募表达IL-10的先天样B细胞，促进调节性T细胞扩增，从而推动卵巢癌网膜促转移微环境形成的机制，为卵巢癌转移机制研究提供了新见解，也为开发新的治疗策略提供了理论依据。 NETs促进促转移生态位中B细胞扩增 实验模型构建：使用卵巢癌小鼠模型（如通过向小鼠卵巢囊内注射ID8细胞构建），包括NETs形成能力正常的 小鼠和 NETs 缺陷的 小鼠，以及通过药物（如 GSK484 抑制 PAD4）处理的小鼠模型，还涉及多种细胞系（如 ID8、BPPNM）和不同基因型小鼠（如 muMT、VertX、CD45.1、Il10 - KO 等）进行实验。 NETs对促转移生态位中B细胞数量的影响：在卵巢癌小鼠模型中，对比 和 小鼠，发现肿瘤形成三周后，两组原发肿瘤大小无显著差异，但 小鼠网膜中脂肪相关淋巴样聚集体（FALCs）显著增大，其中B细胞数量增加最为明显（增加 4 倍），而 小鼠中B细胞数量无显著增加；使用药物抑制 NETs 形成后，B6小鼠网膜中的B细胞数量显著减少，进一步证明 NETs 可增加前转移网膜中的B细胞数量。 NETs 优先增加先天样CD43⁺ B细胞 不同类型B细胞特征及分布：在健康小鼠中，约50% 的网膜B细胞为CD43⁺，多数为 IgM⁺IgD⁻且B220⁺；在肿瘤小鼠中，CD43⁺网膜B细胞数量增加，比例略有下降，而 CD43⁻B细胞数量在两组肿瘤小鼠中均增加，但增加幅度较小。在不同组织中，CD43⁺和CD43⁻B细胞的变化趋势不同，如在肠系膜和脾脏中变化不显著，在肿瘤小鼠腹腔中CD43⁺ B细胞数量减少。 NETs对CD43⁺和CD43⁻B细胞的影响差异：通过药物抑制NETs（如 GSK484 处理）和使用不同肿瘤模型（如 ID8、BPPNM）实验发现，无论肿瘤细胞来源和突变情况如何，CD43⁺B细胞对NETs更为敏感，在NETs存在时其数量增加更为显著；在人类早期高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）患者的组织中，CD43⁺B 细胞比例也显著增加，同时伴有NETs形成，进一步表明NETs优先增加先天样 CD43⁺ B细胞。 NETs刺激CD43⁺腹膜B细胞向网膜募集 NETs对B细胞增殖和存活的影响：通过体内 BrdU掺入实验和体外CFSE染色实验发现，在卵巢癌小鼠模型中，网膜中的B细胞增殖不明显，且体外实验表明 NETs 刺激不会增加B细胞的增殖或存活，提示NETs可能通过其他方式增加网膜中B细胞数量。 NETs诱导B细胞迁移的机制：通过将B细胞过继转移到不同处理的小鼠（如 muMT 小鼠）体内实验发现，NETs可促进CD43⁺ B细胞从腹腔向网膜迁移，而对CD43⁻B细胞迁移影响较小；进一步研究发现，NETs可诱导网膜间皮细胞表达CXCL13，而CD43⁺B细胞表面CXCR5表达水平较高，且肿瘤小鼠网膜中 CXCL13⁺细胞增多，抑制 NETs 形成可降低CXCL13表达，表明NETs通过诱导 CXCL13表达吸引CD43⁺B细胞迁移至网膜。 CD43⁺ B细胞增加转移网膜中Treg/Th1细胞比例并促进转移 B 细胞对前转移网膜中T细胞组成的影响：在卵巢癌小鼠模型中， 和 小鼠网膜中总T细胞数量均增加，但 小鼠中调节性 T 细胞（Treg）数量和比例增加更明显，Th1细胞比例降低，导致 Treg/Th1比例显著升高；使用药物抑制NETs（如 GSK484 处理 B6 小鼠）可降低网膜中 Treg/Th1 比例，且在 muMT小鼠中NETs 对 Treg/Th1比例的调节依赖于B 细胞存在。 CD43⁺ B 细胞的功能验证：通过向小鼠过继转移不同类型 B 细胞实验发现，CD43⁺ B 细胞可增加前转移网膜中 Treg 数量和 Treg/Th1 比例，而 CD43⁻ B 细胞无此作用；在 muMT 小鼠中，接受 CD43⁺ B 细胞的小鼠出现网膜转移，而接受 CD43⁻ B 细胞或无 B 细胞的小鼠未发生转移，表明 CD43⁺ B 细胞可促进网膜转移，且这种作用与增加 Treg/Th1 比例有关。 NETs 选择性刺激 CD43⁺ B细胞产生 IL - 10 促进网膜转移 NETs对CD43⁺ B细胞 IL-10表达的影响：在人类早期 HGSOC患者网膜组织中，部分患者的CD19⁺CD43⁺细胞可检测到IL-10；在小鼠实验中， 小鼠肿瘤相关网膜中CD43⁺ B细胞的Il10 mRNA水平升高，而CD43⁻ B细胞无明显变化；通过使用Il10- eGFP报告基因小鼠发现，肿瘤小鼠网膜中CD43⁺ B细胞中 Il10- eGFP⁺细胞比例增加，且NETs可在体外刺激CD43⁺ B细胞表达IL - 10，但对CD43⁻ B细胞作用较小。 IL-10在CD43⁺ B细胞促进转移中的作用：通过向muMT小鼠过继转移野生型或 Il10-KO的CD43⁺ B细胞实验发现，野生型CD43⁺ B细胞可增加网膜中Treg数量和Treg/Th1比例，促进转移，而Il10- KO的CD43⁺ B细胞无此作用，表明CD43⁺ B细胞产生的 IL-10可增加前转移网膜中 Treg/Th1 比例并促进转移。 NETs 通过抑制 SHP-1 诱导 CD43⁺ B 细胞产生 IL-10 NETs对BCR信号通路及相关分子的影响：NETs刺激可诱导CD43⁺和CD43⁻ B细胞中BCR复合物重排，以及 ERK1/2、p38 MAPK和NF- κB p65 磷酸化；但在CD43⁺ B细胞中，NETs 可促使CD22聚集，抑制CD22与SHP-1的结合，降低 SHP-1磷酸化（Tyr564），从而增加SHP-1底物（如BLNK、SLP-76和 STAT3）的磷酸化，而在CD43⁻ B细胞中这些变化不明显。 SHP-1 抑制对 IL-10产生的影响：使用SHP- 1激动剂 SC- 43 处理细胞发现，其可抑制NETs诱导的STAT3磷酸化，并部分阻断NETs对CD43⁺ B细胞IL-10产生的刺激作用，表明NETs通过抑制 SHP-1 活性部分刺激CD43⁺ B细胞产生IL-10。 ROS促进NETs诱导的 SHP-1氧化和 IL-10 产生 NETs对B细胞中ROS产生的影响：NETs刺激可显著增加CD43⁺ B细胞中的总 ROS 和线粒体 ROS水平，而对 CD43⁻ B细胞无明显影响；使用ROS清除剂 N - 乙酰半胱氨酸（NAC）和线粒体氧化还原抑制剂 MitoQ 可分别抑制NETs诱导的总ROS和线粒体ROS增加；同时，NETs刺激可诱导CD43⁺ B细胞中多个氧化应激反应基因表达上调。 ROS在IL-10产生中的作用：通过 “生物素转换” 方法检测发现，NETs 刺激可增加CD43⁺ B细胞中蛋白质 S-亚硝基化水平，且 NETs 刺激后CD43⁺ B细胞中氧化型 SHP-1水平增加；使用NAC处理可抑制 NETs 诱导的CD43⁺ B细胞IL-10产生，表明ROS参与NETs诱导的SHP-1氧化和IL-10产生过程。此外，NETs中的蛋白质（如MPO和组蛋白）可诱导CD43⁺ B细胞产生ROS、蛋白质S-亚硝基化和IL-10，且NAC可抑制这些诱导作用，进一步证明NETs通过增加ROS诱导 CD43⁺ B细胞产生IL-10。 参考资料 Masucci MT, Minopoli M, Del Vecchio S and Carriero MV (2020) The Emerging Role of Neutrophil Extracellular Traps (NETs) in Tumor Progression and Metastasis. Front. Immunol. 11:1749. doi: 10.3389/fimmu.2020.01749 Fang Q, Stehr AM, Naschberger E, Knopf J, Herrmann M and Stürzl M (2022) No NETs no TIME: Crosstalk between neutrophil extracellular traps and the tumor immune microenvironment. Front. Immunol. 13:1075260. doi: 10.3389/fimmu.2022.1075260 Lee et al., Neutrophil extracellular traps promote pre-metastatic niche formation in the omentum by expanding innate-like B cells that express IL-10, Cancer Cell (2024), https://doi.org/10.1016/j.ccell.2024.12.004

2024年12月10日，辉瑞在Journal of Medicinal Chemistry上发表了题为“Discovery of PF-07265028, A Selective Small Molecule Inhibitor of Hematopoietic Progenitor Kinase 1 (HPK1) for the Treatment of Cancer”的文章，在这篇文章中，作者通过虚拟筛选和生物筛选，成功开发出了具有高选择性和良好药理特性的PF-07265028，该化合物在体外和体内实验中均表现出对HPK1的有效抑制，且具有合适的药代动力学性质，现已推进至临床1期试验。该研究为癌症免疫治疗领域提供了一种新的有前景的药物候选物，为后续的临床研究和癌症治疗提供了重要的基础。 造血祖细胞激酶1（HPK1/MAP4K1），是一种在免疫调节和癌症治疗领域具有重要研究价值的激酶。HPK1在T细胞受体（TCR）信号传导中充当负调节节点。它通过磷酸化TCR-信号转导子SLP76，并促使其降解，从而限制T细胞的激活。这一过程影响了T细胞的增殖、细胞因子的产生等关键功能。在癌症发生发展过程中，HPK1的活性可能有助于肿瘤细胞逃避免疫系统的监视和攻击。通过抑制T细胞的激活，HPK1可能间接促进肿瘤的生长和扩散。因此，HPK1成为癌症免疫治疗的一个潜在靶点。 2011年的一项研究调查了72种先前开发的激酶抑制剂对HPK1及其他激酶的活性，为后续HPK1抑制剂的设计提供了一些起始支架，但早期化合物在效力、ADME性质和选择性等方面存在不足。近年来，已有多个研究小组致力于开发HPK1抑制剂，如Diaminopyrimidine Carboxamide、GNE-6893、Reverse Indazole Inhibitors等不同类型的HPK1抑制剂，这些抑制剂在细胞实验中表现出不同程度的效力和选择性。但开发具有高选择性、良好药代动力学性质以及高效力的抑制剂仍然具有挑战性。 本研究首先利用虚拟筛选和生化筛选技术，从化合物库中筛选出对HPK1有结合活性的化合物1。化合物1亲脂效率具有一定优势，但其效力有待提高，且对LCK（LCK是一个需要重点关注的激酶，是启动T细胞受体（TCR）信号级联所必需的，开发的HPK1抑制剂需要避免对LCK的抑制，以减少对正常免疫功能的影响）的选择性也需要进一步优化。 表1. 初步筛选命中HPK1抑制剂化合物1 基于HPK1同源模型的分析，预测化合物1的结合构象中存在一个铰链结合基，通过引入碱性胺来优化。作者设计并合成了化合物2和3，化合物2和3在生化效力上都有所提高，且选择性也得到改善。进一步将化合物2和3的异丙基烷基三唑修饰为异丁基烷基三唑，得到化合物4和5，细胞效力有所提高，亲脂效率也有小幅提高，但在体外血浆稳定性测定中发现这两个化合物不稳定。 表2. 化合物2-5的结构及生物活性 作者推测化合物4和5的血浆不稳定是由于酰胺酶活性导致的，遂将化合物的酰胺官能团环化为内酰胺，得到化合物6。化合物6的血浆稳定性得到提高，亲脂效率与化合物3相当，但生化效力相较化合物2和3大幅下降，为了研究碱性胺在新系列中的作用，还合成了中性醇化合物7，其效力虽有提高但效率略有下降且溶解度变差，因此后续重点关注化合物6的效力优化。 表3. 化合物6和7的结构和生物活性 随后，基于HPK1与化合物6的共晶结构，作者在化合物6的基础上引入甲氧基并将伯胺转化为N-甲基胺得到化合物8，其在HPK1生化测定中的效力比化合物6提高了近180倍，亲脂效率也大幅提高。接着对化合物8进行烷基三唑修饰，得到化合物9，其生化效力高且具有高选择性。移动化合物9的甲氧基与胺形成分子内氢键得到化合物10，虽效力有所损失但效率相当。尽管化合物8和9在生化活性上达到纳摩尔水平，但细胞效力大于100 nM，且发现许多激酶与HPK1一起被抑制，表明存在脱靶效应影响细胞效力和选择性。 图1.(a) HPK1 T165E/S171E与化合物6（PDB 9CZT）的共晶结构。(b)共晶结构相互作用图。 表4.化合物8-10的结构和生物活性 图2.化合物8和9的选择性 接着，作者分析化合物9的共晶结构发现存在配体扭转应变，为提高细胞效力，将苯基内酰胺基序替换为氮杂内酰胺基序，并合成了化合物11和12。相对于化合物8，化合物11的细胞活性提高约3倍，亲脂性下降，亲脂效率提高0.9单位。化合物12相对于化合物9也有类似改善。化合物11因亲脂效率略高且无手性中心而更优。但进一步研究发现化合物11和其他相关类似物主要通过CYP2D6代谢（fm约为80%），这可能导致患者间的代谢差异较大，影响安全性和疗效。 图3.(a) HPK1 T165E/S171E与化合物9（PDB 9CZU）的共晶结构。(b)共晶结构相互作用 表5. 通过减少结合构象中的配体应变来提高效力和亲脂性效率 为了降低CYP2D6代谢分数，作者通过对化合物11在CYP2D6晶体结构中的建模分析，确定二甲基基团可能是氧化位点，对一系列超过所需效力、选择性和ADME标准的类似物进行CYP2D6代谢分析。最终确定化合物13，它是化合物11的正丙基异构体，保持了相同程度的效力和效率，但将CYP2D6 fm从80%显著降低至16%。同时，化合物13的共晶结构显示其与HPK1有多种相互作用，且具有低内在清除率和合适的亲脂性，为进一步优化提供了良好基础。 图4.化合物11在CYP2D6中的建模结构 表6.CYP2D6代谢及效价优化 图5.化合物13在HPK1 S165E/T171E（PDB 9CZW）中的共晶结构。(a)侧视图，(b)自顶向下视图，(c)交互图。 接下来，为了获得对所有脱靶激酶具有高选择性的抑制剂，作者分析HPK1的ATP结合位点，发现G-loop区域具有独特的氨基酸序列（三个连续的甘氨酸残基），基于此设计了甲基取代的三唑化合物16，期望通过向该区域延伸空间位阻来提高选择性。化合物16与化合物13相比，在保持生化和细胞效力的同时，显著提高了选择性。 表7.通过修饰三唑的效力和选择性优化 图6.化合物13、16的选择性 同时作者还针G-loop区域设计支链胺，以引入空间位阻提高对脱靶激酶的选择性，同时保持对HPK1的效力。合成了化合物20。化合物20对HPK1具有高活性，且具有高的激酶选择性。基于化合物20，进一步合成了化合物21（PF-07265028），其细胞活性更高，能有效诱导IL-2产生，且对脱靶激酶的选择性与化合物20相当。化合物22选择性类似但效力稍弱。最终选取化合物21进行后续生物活性评估。 表8.通过用支链胺靶向G-loop来提高选择性 图7.化合物20、21、22的选择性 PF-07265028的体外ADME性质研究：接下来，作者对PF-07265028进行了各种ADME性质的测定实验。结果显示具有良好的ADME性质，包括较高的渗透性、动力学溶解度和适度的肝细胞内在清除率，其中部分通过CYP2D6代谢。 表9.PF-07265028的体外ADME性质 PF-07265028的体内药代动力学研究：随后作者在小鼠和猴子体内对PF-07265028进行药代动力学研究。结果显示，PF-07265028在小鼠和猴子体内均表现出令人鼓舞的药代动力学特征，具有适中的清除率、分布容积和口服生物利用度，半衰期约为3-4小时。 表10.PF-07265028的体内药代动力学研究 综上所述，本研究从初始化合物筛选开始，经过多轮结构改造优化，逐步提高化合物对HPK1的抑制效力、稳定性以及选择性，同时改善药代动力学性质。成功开发出了PF-07265028这种高效、高选择性的HPK1抑制剂。PF-07265028在体外和体内实验中表现良好，现已进入临床1期试验，用于评估其作为单一药物或与萨善利单抗（sasanlimab）联合治疗晚期实体瘤患者的潜力。该研究为癌症免疫治疗领域提供了一种新的有前景的药物候选物，为后续的临床研究和癌症治疗提供了重要的基础。 原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.4c01930 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓