TRPA1

在一项新的研究中，来自加州大学旧金山分校、北京大学、南澳大利亚健康与医学研究所和阿德莱德大学的研究人员发现某些称为肠嗜铬细胞（enterochromaffin, EC）的肠道细胞通过检测有害刺激并释放 在一项新的研究中，来自加州大学旧金山分校、北京大学、南澳大利亚健康与医学研究所和阿德莱德大学的研究人员发现某些称为肠嗜铬细胞（enterochromaffin, EC）的肠道细胞通过检测有害刺激并释放大量影响神经与大脑沟通的神经递质，在疼痛中发挥着比以前认为的更重要的作用。由此产生的疼痛信号在初始触发后可能会持续很长时间，这可能会导致肠易激综合征（IBS）和炎症性肠病（IBD）等疾病中的慢性疼痛。 相关研究结果于2025年2月12日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“Topological segregation of stress sensors along the gut crypt–villus axis”。论文通讯作者为南澳大利亚健康与医学研究所的Stuart Brierley教授、北京大学的Yulong Li教授以及加州大学旧金山分校的David Julius教授和Kouki Touhara博士。 这些作者确定了两种关键类型的肠嗜铬细胞，它们对不同的肠道状况作出反应。一种称为绒毛肠嗜铬细胞（villus EC cell）的肠嗜铬细胞类型位于肠道内壁的较高位置，通过检测氧化损伤等有害的应激源起到早期预警系统的作用。 当遭受激活时，绒毛肠嗜铬细胞会释放血清素（serotonin ）和另一种称为ATP的分子，而ATP会激活向大脑发送疼痛信号的神经通路。 Brierley教授说，“绒毛肠嗜铬细胞就像门卫一样，释放血清素和ATP作为身体的警报系统，提醒身体肠道出了问题。” TRPA1驱动隐窝肠嗜铬细胞释放血清素 “第二种称为隐窝肠嗜铬细胞（crypt EC cell）的肠嗜铬细胞类型位于肠道内壁较深的位置。当肠道的保护屏障减弱时，它们会对刺激物（比如芥菜和芥末酱等辛辣食物中的某些化合物）作出反应，并释放血清素，所释放出的血清素作用于神经以发出疼痛信号。” Brierley教授说，“通常，这些隐窝肠嗜铬细胞有助于调节肠道分泌物，帮助消化，但当它们暴露于有害刺激物或在炎症期间，它们会向系统中注入血清素，从而激活神经，引发不适或疼痛。” 通过更好地了解这些肠道传感细胞如何与神经系统相互作用，研究人员希望开发出靶向疼痛根源的新疗法。 Brierley教授说，“我们如今对肠道疼痛是如何产生和维持的有了更清楚的了解。如果我们能找到调节肠嗜铬细胞激活方式的方法，这可能有助于找到更有效地治疗慢性肠道疼痛的方法，毕竟这种疼痛影响着全世界数百万人。”（生物谷 Bioon.com） 参考资料： Kouki K. Touhara et al. Topological segregation of stress sensors along the gut crypt–villus axis. Nature, 2025, doi:10.1038/s41586-024-08581-9.

股价暴跌60% 2025年2月9日，Pliant Therapeutics宣布暂停其核心管线bexotegrast用于特发性肺纤维化（IPF）的IIb/III期BEACON-IPF研究。 新闻稿中指出，此决定是基于数据安全监查委员会（DSMB ）给出的建议。DSMB主要职能为保证受试者安全和利益，以及确保试验的完整性和可信性，具体到职责则为”就继续、修改或停止试验向申办方提出建议”。 在原计划中，Pliant打算在本季度完成BEACON-IPF研究IIb期的患者入组，并预计在2026年年中公布数据。 此次突然宣布终止研究，Pliant并未披露详细原因。该公司表示，在数据审查以了解DSMB的决策理由期间，试验仍将保持盲态。 受此消息影响，Pliant当日收盘股价暴跌60.59%，报3.07美元/股。 十年困局：IPF治疗领域的新药荒漠 IPF是一种病因未明，局限于肺部的纤维化间质性肺炎。普通人群中的患病率2/100 000～ 29/100 000，属于罕见病。 随着疾病的进展，影像学上可以观测到患者肺组织会变厚、变硬、类似出现疤痕，使患者的肺呈大小不等的囊性状，也被成为“蜂窝肺”。 图片来源：默沙东诊疗手册 十年前，IPF的治疗是传统“三板斧”，即激素、免疫抑制剂（如环玲酰胺、硫唑嘌呤）和抗氧化剂乙酰半胱氨酸，疗效差强人意。 2014年，随着吡非尼酮与尼达尼布两款抗纤维化药物获FDA批准上市，有效延缓了患者的肺纤维化进展，提高生活质量。 其中，吡非尼酮是通过抑制细胞因子转化生长因子β（TGF-β）来抑制纤维化过程，而尼达尼布则是广泛抑制成纤维细胞和肌成纤维细胞中的下游信号通路。 虽然两款药物均都能抑制成纤维细胞增殖、阻碍胶原蛋白的产生并减少纤维化介质的产生，但不可避免的是都会产生显著的不良反应。 一项真实世界研究的荟萃分析发现，吡非尼酮和尼达尼布的不良反应发生率分别高达56.4%和69.7%，因不良反应中断治疗率分别为16.6%和16.2%，IPF相关死亡率分别为13.4%和7.2%，全因死亡率分别为20.1%和16.6%。 更为重要的是，十年过去，IPF抗纤维化药物仍且只有这两款药物获批上市。而这两种药物都不能阻止IPF的进展，预后差，患者诊断后平均存活约 3-5 年，存在巨大未被满足的临床需求。 难以穿越的研发“死亡谷” 市场的长期“空白”，并不意味着IPF领域没有投资潜力。据弗若斯特沙利文统计，2021年全球IPF的市场规模为33亿美元，预计2025年、2030年可达到50亿美元、71亿美元。 从吡非尼酮与尼达尼布的销售额来看，2020年两款药物的全球合并销售额约为35亿美元。可以说，两款“孤儿药”双双跻身重磅炸弹之列。 值得一提的是，随着专利悬崖与仿制药冲击，本月（2025年2月），罗氏宣布将其InterMune部门（包括吡非尼酮在美权益）出售给了Legacy Pharma。据罗氏2024财报显示，吡非尼酮全球销售额已跌至5400万美元。 可以看出，两款药物基本实现了仿制替代。那么为何，十年时间仍无IPF创新药获批？因为难。 一方面，疾病机制复杂，靶点选择与验证难度高。 IPF的发病机制尚未完全阐明，涉及炎症反应、上皮细胞损伤、成纤维细胞异常活化、细胞外基质沉积等多条信号通路（如TGF-β、CTGF、PDE4、整合素αvβ6等）。 尽管靶向这些通路的药物被广泛研究，但部分关键靶点在临床试验中未能验证其有效性。例如，针对CTGF的单抗Pamrevlumab、针对ATX的Ziritaxestat等III期试验均因疗效不足而失败。 另一方面，临床前模型与人体均在差异。动物模型（如博来霉素诱导肺纤维化）无法完全模拟人类IPF的复杂病理过程，从而无法筛选出最佳的候选药物。 此外，目前IPF的诊断和疗效评估主要依赖肺功能指标（如FVC）和影像学（HRCT），缺乏可预测疾病进展或药物反应的分子标志物。 总而言之问题很多，近年来不少Biotech与MNC折戟于此，以至于业内将IPF的临床二期称为“死亡谷”。 也正因如此，bexotegrast被业内寄予厚望。该药物作为一款口服小分子αvβ6与αvβ1整合素双重选择性抑制剂，旨在阻断TGF-β的激活，进而阻止TGF-β与其受体结合并激活促纤维化信号通路。 其IIa期研究表明，Bexotegrast治疗的患者总肺胶原减少，而安慰剂组的总肺胶原增加，表明纤维化可能逆转。与安慰剂组相比，接受Bexotegrast治疗的患者在所有时间点均表现出用力肺活量(FVC)改善和咳嗽严重程度降低。 安全性方面，Bexotegrast耐受性良好，没有药物相关的严重不良事件(SAE)且没有停药。 如今，作为Pliant首发管线的Bexotegrast，应声倒下，其股价暴跌也成了必然结果。 破局曙光：差异化路径与新势力崛起 人的悲欢并不相同。近日，BI宣布其选择性磷酸二酯酶4B（PDE4B）抑制剂Nerandomilast在用于治疗进行性肺纤维化（PPF）的试验中报阳。 此前，Nerandomilast已在IPF的三期临床试验中取得积极结果，因此成为了十年来首个在IPF三期临床试验中达到主要终点的药物。 目前，BI针对IPF领域押注了四款不同机制新药，除Nerandomilast外，还有TRPA1抑制剂BI 1839100、IL-11抗体BI-765423以及一款ATX抑制剂。后面三条管线均处在临床早期阶段。 国内方面，英矽智能于去年11月，宣布其核心自研管线ISM001-055在用于IPF的2a期临床研究中结果报阳；恒瑞在放弃一款靶向CTGF的单克隆抗体之后，又于去年7月启动了一项ATX抑制剂HRS-9813用于治疗IDF的临床1期研究。 最后就是交易方面，今年1月10日，礼来宣布斥资7.86亿美元从Mediar Therapeutics手中引入一款IPF在研药物MTX-463的全球权益，首付款和近期里程碑高达9900万美元。 参考资料： 1.Pliant Therapeutics官网 2.默沙东诊疗手册 3.雪球 4.继恒瑞后，阿斯利康也在特发性肺纤维化新药开发实现“靶点换新”（新药前沿）5.当初罗氏83亿美元收购的公司，如今卖了，因为仿制药的冲击（新药说） 6.IPF新药，产生7.86亿美元BD大交易（药融圈） 6.其他公开资料 封面图来源：pixabay 暴增超2000%！两款单抗，撑起阿尔茨海默病一片天 2025-02-10 罗氏CD20单抗三期临床结果积极，闯入蓝海自免市场！ 2025-02-08 核药：首个十亿美元分子诞生！ 2025-02-07 版权声明/免责声明 本文为原创文章。 本文仅作信息交流之目的，不提供任何商用、医用、投资用建议。 文中图片、视频、字体、音乐等素材或为药时代购买的授权正版作品，或来自微信公共图片库，或取自公司官网/网络，部分素材根据CC0协议使用，版权归拥有者，药时代尽力注明来源。 如有任何问题，请与我们联系。 衷心感谢! 药时代官方网站:www.drugtimes.cn 联系方式: 电话:13651980212 微信:27674131 邮箱:contact@drugtimes.cn 点击，查看更多精彩!

了解小分子配体如何与其靶标结合对于药物发现非常关键，进而可以通过基于结构的设计实现更有效的优化，更好地理解分子药理学的机制。本文列出了工业界用于确定或预测配体结合位点的常用的10种方法，包括：  X射线晶体学 低温电子显微镜（cryo-EM）  竞争分析 核磁共振（NMR）  共价标记  光亲和标记 突变分析和定点诱变 氢/氘交换 (HDX) 和化学或蛋白水解稳定性分析  非变性质谱法  计算建模方法 首先是提供最高可信度预测、精度和分辨率的技术（例如 X 射线晶体学），然后是经济快速的替代方案（图 1，按分辨率排序）。 图 1. 本文涵盖的方法概述，箭头上的相对位置指示结合位点确定或预测的置信度/精度/分辨率水平。 1. X射线晶体学 X 射线晶体学是一种历史悠久的生物物理方法，可提供有关结合位点结构和配体结合姿势的详细信息。它被广泛认为是研究蛋白质配体结构的“金标准”方法。 主要优点：容纳高达数百kDa的蛋白质；可提供支持设计的 < 3 Å 分辨率 主要缺点：样品制备困难，尤其是完整膜蛋白；静态结构与动态解状态不同 X射线晶体学的基本原理是，有序蛋白质晶体中的原子会在特定方向上衍射X射线，产生衍射图案，从中可以得出电子密度图。然后将原子级结构建模为电子密度图。 X 射线晶体学可以适应一定范围的结构尺寸，并且通常可以实现 < 3 Å 分辨率，这是实现基于结构的设计的粗略阈值。还可以使用 X 射线晶体学捕获低亲和力配体或片段的结合事件，这对于支持基于片段的药物发现中的命中确认和后续工作很有价值。此外，数十年的技术改进已经使这种方法变得成熟，可以在几分钟内解析出新的蛋白质配体结构，从而能够跟上药物化学设计和合成周期。 另一方面，从 X 射线晶体学获得的结果并不总是可信或不能提供完整的信息。假阳性伪影可能涉及配体稳定在两个蛋白质拷贝的（可能）非生理相关界面处。在晶体浸泡过程中可能会出现假阴性伪影，其中结合位点被人为地封闭在预形成的蛋白质晶体中。最后，相对静态的蛋白质晶体可能无法揭示配体结合时发生的构象变化的全部程度。 利托那韦(Ritonavir)，X射线晶体学引导药物设计最早的成功范例之一。 X射线晶体学过程中的一个主要障碍仍然是产生有序的晶体，这对于跨膜或本质上无序的蛋白质和多蛋白复合物来说尤其困难。此外，由于 X 射线强度的必要增加，极小的晶体会遭受辐射损伤。克服这一问题的一种方法是采用带有 X 射线自由电子激光器的串行飞秒晶体学(SFX)。   一些创造性的解决方案使得利用配体膜蛋白进行 X 射线晶体学分析成为可能。例如， Sosei Heptares 采用基于分子进化的技术来生成具有增强的 SBDD 稳定性和结晶性的 GPCR 变体。Kyowa Kirin 的科学家发现的另一个解决方法是使用抗体 Fab 区域来稳定配体结合的 GPCR，这使他们能够确定高达 3 Å 分辨率的结构。 X 射线晶体学、 NMR 和冷冻电镜一起构成了研究蛋白质-配体相互作用的三种最流行、最可靠的生物物理技术（图 2）。 图 2. 每年发布的 PDB 结构数量图（ PDB数据库），说明了 X 射线晶体学、NMR 和冷冻电镜技术对发现新颖结构和结合位点的影响。 X射线晶体学的持续局限性，例如膜蛋白的溶解度普遍较差、蛋白质的灵活性以及翻译后修饰蛋白质的化学异质性，促使科学家们探索其他方法。其中尤其包括冷冻电镜，因为其通常可实现的分辨率已接近 X 射线晶体学的分辨率。事实上，目前用于确定完整膜蛋白和大型多结构域蛋白及复合物结构的首选方法是冷冻电镜。然而，X 射线晶体学仍然是对较小蛋白质或大蛋白质的较小结构域进行精确结构表征的非常有价值的方法。如前所述，其在解决蛋白质-配体复合物结构方面的快速通量是另一个关键优势。 2. 低温电子显微镜 (cryo-EM) 冷冻电镜是一种补充 X 射线晶体学和核磁共振的生物物理方法。这项技术可能是生物物理方法三合一中最新的技术，直到20 世纪 90 年代末才出现。 主要优点：能够处理大型、柔性或跨膜生物靶标；可提供支持设计的 < 3 Å 分辨率 主要缺点：仅限于大蛋白质和蛋白质复合物（120 kDa以下很难，50 kDa以下目前认为不可能）；采用多种构象状态的柔性蛋白质无法通过单个颗粒进行评估（例如，IgSF 蛋白质）；需要严格优化样品制备 冷冻电镜是 X 射线晶体学和核磁共振的补充，因为它可用于解析其他方法不易处理的结构，例如大型多亚基蛋白质。与 NMR 一样，通常不需要结晶，从而避免了 X 射线晶体学中最具挑战性的步骤。结晶对于最近开发和流行的MicroED技术是必要的，该技术可以解析微米或纳米尺寸晶体的配体蛋白质结构。 在冷冻电镜中，电子束射向配体结合蛋白的冷冻溶液网格。对获得的随机取向的蛋白质-配体复合物的放大图像进行分类以生成 2D 模型，然后将其重建为 3D 模型。改进图像处理、样品处理和探测器技术等关键因素预计将提高冷冻电镜的通量和结构质量。冷冻电镜目前正在经历一场“分辨率革命”，可以解析低于 3Å 分辨率的结构，并且更容易识别小分子-蛋白质相互作用。Astex Pharmaceuticals等一些公司已对该技术进行了大量投资，以支持其药物发现计划。 冷冻电镜可用于识别大型蛋白质复合物上的结合位点，例如构象灵活的 336-kDa GDH酶或 20S 蛋白酶体。Genentech 的科学家报告了他们使用冷冻电镜来研究新型 TRPA1 离子通道抑制剂的结合位点和作用机制，其中一种 ( GDC-6599 ) 已进入 II 期研究。冷冻电镜用于解析与同源四聚复合体跨膜受体（> 500 kDa）的一种化合物的结构，该结构为药物设计提供了关键见解。对非活性构象中的冷冻电镜配体-受体复合物与先前解析的活性构象的比较表明，配体充当“分子楔(molecular wedge)”。结合时，配体可防止附近的接头伸直，而这是受体呈现其活性构象所必需的。来自同一项目的结构不同的化合物 GDC-0334，冷冻电镜也被用来了解其作用机制。 冷冻电镜研究支持 Genentech 发现了一流的 TRPA1 离子通道抑制剂 GDC-6599，该药物目前正在进行 II 期临床试验。 小且灵活的蛋白质仍然对冷冻电镜提出挑战。此类蛋白质可能需要通过与其他分子（如抗体或纳米抗体）结合或成为较大蛋白质复合物的一部分来稳定。随着技术的成熟，适合解析冷冻电镜结构的蛋白质大小的下限已稳步降低。目前小于 70-80 kDa 的蛋白质更适合 X 射线晶体学。 冷冻电镜的其他的局限性包括构建模型所需的时间较长，以及在电镜密度中精准地定位小分子的挑战。在 X 射线晶体学中，结构一部分模型构建的逐步改进提高了整个电子密度的质量，因此配体和未建模片段的电子密度不断提高。不幸的是，冷冻电镜却并非如此。显然，这项技术还有很大的改进空间。 3. 配体竞争分析 竞争测定是根据测试配体和已知配体之间观察到的竞争类型推断配体结合位点的方法。 主要优点：在某些情况下，可能需要对现有常规检测进行最小程度的调整；可以使用水溶液中靶点；可以使用细胞裂解物中的内源蛋白；如果竞争配体在功能上相关，则可以确认结合模式在功能上的相关性 主要缺点：不能直接提供结合位点的结构信息；不揭示配体结合模式；已知配体需要具有已建立的结合位点并且可能需要进行标记；结果的解释可能不准确 两个配体之间的竞争（其中一个配体具有已知的结合位点）可以让实验者推断结合是否发生在共享位点或独特结合位点。然而，如果两个配体竞争结合，则不一定保证相同位点结合，因为竞争性配体不一定结合在相同位置。结合到不同位点的配体经常会引起蛋白质构象变化，从而影响远程位点的配体结合（例如，变构竞争性抑制）。 使用此方法测试有多种方案。具有已知结合位点的配体可以被“标记”，例如通过荧光标记或放射性标记，以实现读出。未标记的配体也可与亲和选择质谱、 NMR或SPR一起使用。核磁共振已成为研究含氟“间谍(spy)”分子与在同一位点结合的其他配体的竞争的简单方法。SPR 尤其常用于工业中的竞争实验。 对于酶靶标，动力学测定可以提供丰富的信息。如果酶抑制剂被证明与底物具有竞争性，则它可以靶向活性位点。一种传统方法是 Lineweaver-Burk 作图分析，其中绘制抑制剂浓度的倒数与反应速率的倒数的关系图。或者，分析可以利用Dixon作图，其中抑制剂浓度与反应速率的倒数作图。该技术用于表征竞争性和反竞争性抗菌 FabI 抑制剂(10.1021/jm300489v)。 葛兰素史克 (GSK) 报告发现了第一个 ATP 竞争性驱动蛋白纺锤体蛋白 (KSP，Kinesin Spindle Protein) 抑制剂(10.1021/jm070435y)。在其发表之前，仅报道了 KSP 的变构抑制剂，并且已知这些抑制剂容易受到耐药突变的影响。研究人员推断，靶向别构结合位点可以解决这一耐药性问题并赋予新的药理学作用。他们的新化合物的抑制模式通过 Lineweaver-Burk 图分析确定，并且表明示例性化合物与 ATP 具有竞争性，但与微管不具有竞争性。这与之前的变构抑制剂不同，后者与 ATP 不竞争，与微管也不竞争。 4. 核磁共振 (NMR) NMR 是一种生物物理方法，可补充 X 射线晶体学和冷冻电镜。从 20 世纪 80 年代末开始，NMR 解析的结构一直保存在 PDB 数据库中，现在该技术通常用于研究蛋白质-配体相互作用。 主要优点：可使用水溶液中的靶点；可以计算相互作用和动力学测量的 KD；可同时监测多种化合物；适合无序蛋白质或具有无序区域的蛋白质 主要缺点：某些实验需要同位素蛋白标记和/或蛋白大小 < 30 kDa 配体和蛋白质观察核磁共振实验产生有关蛋白质-配体相互作用的原子级信息。这些实验系列的一个共同特征是自由态和束缚态之间可观察的 NMR 参数（例如化学位移）的扰动。在观察 配体的NMR，包括STD、WaterLOGSY、transferred NOESY 或R2KD等实验可以提供有关配体结合模式的信息，并在某些情况下（但并非总是如此）能够计算 KD。在观察蛋白质 NMR 中，通过构建 HSQC 等实验生成的化学位移图，可以得出结合位点的粗略图片。检测蛋白质 NMR 的缺点包括在蛋白质大小 > 10 kDa 的情况下需要特殊标记（例如13 C、 15 N）蛋白质，以及由于标记和共振分配问题而对蛋白质大小的实际限制为 30 kDa。 由于 NMR 对弱的毫摩尔级KD结合配体具有敏感性，因此适合片段筛选，并支持多种临床阶段和已批准药物的发现。也许最著名的例子来自 Abbott 的科学家，他们开发了一种基于 NMR 的构效关系分析的新技术，该技术有助于他们发现BCL-2 抑制剂 Venetoclax (10.1126/science.274.5292.1531)。 NMR SAR构效关系是一种观察蛋白质的 NMR 方法，首先找到一个有希望的结合片段，然后在第一个片段达到饱和浓度的情况下筛选其他片段。以这种方式，可以发现第二位点结合物，其可以连接到第一片段以产生更高亲和力的双齿化合物。NMR SAR 的开发是基于片段的药物设计技术的开发和采用的一个重要事件，并且仍然是药物发现科学家的一个鼓舞人心的故事。 5. 共价标记 共价标记包括各种化学生物学方法，这些方法在与生物靶标孵育后检测反应性探针的结合。通常，MS 检测和肽图谱用于确定哪些残基被共价探针或感兴趣的共价配体共价修饰。共价探针和感兴趣的配体之间的竞争实验可以验证结合位点。 主要优点：灵活性，可以设计蛋白质或探针来实现该方法；可以使用水溶液；可以使用来自细胞和细胞裂解物的内源蛋白 主要缺点：没有揭示配体结合模式；只提供不完整的结合位点图片；仅适用于可以发生共价修饰的结合位点（例如，存在 Cys、Lys、Ser 等） 在该技术中，反应性探针分子与生物靶标一起孵育，然后通常通过质谱和肽图谱来鉴定标记的氨基酸。然后需要生成配体在该位点的结合模式的工作模型。 Sunesis Pharmaceuticals 的研究人员此前详细介绍了他们的“束缚方法(tethering method)”，其中针对含有天然或引入的半胱氨酸的目标蛋白质筛选半胱氨酸反应性小分子库。孵育和反应后，质谱分析揭示了反应性半胱氨酸的位置，甚至是潜在的可配位口袋的位置。 KRAS G12C抑制剂的首先是通过共价探针实验发现的。加州大学旧金山分校的研究人员率先报道了针对 KRAS G12C中半胱氨酸 12 的共价抑制剂如何将该酶捕获在非活性、GDP 结合状态。Amgen 和 Carmot 的科学家筛选了包含 3,300 个成员的亲电子化合物库与 GDP 结合的 KRAS G12C，以找到与该残基发生反应的共价抑制剂。这些化合物在多种测定中进行了评估，包括测量酶功能失活的生化测定，以及确认G12C 处共价加合物形成的基于质谱的测定。X 射线晶体学显示，他们新发现的抑制剂可进入附近的隐秘口袋，这与之前报道的抑制剂不同。利用这一特性来获得效力并改善药物特性。通过这种方式，快速找到了针对所需结合位点的化学起点，从而为 sotorasib 的发现铺平了道路。 安进 (Amgen) 的 KRASG12C 抑制剂 sotorasib（右）的发现涉及以共价标记为中心的筛选，及命中分子（左）。 6. 光亲和标记 光亲和标记是一种化学生物学方法，可在与生物靶标孵育并随后照射后检测光反应探针的结合。标记的蛋白质残基通常通过 MS 检测和肽图谱来确定。 主要优点：可用于结合位点缺乏亲核残基的蛋白质；可以使用水溶液；可以使用来自细胞和细胞裂解物的内源蛋白 主要缺点：没有揭示配体结合模式；只提供不完整的结合位点图片；可能需要付出大量努力才能找到合适的探头；一些光活化波长可能破坏蛋白质 在该技术中，将带有光激活基团的已证实活性的配体与生物靶标一起孵育，并进行照射以诱导探针激活并与附近的蛋白质残基发生反应。然后将标记的蛋白质提交以通过质谱和肽图谱鉴定光标记的蛋白质残基。 该方法应用的一个例子来自卫材对天然产物pladienolide的靶点识别和结合位点定位。他们的新型光亲和探针将剪接复合物 SF3b 识别为靶标，同时将结合位点缩小到亚基 SF3B3 和 SF3B1 之间的区域。H3 Biomedicine 后来的冷冻电镜研究揭示了由亚基 SF3B1 和 PHF5A 组成的口袋中存在 pladienolide 的结合位点，其中 SF3B3 位于光亲和部分结合的位置附近。 卫材使用光亲和探针来确定感兴趣的靶标和天然产物pladienolide的结合位置。 光亲和标记方法已应用于阐明小型弱结合配体的结合位点，例如HSAF 中的异丙酚(propofol)、 Munc13-1 中的乙醇、以及最近ANXA2 中的 PY-60 。 麻醉剂异丙酚（左）及其相应的光亲和探针 AziPm（右）。这说明了光亲和探针设计中的一个重要考虑因素，即光反应部分的正确放置，以避免光活化后的分子内反应。 安进科学家报告称，利用光亲和标记实验找到了一系列新型有丝分裂驱动蛋白 KIF18a 抑制剂的结合位点。他们的结合位点测定不仅用于理性设计和指导 SAR分析，还假设了一个工作模型，说明抑制剂如何将 KIF18a 捕获在微管上并阻止其滑动。辉瑞公司的研究人员使用源自γ-分泌酶调节剂的光亲和探针来识别和区分活性γ-分泌酶复合物内的结合位点。 在 ACS-EFMC 2023 会议上，Jnana Therapeutics 重点介绍了他们的RAPID 平台，用于在表达内源靶标的活细胞中进行命中识别（ WO2021076680 ），该平台基于化合物库的光反应探针竞争。该平台的优点之一是可以立即推断出命中分子的结合位点。 普林斯顿大学和默克公司的研究人员最近开发了一种创造性的方法来增强单个标记实验产生的信号。与传统的标记实验不同，目标配体不与所研究的蛋白质共价结合。相反，配体与铱光催化剂结合，催化附近的二氮丙啶试剂转化为卡宾，与结合位点附近的残基发生反应。该方法的催化性质导致多个标记事件，使结合位点周围的区域充满共价标签。该技术的分辨率相对粗糙，各种测试案例显示标记残基通常在已知结合位点的约 20 Å 范围内。 7. 突变分析和定点诱变 在传染病和肿瘤学中，赋予药物抗性的突变通常会暴露感兴趣的靶标和结合位点。定点诱变是一种生化方法，可以通过突变残基来推断结合位点并评估对配体结合的影响。 主要优点：是与生物物理方法互补的方法；可以使用水溶液 主要缺点：不提供结合位点的完整图谱；不揭示配体结合模式；突变对蛋白质可能有意外影响 如果结合位点中的残基发生突变，预计会显著改变配体结合亲和力。如果发生这种情况，配体可以对接到假设的结合位点以生成工作模型。 通常，可能与配体相互作用的残基突变为丙氨酸（称为丙氨酸扫描）。然而，当丙氨酸突变不能重现活性蛋白或破坏其二级/三级结构时，就会出现问题。由于这些原因，通常会合理选择突变以试图保留结构（例如，半胱氨酸变为丝氨酸，谷氨酸变为谷氨酰胺）。另一个潜在的解决方案是将假设的结合位点残基从人类蛋白质中发现的残基转换为其他物种中的残基。武田 (Takeda)研究 CENP-E 抑制剂的研究人员演示了该解决方案。在分析化合物以测试其结合位点假设之前，他们的突变蛋白保持了与野生型相似的催化活性。 武田CENP-E抑制剂 8. 氢/氘交换 (HDX) 和化学/水解稳定性分析 氢/氘交换(HDX) 是一种生化方法，可测量暴露于氘化环境后蛋白质靶标骨架酰胺中氢 ( 1 H) 与氘 ( 2 H) 的交换。理论上，与靶标蛋白质结合的配体应该影响结合位点的这种交换，从而产生可观察到的质量差异变化。有几种基于类似原理的相关方法，即特异性结合的配体应增加靶标的稳定性或在暴露于某些试剂时保护感兴趣的结合位点。这些其他方法采用变性剂和活性物质（例如， SPROX 、羟基自由基印迹、卡宾印迹）或蛋白水解酶（例如， DARTS 、 LiP-MS ）。 主要优点：可以提供结合位点以外的构象变化的附加信息；可以使用水溶液；可以使用来自细胞和细胞裂解物的内源蛋白 主要缺点：不能揭示配体结合模式；有时不太适合阐明结合位点；对于特定的蛋白质类型可能具有挑战性（例如，高度糖基化） HDX 的基础是，当暴露于氘化环境（即 D2O）时，目标蛋白的骨架酰胺可以将氢交换为氘，并且可以停止此交换过程以允许 MS 检测和肽图谱 (NMR)，以显示发生氘化的地方。结合配体周围的区域通常显示出酰胺主链质子交换速率相对于较远区域的差异。尽管该方法不受蛋白质大小的限制并且可以使用天然状态蛋白质进行，但它只能提供结合位点的氨基酸水平分辨率。 虽然 HDX 最常用于大分子的表位作图，但越来越多的例子将其应用于小分子结合位点识别。在HDX-MS 2022会议上，默克科学家描述了他们使用 HDX 来揭示临床研究的 NLRP3 抑制剂 MCC950 在蛋白质 Walker A 基序中的结合位点。这一发现与基于药物亲和力响应靶稳定性 (DARTS)测定的文献报告提出的 Walker B 基序中的结合位点不一致。默克通过X 射线晶体学（PDB：7ALV ）和冷冻电镜结构（PDB：7PZC ）得到证实(10.1038/s41589-019-0277-7)。 NLRP3 中 MCC950 结合位点首先通过 HDX 确定，随后通过 X 射线晶体学和冷冻电镜证实。 研究人员使用HDX 定位 AMPK 上的激活剂结合位点。后来的 X 射线晶体学研究证实了这一发现，并显示配体与一个新的变构位点结合(10.1016/j.str.2013.08.023)。这一系列方法的一个主要挑战是它们无法区分化合物结合的直接影响与长程变构变化引起的扰动。因此，受保护的蛋白质区域不能自动假定为结合位点。 9. 天然质谱分析 天然质谱是一种生物物理方法，可以通过在气相中保留非共价蛋白质-配体复合物来揭示蛋白质上的配体结合位点，同时使蛋白质主链容易断裂。结合位点通过产物离子的分析揭示（例如，保留结合配体的肽片段）。 主要优点：可使用水溶液；可以使用细胞裂解物中的内源蛋白；样品消耗量低（即每次实验使用皮摩尔蛋白质）；允许计算蛋白质-配体亲和力和化学计量 主要缺点：已知配体在气相时会迁移通过蛋白质；通常观察到非特异性配体-蛋白质相互作用；变性条件和裂解效率之间的平衡；不能揭示配体结合模式；提供了不完整结合位点 通过使用“更温和”的电离技术（通常是 ESI），可以通过天然质谱法检测配体结合位点，与典型的质谱实验相比，该技术包括更温和的电压、温度和 pH 值的组合。温和的条件允许感兴趣的蛋白质以或多或少的天然构象生存，即使在气相中也是如此——尽管情况是否属实存在争议。由于真空中疏水相互作用的减弱和静电相互作用的加强，预计蛋白质的一些变性和配体结合的变化会在气相中发生。 研究报告称，使用 ESI-MS 和 ECD 将 α-突触核蛋白上精胺的结合位点缩小到 C 末端区域。他们提出的结合区域与同一系统的核磁共振研究确定的结合区域一致(10.1021/ja063197p)。 使用该技术确定奥沙利铂在泛素上的结合位点残基。选择泛素是因为它可以作为模型蛋白质，并且该方法在检测可能的结合位点方面的成功可能有助于金属药物-蛋白质复合物的未来研究。作者指出，天然 MS 是一个合适的选择，因为酶消化可能会破坏所研究的金属药物-蛋白质相互作用(10.1007/s00216-011-5523-0)。 天然质谱分析可以定位一线癌症化疗药物奥沙利铂在泛素上的结合位点。 10. 计算建模方法 各种计算方法使用根据已知结合位点特征进行训练的软件程序来预测新配体的结合位点。 主要优点：方便；快速见效；进入门槛低；成本相对较低 主要缺点：提供了必须通过实验验证的预测；可能不太适合某些靶标类别；高误报率 该技术的门槛较低，可以快速检测所提供的感兴趣靶标模型上的预测结合位点。计算方法的一个好处是结果中可以包括结合位点配体性的评估（即所有预测位点之间的排名或分数），甚至配体药效团特征的视觉映射。在工业药物发现项目中，通常使用这些结合位点预测来指导 SAR 研究或虚拟屏幕。 这种方法的一个例证来自武田 (Takeda) 的 CENP-E 抑制剂的早期示例。与变构位点结合的新型抑制剂的工作模型后来通过定点诱变研究得到证实。 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓