FBXO5

引言 P body小体（PB）是广泛存在于真核生物细胞中的核糖核蛋白（RNP）颗粒 ，其中含有各种参与翻译调控和RNA降解的RNA结合蛋白（RBP）和RNA分子，但是在细胞周期中PB的内含物如何变化以适应细胞需求仍不清楚。 近日，来自法国索邦大学的Dominique Weil和Adham Safieddine（第一作者兼共同通讯）研究团队在Molecular Cell上发表题为Cell-cycle-dependent mRNA localization in P-bodies的文章，发现PB中的RNA分子随着细胞周期是高度动态化的，但并不随着细胞质中的RNA一起变化，mRNA的PB定位是由RBP和RNA特征调控的。 研究人员首先观察了在细胞周期中PB的形态变化，发现从G1到G2期PB体积变大，接下来他们从不同细胞周期的细胞中分离纯化了PB并进行了蛋白质组分析检测其内含物，发现主要的PB蛋白随着细胞周期并不发生变化。然后他们通过RNA-seq检测了其中的RNA成分，发现PB中的RNA随着细胞周期是高度动态化的。进一步他们分析了PB中RNA的表达水平和其在细胞质中的表达水平，发现二者是部分非偶联的。接下来他们用单分子荧光原位杂交（smFISH）进行验证，在PB和细胞质中FBXO5转录本在G1S和S中期达到峰值，只不过在PB中表达量显著更高，在PB和细胞质中CLK1转录本随着细胞周期逐渐降低，在G2M期达到峰值。 接下来他们主要关注那些在G2期具有明显细胞质上调的mRNA，TOP2A的mRNA在细胞质中表达量很高，而在PB中没那么高，但是在某些细胞中大量TOP2A的mRNA在PB中累积，而在细胞质中几乎没有。他们分析发现那些具有高RNA表达和低PB定位的细胞对应G2期细胞，这时该蛋白需求量较大，因而高度表达。他们猜测在有丝分裂之后，G1早期时，残余的TOP2A mRNA会被运送到PB中，通过实验发现，在S和G2期细胞中TOP2A mRNA水平很高，但是定位在PB中的并不多，而G1期细胞具有两种模式，要么是极少要么是中度的TOP2A表达，但是在PB中明显累积。因此，细胞在退出有丝分裂之后PB会捕获一部分mRNA。 他们还利用高通量smFISH检测了细胞周期中的RNA定位，选择了94个mRNA进行检测，发现一部分要在有丝分裂到G1期转变的时候降解的mRNA会在G1期时累积在PB中。接下来他们搜索了可能影响mRNA定位的RBP，发现HuR-ARE互作会影响G2期mRNA定位于PB。然后他们分析了可能导致PB定位的mRNA特征，发现G1中期时PB中富集的mRNA特别长，并且这种长度差异主要是由于编码区域导致的。于是他们转染了不同长度的RLuc，发现如果RLuc的CDS由0.9kb延长到1.7-1.8kb会导致其在G1早期细胞的PB中显著累积更多。因此，RNA长度是导致G1期细胞PB中mRNA累积的一个关键因素。 P小体内的mRNA随细胞周期变化（Credit: Molecular Cell） 总的来说，这项研究揭示了细胞周期中PB内RNA的变化，说明PB不仅仅只是一个储存过量未翻译的mRNA的场所。 参考文献 https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.09.011 责编|探索君 排版|探索君 来源|BioArt End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

1DNA双链断裂（DSB）修复途径合成致死性是诱导细胞死亡的生物过程，其基于同时抑制在细胞存活所需的过程中的两种途径并行作用，仅抑制一种途径会导致细胞存活。合成致死策略已在抗癌治疗中得到广泛应用。由于一种途径可能由于转化相关变化而在癌细胞中失活，因此靶向另一种途径触发细胞死亡，同时保留健康细胞1。癌细胞的关键特征之一是由DNA损伤的积累，包括DNA双链断裂（DSB），这是细胞中最致命的DNA损伤之一。然而，癌细胞能够通过调节其DNA修复途径存活和增殖，这可能与正常细胞中的DNA修复途径不同1。DSB可以通过两种主要机制进行修复：BRCA1/2介导的同源重组（HR）和典型 DNA-PKcs介导的非同源末端连接（c-NHEJ）（图1）1。HR被认为是一种准确的DSB修复途径，因为它依赖于细胞周期S/G2期细胞的姐妹染色单体作为DNA合成和DSB修复的模板。因此，HR能够修复DSB，主要在增殖细胞中1。HR修复途径由两个经典的肿瘤抑制基因BRCA1和BRCA2编码的蛋白质进行全面调节，然后募集RAD51及其旁系同源物（包括RAD51B，RAD51C，RAD51D，XRCC2和XRCC3）和RAD54以识别同源DNA模板并进行链侵袭以修复DSBs。另一方面，NHEJ是一种容易出错的DSB修复机制。NHEJ可以是分为c-NHEJ和a-NHEJ（也称为MMEJ或TMEJ）两种途径1。图1. DNA双链断裂（DSB）修复途径包括同源重组（HR），规范非同源末端连接（c-NHEJ）和替代非同源末端连接（a-NHEJ）/微同源介导的末端连接（MMEJ）/DNA聚合酶θ（Polθ）介导的末端连接（TMEJ）2PARPi在造血恶性肿瘤中的治疗潜力最近的很多研究表明，即使在白血病中很少检测到BRCA1/2突变，PARP抑制剂（PARPi）诱导的合成致死性也可以有效地在 BRCA1/2 缺陷造血恶性细胞中起作用。此外，诱导造血恶性肿瘤的遗传改变，例如驱动骨髓和淋巴恶性肿瘤的癌基因，包括 AML1-ETO（也称为 RUNX1-RUNX1T1）、BCR-ABL1、PML-RARa、TCF3-HLF、IDH1/2mut和IGH-MYC以及肿瘤抑制基因（例如TET2、WT1）的功能缺失突变可导致HR和/或c-NHEJ活性失调，从而使细胞容易受到PARPi引发的合成致死效应的影响（图2和图3）1。图2. PARP抑制剂在造血恶性肿瘤和其他显示癌基因/突变（A）和酪氨酸激酶抑制剂（B）诱导的HR/c-NHEJ缺乏症的肿瘤中的应用此外，Bac等人描述了那些恶性造血细胞表达致癌酪氨酸激酶 （OTK）（例如 BCR-ABL1、FLT3（ITD）、JAK2（V617F））由于ROS产量增加自发积累高水平的氧化DNA损伤和DSB 1。然而，OTK阳性细胞能够逃逸来自 DSB 的细胞毒性作用，这是由于增强/调节的 DSB 修复。FDA批准的特异性酪氨酸激酶抑制剂（TKi）（JAK1/2抑制剂鲁索利替尼，FLT3抑制剂奎扎替尼，ABL1抑制剂伊马替尼）对这些OTK的抑制导致急性HR / c-NHEJ缺乏症（由于BRCA1，BRCA2，RAD51和/或LIG4的下调）和对PARPi的敏感性（图2-4）。因此，TKi和PARPi的联合使用能够根除增殖和静止的恶性造血干细胞和祖细胞1。图3. 诱发HR / c-NHEJ缺乏症的癌基因/突变图4. 诱导HR/c-NHEJ缺乏的治疗药物3对PARPi的获得性耐药机制尽管 PARPi 在 DSB 修复缺陷的癌细胞中具有很强的效力，但在BRCA1/2 缺陷和 HRD 中已经报道了对 PARPi 诱导的合成致死性的抵抗力肿瘤细胞（图5）。PARPi的耐药性的主要原因是BRCA1/2突变癌细胞HR修复活性的恢复2。详细地说，BRCA1/2中的继发突变与原始突变导致的链终止子/移码的废除有关，导致全长 BRCA1/2 开放阅读框的恢复。因此，活性BRCA1/BRCA2蛋白表达被恢复，从而重新启动功能齐全的HR途径3,4。除了BRCA1/2中其他突变介导的耐药性外，还提出了BRCA1启动子甲基化的减少/丧失，从而恢复了BRCA1的表达而导致对PARPi的耐药性5。图5. 对PARPi的获得性耐药机制BRCA1-BRCA2-RAD51轴对于同源重组修复（HRR）至关重要。EMI1调节三阴性乳腺癌（TNBC）细胞中的 PARPi 敏感性。EMI1的F盒结构域组装一个SCF泛素连接酶复合物，该复合物靶向RAD51进行降解。在一部分对PARPi难治的BRCA1缺陷三阴性乳腺癌细胞中，EMI1表达的降低会损害EMI依赖性RAD51的降解，从而恢复HR修复活性导致对PARPi的耐药性（图6）6。图6. KEAP1的增加导致EMI1表达的降低导致对PARPi的耐药机制EMSY是I型干扰素反应的负调节因子，也抵消了HR修复途径，KEAP1靶向EMSY进行泛素介导的降解。因此，KEAP1的过表达破坏了EMSY的稳定性，导致HR恢复和对PARPi的抵抗。相反，由于基因突变引起的KEAP1失活导致EMSY的稳定和HR缺乏而使得非小细胞肺癌对PARPi变得敏感（图7）7。图7. EMI1表达的降低导致EMSY的减少，从而对PARPi的耐药机制PARP1的下调或者突变都可能导致BRCA1/2缺陷肿瘤细胞中的PARPi耐药性（图5）。通过53BP1-RIF1的复合物，53BP1介导的DSB末端切除术抑制导致c-NHEJ活性增强，减少对PARP1依赖性a-NHEJ的依赖性，从而引起PARPi耐药性8.因此，53BP1在BRCA1-null小鼠胚胎干细胞中的抑制促进DSB末端切除以限制c-NHEJ，从而使细胞对PARPi致敏。在BRCA1突变的乳腺癌细胞中，由于HR修复活性的部分恢复，53BP1的体细胞丢失导致奥拉帕尼耐药，从而降低BRCA1缺陷小鼠乳腺肿瘤对该抑制剂的反应（图5）。53BP1定位于DSB的阻断也有助于BRCA1缺陷肿瘤中PARPi的失活，这是由TIRR表达增加介导的9。SHLD1/2/3复合物的失活以及DSB末端切除术中其他蛋白（包括RIF1和REV7）的表达降低，恢复了HR的功能活性，降低了PARPi的疗效（图8）10。以相同的机制方式，TRIP13是SHLD1 /2 /3复合物的负调节因子，通过解离REV7-SHLD1/2/3去促进HR。因此，TRIP13的扩增诱导BRCA1/2突变癌症对PARPi的耐药11。图8. SHLD1/2的敲除在BRCA1敲除细胞中导致对PARPi的耐药机制除了在HR通路中起作用外，据报道，BRCA1和BRCA2在维持复制分叉的完整性方面发挥作用12。在BRCA1和BRCA2缺陷细胞中对PARPi获得性耐药可能是由于EZH2缺失导致MRE1和MUS81核酸酶表达降低，导致对复制叉的保护性反应（图9）12,13。图9. MRE1、MUS81和EZH2的下调导致对PARPi的耐药机制除了基于恢复HR或复制叉保护的获得性PARPi抗性机制之外，最近的一项研究报告称，通过恢复Okazaki片段处理（OFP）减少/丢失DNA复制间隙可以诱导抗性。基本上，据报道，复制间隙是BRCA1/2缺陷细胞中PARPi反应的主要决定因素。一般来说，BRCA1/2的缺乏会扩大复制间隙，导致细胞的PARPi敏感性1。然而，在同时敲除BRCA1和53BP1的细胞模型中，通过恢复XRCC1-LIG3恢复OFP，导致减少/耗尽复制差距，并最终对PARPi产生抵抗力。相反，双倍敲除53BP1和LIG3使BRCA1突变细胞对PARPi重新敏感（图10）14。图10. XRCC1-LIG3的增加恢复OFP对PARPi产生耐药性4预先存在的 PARPi 耐药性机制HR和/或c-NHEJ缺陷的血液系统恶性肿瘤在模拟外周血微环境（PBM） 的条件下对PARPi介导的合成致死性敏感，在模拟骨髓微环境（BMM）的条件对 PARPi 产生抗性。Bac等人表明转化生长因子β1（TGF-1）由骨髓基质细胞产生的激活缺氧诱导的TGF-受体（TGF R）激酶-SMAD2/3在白血病细胞中的规范途径以促进DSB的修复（图11）1。TGFβR激酶抑制剂没有改变白血病细胞对PBM中PARPi的敏感性，表明DSB修复活动中TGFβR-SMAD3信号传导的调节在BMM中是排他性的。在机制上，TGFβR激酶信号通过BRCA1/2、ATM，DNA-PKcs和LIG4的上调刺激BMM中白血病细胞中DSB的修复。这一发现表明TGFβR激酶抑制剂在PARPi介导的造血恶性肿瘤干预中的潜在临床应用。事实上，TGFβR激酶的抑制剂galunisertib已经在临床上几种癌症的试验得到应用 15,16，恢复了BMM中白血病细胞的PARPi敏感性。因此，Bac等人假设在PARPi治疗中加入galunisertib应该改善治疗效果1。图11. 通过在缺氧骨髓微环境中激活TGF-β1—TGFβR—SMAD2/3信号传导，恢复HR/c-NHEJ缺陷白血病中的HR/c-NHEJ的PARP抑制剂耐药的预先存在机制除此之外，还有一些其它预先存在的对PARPi的耐药机制，比如DNMT3A的突变导致功能丧失，FLT3激酶与ITD融合突变导致FLT3激酶激活，JAK2的V617K突变导致JAK2激酶的激活，c-KIT的N822K突变导致c-KIT激酶的激活，EGFR的激活和IGF-1R的激酶等都可能导致预先存在的PARPi抑制剂的耐药（图12）1。图12. 预先存在的 PARPi 耐药性机制5小结鉴于负责PARPi耐药性的机制途径列表不断增加，必须实现对预先存在和获得的PARPi耐药的药理学抑制，以提高PARPi介导的合成的治疗效率杀伤力。例如，白血病细胞中预先存在的PARPi耐药性可以通过联合PARP和TGFβR激酶抑制剂（使BMM中的白血病细胞再敏化）、PARP和TET2双加氧酶抑制剂（使携带DNMT3A突变的白血病重新致敏）以及PARP和OTK抑制剂（FLT3（ITD）、JAK2（V617F）、c-KIT（N822K）、EGFR、IGF-1R）解决。获得性 PARPi 抗性可通过以下方式预防，如更具侵略性的“双重合成致死”方法（同时靶向PARP1和RAD52），可在更短的时间内消除更多的肿瘤细胞，从而减少抗性克隆出现的时间依赖性的机会。此外，如果 PARPi出现耐药性，这些克隆可以通过抑制另一种DNA修复机制来消除，例如Pol介导的TMEJ 17。参考文献：1.Bac Viet Le, Paulina Podszywałow-Bartnicka, Katarzyna Piwocka, and Tomasz Skorski, Pre-Existing and Acquired Resistance to PARP Inhibitor-Induced Synthetic Lethality, Cancers 2022, 14, 5795.2.Quigley, D.; Alumkal, J.J.; Wyatt, A.W.; Kothari, V.; Foye, A.; Lloyd, P.; Aggarwal, R.; Kim, W.; Lu, E.; Schwartzman, J.; et al. 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