Aldafermin

本文系统阐释莫诺苷（Morroniside，山茱萸来源的环烯醚萜苷）抗肝纤维化药效与完整分子机制。研究构建四氯化碳（CCl₄）中毒型、GAN 饮食诱导代谢性两种经典小鼠肝纤维化体内模型，结合人肝组织样本、人肝星状细胞 LX-2、原代小鼠肝星状细胞（HSCs）体外体系，运用转录组、DARTS、分子对接、SPR、Co-IP、AAV 体内基因干预等多层次技术，证实莫诺苷直接靶向酰基磷酸酶 1（ACYP1），抑制 E3 泛素连接酶 HERC2 介导的核受体辅激活因子 4（NCOA）泛素化降解，上调 NCOA4 蛋白水平，激活 HSCs 中铁自噬（Ferritinophagy）并诱发铁死亡（Ferroptosis），抑制 HSCs 活化、减少细胞外基质（ECM）大量沉积，最终逆转肝纤维化。ACYP1 过表达或 NCOA4 敲低可完全抵消莫诺苷的抗纤维化作用，确立ACYP1/HERC2/NCOA4轴为莫诺苷核心作用通路。该研究首次揭示 ACYP1 在肝纤维化中的病理作用，为天然保肝中药活性成分开发提供全新靶点与机制依据。 一、研究背景与科学问题 肝纤维化是各类慢性肝病（病毒性、代谢、中毒、自身免疫性肝病）共有的可逆病理阶段，核心特征为持续肝损伤下肝星状细胞（HSCs）活化，大量分泌 Ⅰ、Ⅳ 型胶原等 ECM，最终进展为肝硬化、肝细胞癌，全球年死亡超百万例。当前临床抗纤维化药物研发存在明显瓶颈：Ⅲ 期临床药物（Selonsertib、Aldafermin）疗效有限，仅约 1/3 代谢相关脂肪性肝炎（MASH）患者对司美格鲁肽、Resmetirom 应答，尚无获批专用抗纤维化药物，亟待发掘天然产物新型干预靶点。 活化 HSCs 是肝纤维化核心效应细胞，静息 HSCs 富含铁离子；铁稳态失衡、游离 Fe²⁺蓄积通过芬顿反应产生脂质过氧化物（LPO），诱发铁死亡，清除活化 HSCs 是抗纤维化关键策略。铁自噬是选择性自噬亚型，由 NCOA4 作为货物受体介导铁蛋白降解、释放游离铁，是调控 HSCs 铁死亡的核心通路，上调 NCOA4 可显著缓解肝纤维化，但调控 NCOA4 上游分子尚不清晰。 莫诺苷为药食同源中药山茱萸活性成分，已有研究证实其抗炎、抗氧化、保肝及体外抑制 HSCs 活化活性，但能否通过调控铁自噬 - 铁死亡通路改善体内肝纤维化、直接作用靶点、完整分子轴未见报道。同时酰基磷酸酶 ACYP1 仅在肝癌代谢研究中被报道，其在肝纤维化发生发展中的表达、功能完全未知。基于以上空白，本研究提出科学假说：莫诺苷直接结合 ACYP1，阻断 HERC2 介导 NCOA4 泛素降解，激活 HSCs 铁自噬与铁死亡，抑制 HSCs 活化、缓解化学及饮食诱导小鼠肝纤维化。 二、实验材料与技术体系 2.1 体内动物模型 构建两种独立纤维化小鼠模型验证药效： CCl₄诱导中毒肝纤维化模型：C57BL/6 雄鼠腹腔注射 CCl₄橄榄油溶液，每周 2 次，持续 6 周；同步灌胃低剂量 10 mg/kg、高剂量 20 mg/kg 莫诺苷（Mo-L、Mo-H）（图 1A）。机制回补实验采用尾静脉注射 HSCs 特异性 AAV8-ACYP1 过表达病毒、AAV8-shNCOA4 沉默病毒，联合高剂量莫诺苷干预（图 9A）。 GAN 饮食诱导 MASH 相关肝纤维化模型：高脂高果糖 GAN 饲料喂养 12 周造模，后续 12 周同步给予莫诺苷灌胃（图 2A）。 实验终点采集血清检测肝功能（AST、ALT、ALP、GGT）、纤维化标志物（HA、LN、Col-Ⅳ、PCⅢ）；肝脏组织行 H&E、Masson、天狼星红染色，采用 Ishak 纤维化评分定量；检测组织羟脯氨酸（胶原特征指标）；免疫组化、WB 检测 α-SMA、Col-Ⅰ 等活化标志物。 2.2 体外细胞体系 采用人 HSCs 细胞系 LX-2、正常肝细胞 AML-12、小鼠原代 HSCs；以 TGF-β1 诱导构建 HSCs 活化体外模型。干预手段包括梯度莫诺苷处理、siRNA 沉默 ACYP1/NCOA4、ACYP1/HERC2 过表达质粒转染、自噬抑制剂 3-MA/CQ、铁死亡抑制剂 Fer-1。检测手段包含 CCK8 细胞活力、转录组测序、WB、免疫荧光、Co-IP、透射电镜、DCFH-DA 活性氧（ROS）、FerroOrange 亚铁离子（Fe²⁺）、LPO 脂质过氧化荧光定量。 2.3 靶点与互作验证技术 靶点筛选：DARTS 联合液相质谱筛选莫诺苷结合蛋白（图 7A-B）； 分子互作验证：分子对接（结合能 - 8.0 kcal/mol）、表面等离子共振 SPR（KD=0.4 μM）证实莫诺苷与 ACYP1 稳定直接结合（图 7E-F）； 蛋白互作：Co-IP 验证 ACYP1 与 HERC2、HERC2 与 NCOA4 结合（图 8I-J）； 临床样本：8 例健康人、8 例纤维化患者肝组织免疫组化，结合 GSE 公共单细胞、转录数据集分析 ACYP1 表达与纤维化分级、促纤维化基因相关性（图 7K-T）。 三、实验结果 3.1 莫诺苷显著改善两类小鼠肝纤维化 CCl₄模型结果（图 1B-V）：与模型组对比，莫诺苷剂量依赖性降低血清 AST、ALT、ALP、GGT 肝损伤酶，下调 HA、LN、Col-Ⅳ、PCⅢ 纤维化标志物；组织病理显示模型组肝细胞坏死、炎症浸润、大量胶原沉积，莫诺苷干预后 Ishak 纤维化评分、Masson / 天狼星红阳性胶原面积、肝羟脯氨酸含量显著下降；免疫组化与 RT-qPCR 证实 HSCs 活化标志物 α-SMA、Col-Ⅰ 及促纤维化基因Acta2、Col1a1、Tgfβ1表达显著抑制，高剂量药效更突出，且无明显脏器毒性。 图1 莫诺苷改善四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化 GAN 饮食代谢纤维化模型（图 2B-U）重现上述全部药效：莫诺苷缓解肝脏肿大、降低肝指数，改善肝脏脂肪变性与纤维增生，抑制炎症因子 TNF-α、IL-6、IL-1β 释放，证实莫诺苷对毒性、代谢两类肝纤维化均具备广谱治疗作用。 图2 莫诺苷改善 GAN 饮食诱导的小鼠肝纤维化 3.2 莫诺苷体外直接抑制 HSCs 活化 CCK8 结果显示莫诺苷选择性抑制 LX-2 活力，对正常肝细胞 AML-2 无明显毒性（图 3A）；单纯莫诺苷处理、TGF-β 活化 LX-2 两种体系中，20、40 μM 莫诺苷均显著下调 α-SMA、Col-Ⅰ 蛋白（图 3B-E、G-H）与Acta2、Col1a1、Timp1、Tgfβ1 mRNA（图 3F、I-L），明确莫诺苷可直接靶向 HSCs 阻断其纤维化表型，不依赖肝细胞间接作用。 图3 莫诺苷抑制 LX-2 细胞的纤维化活化 3.3 莫诺苷激活 HSCs NCOA4 介导铁自噬与铁死亡 转录组 KEGG 富集提示莫诺苷显著调控铁死亡、自噬通路（图 4A-B）；蛋白检测显示莫诺苷上调自噬标志物 LC3Ⅱ、NCOA4，下调铁蛋白 FTH1/FTL、自噬底物 p62（图 4G-J）；免疫荧光可见 NCOA 与 LC3 共定位增强（图 4D-F）；Fe²⁺、ROS、LPO 水平显著升高，透射电镜观察到线粒体皱缩、膜破裂等典型铁死亡超微结构（图 4K-P）。TGF-β 活化 LX-2 体系、CCl₄小鼠原代 HSCs 中可重复该现象（图 4Q-S、图 5）；肝组织双荧光染色显示纤维化区域 α-SMA 阳性 HSCs 内 NCOA4 升高、FTH1 降低，证明体内 HSCs 中铁自噬被激活。 图4 莫诺苷促进 LX-2 细胞中 NCOA4 介导的铁自噬与铁死亡 图5 莫诺苷促进四氯化碳造模小鼠原代肝星状细胞中 NCOA4 介导的铁自噬与铁死亡 3.4 NCOA4 / 自噬是莫诺苷抗纤维化必需通路 沉默 NCOA-siRNA 后，莫诺苷诱导的铁蓄积、脂质过氧化、LC3 上调完全消失，促纤维化基因表达恢复，α-SMA 重新升高（图 6A-L）；自噬抑制剂 3-MA、铁死亡抑制剂 Fer-1 同样逆转莫诺苷对 HSCs 的抑制效果（图 6M-Q）。该结果证明NCOA4 依赖铁自噬、铁死亡是莫诺苷抑制 HSCs 活化的必要条件，缺失该通路则药效丧失。 图6 NCOA4 依赖型铁自噬是山茱萸苷抑制纤维化活化的关键 3.5 ACYP1 为莫诺苷直接靶点，高表达于纤维化肝组织 DARTS 质谱筛选得到 ACYP1 为莫诺苷高亲和力结合蛋白（图 7C-D）；分子对接、SPR 证实二者稳定物理结合（图 7E-F）。动物与细胞实验显示纤维化模型 ACYP1 蛋白显著上调，莫诺苷剂量依赖性降低 ACYP1 表达（图 7G-J）。人肝组织免疫组化显示纤维化患者 ACYP1 表达远高于健康对照（图 7K-L）；GSE 多组学数据集证实 ACYP1 表达随纤维化分级升高，与Acta2、Col1a1正相关；单细胞测序（GSE186343）证明 ACYP1 主要在 HSCs / 间质细胞高表达，直接关联 HSCs 活化（图 7P-T），首次阐明 ACYP1 是肝纤维化标志物与潜在致病蛋白。 图7 ACYP1 是山茱萸苷的直接作用靶点，且与人肝纤维化高度相关 3.6 莫诺苷通过 ACYP1 抑制 HERC2 介导 NCOA4 泛素化 ACYP1 过表达下调 NCOA 蛋白，沉默 ACYP1 上调 NCOA，但Ncoa4 mRNA 无变化（图 8A-D），说明 ACYP1 调控 NCOA 蛋白翻译后修饰。泛素化实验证实沉默 ACYP1 抑制 NCOA 泛素降解（图 8E）；Co-IP 证明 ACYP1 结合 HERC2，HERC2 可直接结合 NCOA 并介导其泛素化（图 8I-J）；莫诺苷处理降低 HERC2 蛋白水平（图 8K-M）。过表达 ACYP1 或 HERC2 可抵消莫诺苷促铁自噬、降促纤维化基因的作用（图 8N-R），明确分子轴：莫诺苷靶向 ACYP1→下调 HERC2→减少 NCOA4 泛素化降解→累积 NCOA4。 图8 莫诺苷靶向 ACYP1，抑制 HERC2 介导的 NCOA4 泛素化修饰 3.7 体内基因回补验证通路唯一性 CCl₄小鼠尾静脉注射 HSCs 特异性 AAV-ACYP1 过表达病毒、AAV-shNCOA4 沉默病毒后，莫诺苷改善肝功能、降低纤维化标志物、减轻胶原沉积、抑制 HSCs 活化的药效全部逆转（图 9B-M）；分离原代 HSCs 检测通路蛋白：ACYP1 过表达组 HERC2 回升、NCOA4 下降、铁蓄积减少；沉默 NCOA4 仅阻断铁自噬，不影响 ACYP1/HERC2 表达（图 9N-S）。 图9 尾静脉注射 AAV8-ACYP1 过表达病毒或 AAV8-NCOA4 沉默病毒可逆转莫诺苷对小鼠肝纤维化的治疗作用 四、讨论创新与局限 4.1 研究创新点 药效创新：首次在化学、双模型体内证实莫诺苷抗肝纤维化活性，完善其体内药理证据链，突破既往仅体外细胞实验局限； 靶点创新：首次发现 ACYP1 参与肝纤维化病理进程，证实其为莫诺苷直接分子靶点，拓展 ACYP1 代谢调控功能从肝癌到肝纤维化领域； 通路创新：完整阐明ACYP1/HERC2/NCOA4铁自噬 - 铁死亡调控轴，明确 HERC2 介导 NCOA 泛素化的中间环节，打通天然产物调控 HSCs 铁稳态全新机制； 转化价值：莫诺苷来源药食同源，安全性高，区别于化学小分子，为抗纤维化天然药物先导化合物开发提供坚实机制支撑，同时为 MASH 纤维化新型干预策略提供思路。 4.2 研究局限性 药效与机制全部基于啮齿动物模型，缺乏类器官、人原代 HSCs 高等级转化验证，暂无人体临床试验数据； 仅开展短期干预实验，莫诺苷体内药代动力学、长期系统毒理学未评价； ACYP1 调控糖酵解乳酸微环境、乳酸调控铁蛋白的次级关联机制仅做理论推测，未开展直接验证实验； 未探究莫诺苷对肝细胞、肝巨噬细胞的间接调控作用，仅聚焦 HSCs 单一细胞群体。 4.3 临床转化展望 现有临床抗纤维化药物应答率低，铁死亡靶向疗法是前沿方向。本研究证明莫诺苷通过靶向 ACYP1 稳定 NCOA4，特异性清除活化 HSCs，区别于泛抗炎、泛代谢调节药物，具备靶向特异性。后续可开展肝类器官验证、优化给药剂型、评价联合抗病毒 / 降脂药物协同抗纤维化效果，推动莫诺苷活性成分开发为慢性肝病辅助治疗候选药物。 五、研究结论 本研究通过体内双纤维化动物模型、多层次体外细胞实验、人临床样本、多靶点互作验证与体内 AAV 基因回补实验，系统证实：莫诺苷可直接靶向在纤维化肝星状细胞中异常高表达的 ACYP1，下调 E3 泛素连接酶 HERC2 表达，阻断 HERC2 介导 NCOA4 蛋白泛素化降解，提升 NCOA4 蛋白丰度，显著促进活化 HSCs 中铁自噬发生，诱导铁依赖的铁死亡，抑制 HSCs 转分化为肌成纤维细胞，减少胶原等 ECM 沉积，进而逆转 CCl₄中毒、GAN 饮食诱导两种小鼠肝纤维化。ACYP1 过表达或NCOA4 敲低可完全废除莫诺苷的抗纤维化效应，证明ACYP1/HERC2/NCOA4 介导铁自噬 - 铁死亡通路是莫诺苷发挥保肝抗纤维化的核心分子机制。研究明确莫诺苷作为天然植物活性分子的开发潜力，同时首次将 ACYP1 确立为肝纤维化全新致病靶点，为慢性肝纤维化新药研发提供全新理论依据与实验支撑。 病理状态 ACYP1/HERC2 升高，NCOA4 降解、铁自噬抑制、HSCs 持续活化；莫诺苷结合 ACYP1 后整条通路逆转，诱发活化 HSCs 铁死亡，缓解肝纤维化。 参考文献： Cong Zhang , Yingying Song , Yurou Huang , Yingxi Luo , Han Zhao , Yani Huang , Haixia Zhao , Zhenpeng Qiu , Morroniside ameliorates hepatic fibrosis in mice by targeting ACYP1 to promote NCOA4-mediated ferritinophagy and ferroptosis, Phytomedicine(2026), doi:https://doi.org/10.1016/j.phymed.2026.158673