Telmisartan

NI-BCAT2 links branched-chain amino acids metabolism to interferon signaling to sustain macrophage inflammation SUMMARY 类风湿关节炎（RA）中维持慢性炎症的机制尚未完全阐明。本研究表明，由线粒体酶BCAT2介导的支链氨基酸（BCAA）分解代谢，在自身免疫性关节炎中维持了干扰素驱动的巨噬细胞活化。对活动性RA或持续缓解期个体的多组学及组织学分析显示，活动性疾病与系统性BCAA耗竭、滑膜支链酮酸积累以及干扰素反应性滑膜巨噬细胞中BCAT2表达升高相关。机制上，干扰素-γ通过转录因子IRF1诱导RA滑膜巨噬细胞中的BCAT2转录。在人单核细胞来源的巨噬细胞中，BCAT2依赖的BCAA分解代谢升高了线粒体活性氧（mtROS），后者进而抑制SHP-1活性，延长STAT1和STAT2磷酸化，并驱动炎症细胞因子产生。此外，髓系特异性敲除Bcat2可改善胶原抗体诱导性关节炎小鼠的病情。使用替米沙坦对该通路进行药理学靶向治疗，可抑制甲氨蝶呤治疗小鼠的持续性关节炎。综上，我们的发现将BCAT2依赖的氨基酸分解代谢鉴定为自身免疫性关节炎中一个潜在可靶向的代谢通路。类风湿关节炎（RA）是一种慢性全身性自身免疫疾病，影响全球数百万人[1]。持续性滑膜炎症驱动血管翳形成、进行性软骨和骨破坏以及全身性合并症[2]。合成类改善病情抗风湿药（如甲氨蝶呤）以及随后细胞因子靶向生物制剂（如肿瘤坏死因子（TNF）抑制剂）的引入，显著改善了RA的管理[3]。然而，约30–40%的患者要么无应答，要么最终复发[4]，凸显出持续存在的治疗缺口，并提示维持炎症的分子回路仍未完全阐明[5]。在发炎的滑膜中，巨噬细胞在数量上占优，是致病性细胞因子（包括当前生物制剂的靶标）的主要产生者，并持续处于促炎状态，驱动关节损伤[6–8]。阐明强制执行这种致病表型的细胞内在程序，对于遏制RA的持续疾病活动至关重要[9–11]。新近证据表明，代谢重编程调控巨噬细胞活化和功能，提示代谢脆弱性可被利用以打破慢性炎症的循环[12,13]。除了糖酵解在促炎性巨噬细胞供能中的作用[14–17]外，其他营养感应通路也被报道在慢性疾病中精细调控巨噬细胞的炎症反应[18,19]。支链氨基酸（BCAA；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）既作为必需营养素，又作为 mechanistic target of rapamycin（mTOR）和线粒体生物能量学（对巨噬细胞活化和细胞因子产生至关重要的通路）的调控因子，使其处于代谢与炎症的交叉点[20–22]。BCAA分解代谢的第一个可逆步骤由两种不同基因编码的支链氨基转移酶催化：BCAT1和BCAT2。BCAT1编码主要位于胞质的酶，而BCAT2编码线粒体酶。尽管两种酶均催化BCAA转氨作用，但BCAT2广泛表达并支持线粒体BCAA分解代谢，而BCAT1表现出更具细胞和组织限制性的表达模式[23,24]。在本文中，我们显示滑膜巨噬细胞通过干扰素调节因子1（IRF1）–BCAT2轴利用BCAA分解代谢以维持RA慢性炎症。巨噬细胞中BCAT2上调驱动BCAA分解代谢，增加线粒体活性氧（mtROS）产生，并通过增强信号转导及转录激活因子1（STAT1）和STAT2的磷酸化来放大炎症信号。髓系特异性敲除Bcat2或使用老药新用替米沙坦进行药理学抑制，可减轻炎症性关节炎小鼠模型的关节炎严重程度。总之，我们的发现表明BCAT2依赖的BCAA分解代谢在自身免疫性关节炎中维持了干扰素（IFN）驱动的巨噬细胞活化和慢性炎症。 RESULT PART1 巨噬细胞中的BCAT2将 BCAA 分解代谢与活性RA联系起来 FIGURE 1 FIGURE S1 为明确甲氨蝶呤治疗期间与持续疾病活动相关的代谢特征，我们对接受甲氨蝶呤治疗的活动性RA患者（n=60；52名女性；中位年龄：59岁；范围：37–75岁；以下简称ACT队列）、接受甲氨蝶呤治疗且处于持续临床及超声证实的缓解期RA患者（n=60；55名女性；中位年龄：56岁；范围：35–74岁；以下简称REM队列）以及匹配的健康对照（n=60；50名女性；中位年龄：58.5岁；范围：29–75岁）的外周血进行了靶向代谢组学分析（图1a和补充表1）。与REM组及健康对照相比，ACT组表现为BCAA（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）及其分解代谢中间产物——支链酮酸（BCKA；α-酮异戊酸、酮亮氨酸和3-甲基-2-氧戊酸）的系统性耗竭（图1b,d和扩展数据图1a,b）。通路分析表明，与REM患者相比，BCAA代谢是ACT患者的主要代谢改变（图1c）。血清BCAA和BCKA水平与基于红细胞沉降率的28关节疾病活动度评分（DAS28-ESR，一种RA综合临床指数）及系统性炎症指标（包括ESR和C反应蛋白）呈负相关，但与体重指数无显著相关性（缬氨酸除外）（图1e和扩展数据图1c）。在来自ACT（n=20；18名女性；中位年龄：63.5岁；范围：52–75岁）和REM患者（n=20；19名女性；中位年龄：66.5岁；范围：60–74岁）的滑液中，BCAA水平无变化，而ACT患者中BCKA显著积累（图1f和补充表2），与炎症关节内局部BCAA分解代谢增强一致。 为识别与BCAA分解代谢增强相关的细胞组分，我们分析了来自接受甲氨蝶呤治疗的ACT（n=3；3名女性；中位年龄：50岁；范围：46–54岁）和REM患者（n=3；1名女性；中位年龄：67岁；范围：58–77岁）滑膜组织的公共单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集[25]。编码BCAT1和BCAT2（关键BCAA分解代谢酶）的转录本在ACT患者的滑膜CD68+FCGR3A+巨噬细胞和COL1A1+PDGFRA+成纤维细胞中较REM患者升高（图1g）。对用于滑液代谢组学的同一队列滑膜活检标本进行免疫组织化学染色显示，BCAT1表达相当，但ACT滑膜中BCAT2蛋白较REM滑膜显著增加（图1h,i）。多重免疫荧光显示BCAT2主要与CD68和CD14共定位，而不与血小板衍生生长因子受体α（PDGFRA）或平足蛋白（PDPN）共定位（图1j,k和扩展数据图1d,e）。在配对样本中，高滑膜CD68+BCAT2+巨噬细胞密度与低血清BCAA及BCKA浓度相关（扩展数据图1f）。这些观察结果将巨噬细胞BCAT2表达与BCAA分解代谢增强及RA持续活动相关联。 PART2 IFN 激活的RA巨噬细胞中 BCAA 分解代谢增强 FIGURE 2 FIGURE S2 为明确活动性RA中上调BCAT2的滑膜巨噬细胞亚群，我们对从ACT（n=7；7名女性；中位年龄：52岁；范围：46–65岁）和REM患者（n=4；4名女性；中位年龄：49岁；范围：42–58岁）滑膜组织中分选的CD45+CD11b+CD64+巨噬细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）（177,238个细胞；中位读数：每细胞20,313条）（补充表3），并将该数据集与ACT（n=6；6名女性；中位年龄：59岁；范围：56–63岁）和REM患者（n=6；6名女性；中位年龄：57岁；范围：50–72岁）的公共数据集[9]整合，形成包含13例ACT和10例REM样本的协调队列。无监督聚类识别出六个不同的巨噬细胞亚群：FCN1_Macs（特征为表达FCN1、VCAN、S100A12和S100A8）、SPP1_Macs（SPP1、FABP5、CD9和FN1）、LYVE1_Macs（LYVE1、F13A1、SEPP1和CCL2）、TREM2_Macs（TREM2、APOE、C1QB和NUPR1）、IL1B_Macs（IL1B、CXCL8、CCL3和CCL4）和ISG15_Macs（ISG15、CXCL10、STAT1和MX1）（图2a–c）。ACT组中SPP1_Macs和ISG15_Macs增加，而REM组中TREM2_Macs增加（图2d）。巨噬细胞亚群间的通讯分析预测，ISG15_Macs参与ACT滑膜中分泌性磷蛋白1（SPP1）、信号素-3、血管内皮生长因子、白细胞介素1（IL-1）和TNF信号传导（扩展数据图2a），提示该亚群在炎症性巨噬细胞通讯中发挥作用。 代谢通路评分显示，ACT样本ISG15_Macs中BCAA分解代谢过程活性高于REM样本（图2e和扩展数据图2b）。基因集富集分析进一步证实ACT ISG15_Macs中BCAA分解代谢富集，且BCAT2处于前导基因中（图2f）。对用于scRNA-seq的同一批患者分选的CD45+CD11b+CD64+滑膜巨噬细胞进行靶向代谢组学分析，显示与REM样本相比，ACT巨噬细胞中BCKA（包括酮亮氨酸和3-甲基-2-氧戊酸）积累（扩展数据图2c），与BCKA生成水平上BCAA分解代谢通路活性增强一致。 为了在空间上解析这些转录组学发现在原位的分布，我们对上述同一ACT（n=20）和REM患者（n=20）队列的滑膜活检标本进行了多重免疫荧光分析。该分析显示，ACT滑膜中表达ISG15的CD68+巨噬细胞密度显著高于REM滑膜。CD68+ISG15+巨噬细胞是表达BCAT2的主要群体，导致ACT滑膜中ISG15+BCAT2+细胞密度较REM滑膜升高2.7倍（图2g）。IFNα诱导蛋白6（IFI6）染色显示，ACT患者滑膜中IFI6+BCAT2+细胞密度较REM患者升高1.9倍（扩展数据图2d）。 SCENIC调控子分析将IRF1识别为ISG15_Macs中BCAT2的候选上游调控因子（图2h）。在原代人RA滑膜巨噬细胞中，IFNα诱导IRF1信使RNA（mRNA）但未显著增加BCAT1或BCAT2，而IFNγ增加IRF1和BCAT2但不增加BCAT1（图2i,j）。公共染色质免疫沉淀测序数据[26]显示，在chr19:48,810,568–48,811,247（人类基因组装配GRCh38）处存在IRF1结合峰，与位于chr19:48,811,029的BCAT2转录起始位点重叠（扩展数据图2e）。在使用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）分化的THP-1细胞共转染pcDNA3.1-IRF1和pGL3-BCAT2报告载体的双荧光素酶实验中，IRF1过表达优先激活含有完整预测IRF1结合位点的野生型BCAT2启动子/增强子报告基因，而不激活破坏预测IRF1结合位点的突变构建体（扩展数据图2f）。在RA滑膜CD45+CD11b+CD64+细胞中，慢病毒介导的IRF1过表达使BCAT2 mRNA水平较空载体对照增加约1.9倍。相反，短发夹RNA（shRNA）介导的IRF1敲低使BCAT2 mRNA表达较乱序shRNA对照降低约55%（扩展数据图2g）。因此，在活动性RA中，IFN激活的巨噬细胞表现出与IRF1相关的BCAT2上调和BCAA分解代谢增强。 PART3 BCAT2可增强炎症性单核细胞源性巨噬细胞中的 IFN 信号传导 FIGURE 3 FIGURE S3 接下来，我们测试了BCAA可利用性是否参与人外周血CD14+单核细胞来源的巨噬细胞（MDMs）的炎症活化。在100 ng ml−1脂多糖（LPS）和20 ng ml−1 IFNγ刺激24小时期间，与BCAA充足的RPMI 1640培养基相比，缺乏亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸显著减少了IL-1β和TNF的分泌（图3a）。免疫印迹显示，BCAA耗竭与真核翻译起始因子2亚基α（eIF2α）磷酸化降低相关，而S6磷酸化无明显下降（图3b），提示细胞因子分泌减少并不伴随S6磷酸化降低，而是与eIF2α相关的应激信号改变有关。 为明确BCAA饥饿的影响，我们对这些MDMs进行了定量蛋白质组学分析，细胞在BCAA充足的RPMI 1640培养基或缺乏亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的RPMI 1640培养基中，以100 ng ml−1 LPS和20 ng ml−1 IFNγ培养24小时。定量蛋白质组学在BCAA耗竭条件下鉴定出535种差异丰度蛋白，其中包括400种下调蛋白和135种上调蛋白。下调蛋白显著包含干扰素刺激基因（ISGs）编码的蛋白，如IFI6、IFI27和ISG15（图3c）。基因本体论和基因集富集分析表明，与BCAA充足条件相比，在BCAA耗竭条件下LPS联合IFNγ刺激的MDMs中，I型和II型IFN信号通路是被抑制最显著的过程之一（图3d和扩展数据图3a）。代表性免疫印迹显示，与BCAA充足条件相比，BCAA耗竭的LPS联合IFNγ刺激MDMs中STAT1和STAT2磷酸化及ISG15表达降低（图3e），而BCAA重新补充可部分恢复这些反应（图3f）。 通过慢病毒shRNA转导在MDMs中敲低BCAT2（MDMshBCAT2），相对于非靶向shRNA对照（MDMshNC），可减少LPS联合IFNγ诱导的TNF和IL-1β分泌并降低eIF2α磷酸化，而S6磷酸化保持不变（图3g,h）。相反，转导慢病毒BCAT2的MDMs（MDMBCAT2-OE）在LPS联合IFNγ刺激后，相对于空载体对照（MDMEV），TNF和IL-1β分泌增加（图3g），通过代表性免疫印迹评估，eIF2α或S6磷酸化无明显变化（图3i）。对LPS联合IFNγ刺激的MDMshBCAT2和MDMshNC细胞进行蛋白质组学分析显示，与MDMshNC细胞相比，BCAT2敲低改变了142种蛋白，其中98种下调，44种上调。下调蛋白富集于免疫调节和炎症反应相关过程，包括细胞因子或趋化因子相关蛋白如CXCL1和CCL8，以及ISG蛋白如IFI6和IFI27（图3j,k）。在BCAA充足培养基中培养的LPS联合IFNγ刺激的MDMshBCAT2细胞中，补充BCKA（α-酮异戊酸、酮亮氨酸和3-甲基-2-氧戊酸，即BCAT2的直接分解代谢产物）可在代表性免疫印迹中恢复STAT1和STAT2磷酸化及ISG15表达（图3l）。这些发现表明，BCAT2依赖的BCAA分解代谢支持人MDMs中LPS联合IFNγ诱导的炎症活化。 PART4 BCAT2通过线粒体ROS促进STAT信号通路 FIGURE 4 为探究BCAT2介导炎症的分子基础，我们绘制了LPS联合IFNγ刺激的MDMs中内源性BCAT2相互作用组图谱。免疫共沉淀联合质谱分析显示，与同型匹配免疫球蛋白（IgG）对照相比，BCAT2相关蛋白富集于参与线粒体代谢（包括OSBPL8、VAC14和TRAP1）及IFN信号传导（包括OAS3和ISG15）的蛋白（图4a）。对LPS联合IFNγ刺激的MDMBCAT2-OE和MDMEV细胞进行代谢组学分析显示，BCAT2过表达增加了BCAA分解代谢产物，包括2-甲基丁酸、3-羟基异丁酸和2-甲基丁酰肉碱，并减少了关键三羧酸（TCA）循环中间产物，包括柠檬酸和反乌头酸（图4b,c）。13C-亮氨酸示踪显示，与MDMEV细胞相比，LPS和IFNγ刺激的MDMBCAT2-OE细胞中亮氨酸来源的TCA中间产物标记减少，而LPS联合IFNγ刺激的MDMshBCAT2细胞中柠檬酸、琥珀酸或延胡索酸的亮氨酸来源标记无显著变化，尽管谷氨酸标记较MDMshNC细胞增加（图4d）。Seahorse分析显示，MDMBCAT2-OE细胞的基礎和最大耗氧率（OCRs）低于MDMEV细胞，同时伴随细胞外酸化率（ECAR）升高，而MDMshBCAT2细胞较MDMshNC细胞表现出基礎和最大呼吸及ATP产生增加，糖酵解分解代谢无显著变化（图4e,f和扩展数据图3b,c）。蛋白质组学分析表明，LPS联合IFNγ刺激的MDMBCAT2-OE细胞表现出线粒体应激相关的蛋白质组学特征，以上调TXNIP和MAP3K5（氧化还原依赖性应激信号的标志物[27,28]）以及COX7B和KRIT1为特征（图4g），反映线粒体呼吸和完整性的改变[29,30]。 在功能上，MDMshBCAT2细胞表现出mtROS降低，可通过mtROS诱导剂鱼藤酮恢复，而MDMBCAT2-OE细胞表现出mtROS升高，可被mtROS清除剂MitoTEMPO减弱（图4h,i和扩展数据图3d）。补充BCKA可恢复MDMshBCAT2细胞中mtROS的产生（图4j），提示BCKA生成可能参与氧化应激诱导。MitoTEMPO使MDMBCAT2-OE细胞中TNF和IL-1β分泌分别降低33%和44%，而鱼藤酮使MDMshBCAT2细胞中TNF和IL-1β分泌分别增加2.9倍和2.5倍（扩展数据图3e）。由于mtROS可氧化并失活蛋白酪氨酸磷酸酶[31]，后者可作为STAT磷酸化的负调控因子[32,33]，我们测试了BCAT2依赖的mtROS是否调节含Src同源2结构域磷酸酶-1（SHP-1）活性。为检测还原型活性SHP-1，将MDMshNC和MDMshBCAT2细胞裂解液进行基于生物素的游离硫醇标记、链霉亲和素pull-down及SHP-1免疫印迹。LPS联合IFNγ刺激降低了MDMshNC细胞中活性SHP-1的pull-down信号，而MDMshBCAT2细胞在刺激后仍保留活性SHP-1，各条件下总SHP-1输入量相当（图4k）。免疫印迹评估显示，与溶剂处理MDMshBCAT2细胞相比，泛蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂正钒酸钠（Na3VO4）处理可恢复LPS联合IFNγ刺激的MDMshBCAT2细胞中STAT1和STAT2磷酸化（图4l）。相反，与溶剂处理MDMBCAT2-OE细胞相比，SHP-1激活剂SC-43处理可降低LPS联合IFNγ刺激的MDMBCAT2-OE细胞中STAT1和STAT2磷酸化（图4m）。同时，Na3VO4部分恢复MDMshBCAT2细胞中TNF和IL-1β分泌，而SC-43抑制MDMBCAT2-OE细胞中这些细胞因子分泌的升高（图4n和扩展数据图3f）。这些数据表明，BCAT2在MDMs中促进mtROS依赖的STAT信号传导和炎症细胞因子分泌。 PART5 髓系Bcat2缺陷可减轻关节炎及 ISG 活化程度 FIGURE 5 FIGURE S4 为确定髓系BCAT2是否在体内参与炎症性关节炎，我们生成了Lyz2CreBcat2fl/fl小鼠，其中Bcat2在表达Lyz2的髓系细胞（包括单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞）中被删除（以下简称BCAT2条件性敲除（cKO）小鼠）。随后，我们在8至10周龄雌性BCAT2 cKO小鼠和Bcat2fl/fl对照中，通过第0天静脉注射致关节炎性胶原抗体混合物，随后在第3天和第11天腹腔注射LPS，诱导胶原抗体诱导性关节炎（CAIA）（分别为CAIABCAT2 cKO和CAIAfl/fl）。在抗体处理开始后第19天，CAIABCAT2 cKO小鼠的关节炎评分降低23.4%，而足爪厚度与CAIAfl/fl小鼠无显著差异（图5a）。组织病理学分析显示，与CAIAfl/fl对照相比，CAIABCAT2 cKO小鼠滑膜炎症和关节损伤减轻（图5c,d和扩展数据图4a），显微计算机断层扫描分析显示，与CAIAfl/fl对照相比，CAIABCAT2 cKO小鼠骨表面积与体积比降低，与骨侵蚀减少一致（图5f,g）。因此，髓系Bcat2缺陷减轻了CAIA的临床和结构特征。 接下来，我们在CAIA诱导后第31天，对CAIABCAT2 cKO和CAIAfl/fl小鼠的完整踝关节和骨髓单细胞悬液进行scRNA-seq。经质量控制和双联体去除后，保留33,266个细胞，包括19,988个踝关节细胞和13,278个骨髓细胞（中位数：每细胞38,388条读数）。无监督聚类识别出十个主要群体：造血干细胞和祖细胞、中性粒细胞、单核吞噬细胞和巨噬细胞、自然杀伤细胞、T细胞、B细胞、周细胞、红细胞、内皮细胞和成纤维细胞（扩展数据图4d,e）。对踝关节和骨髓的单核吞噬细胞进行亚聚类，鉴定出七个亚群：Ncapg_Macs（特征为Ncapg、E2f7和Mxd3）、Vcan_Macs（Vcan、Plcb1和Thbs1）、Isg15_Macs（Isg15、Ifit3和Rsad2）、H2-Eb1_Macs（H2-Eb1、H2-Ab1和Cd74）、Ace_Macs（Ace、Treml4和Eno3）、Siglech_Macs（Siglech、Grm8和Klk1）和C1qa_Macs（C1qa、Folr2和Cbr2）（图5h,i）。为明确BCAT2调控的程序，我们比较了CAIABCAT2 cKO和CAIAfl/fl小鼠Isg15_Macs的通路活性。与CAIAfl/fl相比，CAIABCAT2 cKO小鼠踝关节Isg15_Macs中炎症和组织重塑程序降低，包括炎症反应、IL-6–JAK–STAT3信号传导、通过核因子κB（NF-κB）的TNF信号传导和血管生成（图5j）。在骨髓Isg15_Macs中，CAIABCAT2 cKO与较低的IFNα应答以及代谢和应激反应通路活性改变相关（图5j）。富集CD45+的踝关节细胞流式细胞术显示，与CAIAfl/fl对照相比，CAIABCAT2 cKO小鼠关节浸润CD45+CD11b+Ly6G−巨噬细胞中MitoSOX中位荧光强度（MFI）降低，ISG15+和p-STAT1+细胞频率降低（图5k,l和扩展数据图4f,g）。我们还注意到，与CAIAfl/fl对照相比，CAIABCAT2 cKO小鼠血清CXCL10浓度显著降低（扩展数据图4h）。相反，用致关节炎性胶原抗体混合物处理的Bcat1−/−小鼠在关节炎评分、足爪肿胀、组织病理学评分或骨表面积与体积比方面与野生型对照相比无改善（图5b,c,e和扩展数据图4b,c）。这些观察表明，髓系Bcat2在CAIA中调控mtROS和ISG相关的炎症反应。 PART6 替米沙坦可抑制BCAT2介导的巨噬细胞活化 FIGURE 6 FIGURE S5 FIGURE S6 替米沙坦是一种临床已确立的血管紧张素II 1型受体拮抗剂，被描述为BCAT2的潜在抑制剂[34]。分子对接预测替米沙坦在BCAT2催化口袋内具有有利的结合姿态，与双BCAT1+BCAT2抑制剂BAY-069（用作参考对照）的预测结合模式高度相似（扩展数据图5a,c）。表面等离子体共振显示替米沙坦与重组BCAT2蛋白之间存在直接、剂量依赖的相互作用（扩展数据图5b,d和补充表4），支持了计算预测。 为评估替米沙坦–BCAT2相互作用在体内的药理学相关性，将经致关节炎性胶原抗体混合物处理的野生型小鼠（CAIAWT小鼠）在CAIA诱导后第4天至第31天随机给予每日口服灌胃溶媒或替米沙坦（5 mg kg−1 d−1）。与溶媒处理相比，替米沙坦降低了CAIAWT小鼠的关节炎评分、组织病理学严重程度、滑膜炎症、软骨损伤和骨侵蚀（图6a和扩展数据图5e,f,i）。在CAIABCAT2 cKO小鼠中，相同给药方案未进一步降低临床、组织病理学或结构性病变严重程度，其严重程度已低于CAIAfl/fl对照（图6b和扩展数据图5g,h,j）。当Bcat2fl/fl和BCAT2 cKO小鼠（分别为CAIAfl/fl和CAIABCAT2 cKO小鼠）经或不经致关节炎性胶原抗体混合物处理，并给予溶媒或替米沙坦时，与溶媒处理的CAIAfl/fl小鼠相比，替米沙坦处理的CAIAfl/fl或溶媒处理的CAIABCAT2 cKO小鼠关节炎严重程度降低，而替米沙坦处理CAIABCAT2 cKO小鼠未提供额外保护（图6c）。流式细胞术显示，与非CAIAfl/fl小鼠相比，CAIAfl/fl小鼠关节浸润CD45+CD11b+Ly6G−巨噬细胞中ISG15+和p-STAT1+细胞频率增加，MitoSOX MFI升高。与CAIAfl/fl相比，替米沙坦和髓系Bcat2缺失各自降低这些读数，且与溶媒处理的CAIABCAT2 cKO小鼠相比，替米沙坦在CAIABCAT2 cKO小鼠中未产生额外抑制（图6d和扩展数据图6a–d）。 为检查甲氨蝶呤处理的CAIA诱导小鼠中持续性炎症的细胞相关性，野生型小鼠在CAIA诱导后第4天开始，每周口服灌胃甲氨蝶呤3.1 mg kg−1。第19天，根据残留关节炎负担（计算为总关节炎评分除以最大可能评分16）对小鼠进行分层。负担≤25%且评分≤4的小鼠被归类为甲氨蝶呤缓解型CAIA小鼠（CAIAMTX-RES），而负担≥37.5%且评分≥6的小鼠被归类为甲氨蝶呤持续性CAIA小鼠（CAIAMTX-PER）。对第19天随机选取的6只CAIAMTX-RES和6只CAIAMTX-PER小鼠的踝关节和骨髓细胞进行scRNA-seq，随后对单核吞噬细胞进行亚聚类，鉴定出上述七个亚群：Ncapg_Macs、Vcan_Macs、Isg15_Macs、H2-Eb1_Macs、Ace_Macs、Siglech_Macs和C1qa_Macs（图6e）。与CAIAMTX-RES小鼠相比，CAIAMTX-PER小鼠在踝关节Isg15_Macs中显示出更高的炎症和组织重塑程序通路评分，包括通过NF-κB的TNF信号传导、炎症反应、凝血和血管生成，以及骨髓Isg15_Macs中代谢和应激反应程序的改变（图6f）。为进一步评估关节浸润巨噬细胞中ISG15表达和mtROS，我们使用流式细胞术分析了CAIA诱导后第19天CAIAMTX-RES和CAIAMTX-PER小鼠踝关节组织中CD45+富集单细胞悬液中的CD45+CD11b+Ly6G−细胞。与CAIAMTX-RES小鼠相比，CAIAMTX-PER小鼠在该群体中ISG15+细胞频率增加，MitoSOX MFI升高，同时血清CXCL10浓度更高（图6g–i和扩展数据图6e,f）。为测试替米沙坦是否调节持续性炎症，CAIAMTX-PER小鼠在CAIA诱导后第19天接受溶媒或替米沙坦处理，同时继续甲氨蝶呤治疗。在CAIA诱导后第31天，与溶媒相比，替米沙坦降低关节炎评分（扩展数据图6g）。第31天踝关节和骨髓细胞scRNA-seq显示，与溶媒处理的CAIAMTX-PER小鼠相比，替米沙坦处理的CAIAMTX-PER小鼠踝关节Isg15_Macs中炎症和组织重塑程序（包括炎症反应、通过NF-κB的TNF信号传导和IL-6–JAK–STAT3信号传导）降低，同时骨髓Isg15_Macs中代谢通路评分改变（图6j,k）。流式细胞术显示，在第31天，与溶媒处理的CAIAMTX-PER小鼠相比，替米沙坦处理的CAIAMTX-PER小鼠关节浸润CD45+CD11b+Ly6G−巨噬细胞中ISG15+细胞频率降低，MitoSOX MFI降低，同时血清CXCL10浓度降低（图6l–n和扩展数据图6h,i）。 最后，我们进行了一项多中心、回顾性、倾向性评分匹配队列的探索性分析，纳入接受甲氨蝶呤治疗的RA患者（n=116；105名女性；中位年龄：63.5岁；范围：42–77岁），这些患者处于临床缓解至少3个月，并因新诊断高血压开始使用任何血管紧张素II受体阻滞剂（ARB）——替米沙坦或其他ARB。匹配队列包括接受甲氨蝶呤治疗且处于临床缓解的RA患者，因新诊断高血压开始使用替米沙坦（n=58；52名女性；中位年龄：64.5岁；范围：45–77岁），以及接受甲氨蝶呤治疗且处于临床缓解的RA患者，因新诊断高血压开始使用替米沙坦以外的ARB（n=58；53名女性；中位年龄：62岁；范围：42–75岁），在替米沙坦或其他ARB启动时及第3、6、9、12个月进行分析（扩展数据图6j和补充表5）。在接受甲氨蝶呤治疗的RA患者中，开始使用替米沙坦者与开始使用其他ARB者相比，至第12个月的无复发生存期更长，复发风险的点估计值更低（扩展数据图6k）。总之，这些实验性和探索性临床发现提示，替米沙坦可能在炎症性关节炎中作为BCAT2相关巨噬细胞活化的调节剂。 DISCUSSION 本研究发现，BCAT2依赖的BCAA分解代谢与活动性RA患者中IFN激活的巨噬细胞程序相关。数据将IFNγ–IRF1驱动的BCAT2表达与炎症性巨噬细胞中的线粒体氧化还原应激及STAT1或STAT2信号放大联系起来。髓系特异性Bcat2缺失或替米沙坦药理学靶向可减轻小鼠炎症性关节炎。探索性临床数据进一步提示替米沙坦使用与甲氨蝶呤维持缓解更持久之间存在关联。 这些观察表明，在炎症性巨噬细胞中，BCAA分解代谢可能主要作为信号调节通路而非线粒体燃料来源发挥作用。这一观点与经典营养感知模型一致但有区别，后者中BCAA可利用性与雷帕霉素机械靶蛋白复合物1活性和合成代谢相偶联[36]。S6磷酸化的保留表明，在此情境下BCAA分解代谢的效应并非主要通过经典雷帕霉素机械靶蛋白复合物1输出介导，至少就该读数评估而言如此。相反，BCAT2依赖的转氨作用可能倾向于线粒体应激和氧化还原依赖性信号传导，而非TCA循环碳进入。这种状态如何产生线粒体ROS仍不清楚，包括是否涉及电子传递改变或不完全BCAA氧化。 多项证据支持一个模型，即BCAT2依赖的mtROS放大持续进行的IFNγ受体信号，而非独立启动STAT磷酸化。首先，BCAT2诱导对IFNγ刺激具有特异性，而I型IFN无法诱导其表达。其次，在BCAT2沉默的巨噬细胞中补充BCKA可在持续IFNγ刺激期间恢复STAT1和STAT2磷酸化，表明BCAT2酶促输出增强而非替代受体启动的信号。第三，对SHP-1活性的药理学操作表明，mtROS在完整的、已结合的IFNγ受体下游维持STAT磷酸化。综上所述，这些观察勾勒出一个以IFNγ受体为核心的前馈模型：其激活诱导BCAT2，后者驱动mtROS产生和SHP-1抑制，以延长STAT1或STAT2磷酸化。BCAT2依赖的mtROS是否能在缺乏IFNγ受体结合的细胞中影响STAT磷酸化仍有待确定。 IFN在RA中的参与具有异质性，最明显表现为确定的IFN诱导转录程序，而非单一通路的统一激活[37]。I型IFN特征已在RA患者亚群中被报道，特别是在早期或自身抗体阳性疾病中，并与可变治疗反应相关[38–41]。IFNγ诱导程序也已在RA滑膜组织中被描述，与STAT1表达和炎症介质产生相关[42]。由于I型和II型IFN诱导重叠的ISG，RA滑膜中ISG15+巨噬细胞状态本身并不能定义上游IFN来源[38,43]。我们的数据支持一个模型，即BCAT2在滑膜巨噬细胞中作用于IFNγ–IRF1程序的下游，但滑膜IFNγ的来源、I型IFN的贡献以及BCAT2依赖mtROS的氧化还原靶点仍未解决。因此，ISG15+巨噬细胞应被视为处于BCAT2富集的炎症状态，而它们在驱动滑膜炎中的直接作用仍有待验证。 替米沙坦除血管紧张素II 1型受体阻断外还具有抗炎效应，包括过氧化物酶体增殖物激活受体γ激活[44]。在我们的实验模型中，替米沙坦在BCAT2 cKO小鼠中缺乏额外疗效，支持髓系BCAT2在此情境下对替米沙坦抗炎效应的重要贡献，尽管替米沙坦的其他靶点也可能参与。因此，替米沙坦与其他ARB在RA合并高血压患者中的回顾性比较应被视为假设生成而非疾病修饰疗效的证据。未来需要前瞻性研究来确定BCAT2抑制是否能改善RA缓解持久性或降低复发风险。 需承认若干局限性。首先，ISG15+巨噬细胞亚群在RA中的致病作用需要直接验证。目前，BCAT2 cKO小鼠中ISG15+巨噬细胞频率的降低仍为相关性。其次，本文中ACT（活动性RA且接受甲氨蝶呤治疗）的命名用于定义采样时的治疗背景，并不意味BCAT2–BCAA分解代谢程序对甲氨蝶呤耐药具有特异性。类似程序可能发生于未治疗的活动性RA或其他炎症性关节炎情境中。同样，本文使用的短期小鼠模型可能反映固有炎症而非慢性人类治疗抵抗。最后，我们的回顾性临床分析受限于潜在混杂因素和中等的效应量，需前瞻性研究来确认该通路的临床相关性。总之，我们的发现将BCAT2依赖的BCAA分解代谢鉴定为一种代谢机制，可能维持滑膜巨噬细胞中IFN应答性炎症状态，并支持对该通路在RA中的进一步评估。

类风湿关节炎（RA）是一种以关节滑膜持续病理性增生、侵袭关节骨及软骨的慢性系统性自身免疫病。尽管目前多种生物制剂、靶向药物的应用大大改善患者预后，但仍有相当比例患者存在应答不佳或持续反复发作的现象，其潜在的发病机制尚不明确。滑膜组织中特殊细胞亚群的生物学功能成为目前研究的主要方向。 7月31日，南京中医药大学附属无锡医院（无锡市中医院）张亚峰、孟晓辉教授团队联合我院关节病研究所肖涟波教授团队、中山莱博瑞辰姚蔚教授团队共同在Nature Immunology（IF=26.5）杂志发表论文 BCAT2 links branched-chain amino acids metabolism to interferon signaling to sustain macrophage inflammtion。 研究发现，活动期与缓解期RA患者外周血存在显著的支链氨基酸减少，而关节滑液中支链酮酸显著累积；通过单细胞测序与多重免疫荧光证实，滑膜组织中干扰素响应巨噬细胞高表达线粒体酶BCAT2，该酶可催化支链氨基酸生成支链酮酸导致支链酮酸在关节局部的富集；团队进一步追踪了深层次的分子机制，发现干扰素γ-IRF1-BCAT2信号活化促进了线粒体活性，负向调控蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1活性，导致STAT1/STAT2磷酸化表达增加，从而放大干扰素信号，促进巨噬细胞活化和炎症的维持；体外BCAA剥夺或BCAT2敲降、BCAT2过表达和支链酮酸回补实验以及代谢流分析进一步揭示BCAT2介导的巨噬细胞支链氨基酸的减少，是代谢物介导的信号调控而非能量供应。此外，团队还通过分子对接与表面等离子体共振等实验发现降压药替米沙坦可直接结合BCAT2的催化结构域，动物实验及回顾性临床队列分析证实，替米沙坦治疗可有效抑制甲氨蝶呤治疗残留的炎症，甲氨蝶呤联合替米沙坦治疗的RA患者，临床复发风险低于其他血管紧张素受体拮抗剂使用者，提示BCAT2靶点抑制剂在RA疾病炎症控制中的特殊治疗作用。 本项目系统揭示了BCAT2介导支链氨基酸分解代谢通过线粒体活性氧-SHP-1-STAT轴放大干扰素信号进而维持巨噬细胞炎症状态的分子机制，这为理解RA慢性炎症持续状态的代谢基础提供新的视角，并为老药替米沙坦应用于RA治疗提供实验依据，但仍需要更多临床数据进一步证实。 我院2023届博士研究生孟晓辉博士（现任职于无锡市中医院）、2024届博士研究生韩海慧博士（现任职于无锡市中医院）、无锡市中医院尤武林副主任医师、我院2025届博士研究生辛鹏飞（现任职于江西省中医院）为本论文共同第一作者；无锡市中医院张亚峰教授、我院肖涟波教授和中山莱博瑞辰姚蔚教授是本论文的共同通讯作者。 供稿：沈   军 编辑：汪家宁 校对：钱   真 审阅：肖涟波