Levamisole Hydrochloride

利用生物激活型杀线虫剂 选择性防治寄生线虫 Selective control of parasitic nematodes using bioactivated nematicides Andrew R. Burns、Peter J. Roy 等 Nature 第 618 卷，102–109 页，2023 年 6 月 1 日 DOI: 10.1038/s41586-023-06105-5目录 一、论文概览与核心亮点 二、摘要：翻译与解读 三、引言：研究背景 四、选择性咪唑噻唑类杀线虫剂的发现 五、Selectivin 具有全新的作用模式 六、Selectivin 是生物激活型杀线虫剂 七、生物激活产生毒性亲电体 八、生物激活为线虫所特有 九、防治植物寄生线虫的先导杀线虫剂 十、CYP4731A3 对 Selectivin-A 的生物激活 十一、讨论与展望 十二、研究方法概要 十三、附录：扩展数据图表 十四、术语对照表 一、论文概览与核心亮点 项目 内容 论文题目 Selective control of parasitic nematodes using bioactivated nematicides（利用生物激活型杀线虫剂选择性防治寄生线虫） 发表期刊 Nature（自然），第 618 卷，102–109 页 发表时间 2023 年 5 月 24 日在线发表，2023 年 6 月 1 日见刊 通讯作者 Andrew R. Burns、Peter J. Roy（多伦多大学） 研究领域 农业化学、线虫学、药物代谢与毒理 核心发现 发现选择性杀线虫剂 selectivin 家族——一类需在线虫体内经细胞色素 P450（CYP）代谢激活后才能发挥毒性的前体型杀线虫剂 植物寄生线虫每年造成全球超过 1000 亿美元的作物损失，而 20 世纪曾广泛使用的 20 种主要杀线虫剂中，如今仅 4 种获准在欧盟使用、3 种在美国可不受限制地使用——绝大多数因对人畜和环境缺乏选择性（毒性过高）而被禁用。农民陷入了无药可用的困境。这篇发表于 Nature 的论文给出了一条全新的解决思路：不再寻找直接毒杀线虫的化合物，而是设计一类本身无毒、只有进入线虫体内并被线虫自身的代谢酶（细胞色素 P450）激活后才变成毒物的前体型杀线虫剂。由于这种激活酶系统是线虫所特有的，药物便天然地对线虫具有高度选择性，对植物、真菌、昆虫、鱼类乃至人体细胞都相对安全。 核心亮点速览 1. 全新化合物家族：selectivin（选择性杀线虫素），以 6-苯基咪唑[2,1-b]噻唑为骨架，是此前从未被报道过具有杀线虫活性的全新结构类型。 2. 全新作用模式：属于首创（first-in-class）的生物激活型（前体型）杀线虫剂——母体分子本身低毒，进入线虫后被 CYP-35C1 等 P450 酶氧化为高反应性亚砜代谢物，后者才是致命毒素。 3. 高度线虫选择性：亚砜代谢物只在（包括寄生线虫在内的）线虫体内大量生成，在酵母、果蝇、斑马鱼中几乎不产生，对两种人体细胞在 100 µM 下亦无活性。 4. 田间级效力：在土壤-番茄盆栽体系中，约 2.5 ppm（4.5 kg/公顷）的低剂量即可显著控制毁灭性根结线虫南方根结线虫（M. incognita），与商业杀线虫剂 tioxazafen 效力相当。 5. 抗性难以产生：筛选超过 1000 万个诱变基因组均未获得抗性突变体，提示该药剂不易诱发抗药性。 6. 工艺友好：仅需两步合成、两种常见溶剂、温和条件、无过渡金属催化剂，具备工业化放大潜力。二、摘要：翻译与解读2.1 摘要译文 寄生线虫是全球粮食安全的主要威胁，尤其是在耕地有限而世界人口正迈向 100 亿的背景下。由于对线虫缺乏选择性，大多数传统杀线虫剂已被禁用，农民因此缺乏足够的害虫防治手段。本研究利用模式线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）鉴定出一族选择性咪唑噻唑类杀线虫剂——称为 selectivin——它们在线虫体内经历由细胞色素 P450 介导的生物激活。在百万分之几（ppm）的低浓度下，selectivin 控制根部感染的效果可与商业杀线虫剂媲美，其防治对象是南方根结线虫（Meloidogyne incognita）——一种极具破坏力的植物寄生线虫。针对众多系统发育上多样的非靶标体系的测试表明，selectivin 对线虫的选择性优于大多数市售杀线虫剂。Selectivin 是首创的生物激活型线虫防治药剂，兼具效力与线虫选择性。2.2 摘要解读 解读：三句话读懂这篇论文 第一句（问题）：线虫灾害巨大，但老药因毒性太广被禁，新药稀缺。 第二句（方案）：作者反其道而行之，利用线虫自身的代谢系统当特洛伊木马——药剂本身无毒，被线虫摄入后由其自身的 P450 酶激活成毒物，实现定向爆破。 第三句（证据）：在 ppm 级低浓度下有效防治根结线虫；对真菌、昆虫、鱼、人细胞等非靶标生物的毒性远低于现有商业药剂。三、引言：研究背景3.1 引言译文 随着世界人口逼近 100 亿，全球粮食需求将越来越难以满足。可用于农业扩张的耕地十分稀缺，而土地转化又受到社会与生态因素的制约。因此，最大限度提高现有耕地的产量，对保障全球粮食安全至关重要。农民依赖农用化学品来控制作物病原体、实现产量最大化。植物寄生线虫（plant-parasitic nematode，PPN）是破坏性极强的病原体，每年造成超过 1000 亿美元的作物损失。数十年来，合成杀线虫剂在 PPN 防治中发挥了重要作用；然而，出于对环境毒性和人类安全的合理担忧，最常用的杀线虫剂已被禁用。可用于防治 PPN 的药剂之匮乏令人震惊：20 世纪使用的 20 种主要杀线虫剂中，目前仅 4 种在欧盟获批使用，仅 3 种在美国可不受限制地使用。尽管这些禁令有其正当性，却让农民可选择的手段十分有限，对若干 PPN 甚至完全无计可施。 尽管需要更具选择性的 PPN 防治手段，过去 25 年间仅开发出 7 种非熏蒸型合成杀线虫剂。这些新一代杀线虫剂分别是：fluazaindolizine、氟砜灵（fluensulfone）、氟吡菌酰胺（fluopyram）、异菌脲（iprodione）、螺虫乙酯（spirotetramat）、tioxazafen 和 cyclobutrifluram。不幸的是，异菌脲因其潜在致癌性和对水生生物的风险已在欧洲被禁用；与此同时，基于 tioxazafen 的种子处理产品因操作人员出现皮肤刺激的报道而推迟上市。因此，市场迫切需要选择性更佳的新型杀线虫剂。3.2 引言解读 解读：为什么这项研究重要 杀线虫剂行业面临双重挤压：一方面线虫危害随粮食需求增长而加剧；另一方面监管趋严使老药退出、新药上市缓慢（25 年仅 7 种）。 更关键的是，所谓新一代药剂中有不少是杀菌剂或杀虫剂改行而来，并非为线虫量身打造，选择性和安全性仍不理想。 这篇论文的价值在于提出了一个机制层面的新范式——把宿主（线虫）与其他生物在代谢酶上的差异转化为选择性优势，而不是继续在直接毒杀的老框架里修修补补。四、选择性咪唑噻唑类杀线虫剂的发现4.1 原文译文 从一个能扰乱自由生活的秀丽隐杆线虫生长的未表征化合物库中，我们鉴定出三种含咪唑噻唑结构的新分子，它们能选择性地杀死线虫（图 1a）。在低微摩尔浓度下，这些被我们命名为 selectivin-A、selectivin-B 和 selectivin-C 的选择性咪唑噻唑类杀线虫剂，能杀死实验室可培养的全部四种自由生活线虫。此外，selectivin 还能杀死一种牛寄生线虫（Cooperia oncophora）的虫卵，以及三种侵染作物的根结线虫中至少一种的侵染性幼虫（图 1b）。这八种线虫横跨五个属和两个进化分支，提示包括寄生线虫在内的多种线虫都对 selectivin 敏感。相比之下，这些化合物在足以轻易杀死线虫的浓度下，对真菌、昆虫、鱼类或人体细胞几乎没有活性（图 1c）。此外，连续 5 天以 50 mg/kg 的日剂量口服 selectivin-A 的小鼠，与未处理小鼠相比未表现出明显的病理变化。据我们所知，此前从未报道过任何含有 selectivin 的 6-苯基咪唑[2,1-b]噻唑骨架的化合物具有广谱杀线虫活性。因此，selectivin 代表了一类用于开发选择性、高效 PPN 防治药剂的全新结构类型。 图 1｜selectivin 家族。a：selectivin 核心骨架及 selectivin-A/B/C 的化学结构；b：三种 selectivin 对 8 种线虫（4 种自由生活线虫 + 4 种寄生线虫，横跨 5 属 2 个进化分支）的剂量-反应热图，颜色越深表示存活率越低；c：同样的化合物对真菌、斑马鱼、人体细胞（HEK293、HepaRG）和果蝇几乎没有影响。（图片来源：原文 Fig. 1）4.2 解读 解读：一张热图里的玄机 图 1 是全文的第一块基石。b 面板中，微摩尔级别的 selectivin 即可让 8 种线虫（包括三种根结线虫 M. incognita、M. chitwoodi、M. hapla）存活率归零，说明它是广谱杀线虫剂； c 面板则显示，同一批化合物对酵母、白色念珠菌、斑马鱼、两种人体细胞和果蝇（成虫与幼虫）即使到 100 µM 也基本无影响。杀线虫与不伤其他生物这两条曲线之间的巨大浓度窗口，正是选择性的直接证据。 小鼠口服 50 mg/kg 连续 5 天无明显病变，进一步支持其对哺乳动物的低毒性。结构上，三个化合物共享 6-苯基咪唑[2,1-b]噻唑骨架，仅苯环对位卤素（Cl/F/Br）不同，为后续构效关系优化留下了清晰空间。五、Selectivin 具有全新的作用模式5.1 原文译文 作为理解 selectivin 作用模式的第一步，我们用 selectivin-A 和 selectivin-C 测试了 8 株秀丽隐杆线虫突变株——每一株都对某一大类驱虫药或杀线虫剂具有特异性抗性（扩展数据表 1）。没有一株突变体对 selectivin 产生抗性，这表明与所考察的商业药剂相比，selectivin 具有截然不同的作用模式。 为了进一步表征 selectivin 的作用模式，我们进行了正向遗传筛选：对随机诱变产生的、能抵抗 selectivin 致死效应的秀丽隐杆线虫突变体进行筛选。这种方法此前曾成功筛选出大量特异性抵抗多种主要商用驱虫药和杀线虫剂的突变体。然而，尽管筛选了超过 1000 万个诱变基因组，仍未能获得任何抗 selectivin 的线虫（扩展数据表 2）。这一结果进一步印证：selectivin 杀死线虫的机制不同于传统的线虫防治药剂。5.2 解读 解读：抗性筛选为什么重要 8 株抗性突变株分别对左旋咪唑、伊维菌素、苯并咪唑、乙嘧酚类（fluopyram 类）等主流药物耐药——如果 selectivin 与其中任何一类共享作用靶点，对应的突变株就会表现出交叉抗性。结果全部敏感，说明 selectivin 走的是一条全新通路。 更有说服力的是正向遗传筛选：用 EMS 随机诱变后，在 100% 致死剂量下筛选幸存者。同样的方法曾轻松筛出针对左旋咪唑（31 株）、阿苯达唑（22 株）、伊维菌素（8 株）、wact-11（15 株）的抗性突变体，但筛了 1030 万个基因组也找不到一株抗 selectivin 的。这暗示 selectivin 的致死不依赖某个单点靶蛋白的突变即可逃逸的机制——因为毒素是代谢产生的、可攻击多种细胞大分子的反应性亲电体。对农药开发而言，这意味着田间抗性风险可能较低。六、Selectivin 是生物激活型杀线虫剂6.1 原文译文 此前利用秀丽隐杆线虫的研究表明，对线虫致死的化合物，其代谢产物常在线虫组织中积累。因此，杀线虫剂有可能从无害的母体分子被转化为对线虫致死的代谢产物。微粒体细胞色素 P450（CYP）酶通常参与惰性前药向生物活性代谢物的氧化生物转化。秀丽隐杆线虫基因组编码 76 种微粒体 CYP 酶，其中许多已知参与药物代谢。为检验 selectivin 是否被秀丽隐杆线虫生物激活，我们利用了此前建立的方法：在幼虫发育期破坏 EMB-8 的活性，从而广泛削弱微粒体 CYP 酶的功能，同时绕过其在胚胎发生中的必需作用。EMB-8 是秀丽隐杆线虫的 P450 氧化还原酶（POR），是所有微粒体 CYP 酶必需的氧化还原搭档。与 selectivin 属于生物激活型杀线虫剂的设想一致，敲低 emb-8 使秀丽隐杆线虫对 selectivin 的致死作用产生了抗性（图 2a）。相比之下，无需生物激活即可发挥活性的化合物 wact-11 则以不依赖 EMB-8 的方式杀死线虫。 为鉴定 selectivin 的代谢物，我们将年轻成虫和一龄幼虫（L1）分别在含或不含 100 µM selectivin-A 的条件下孵育 6 小时，然后用反相高效液相色谱联用二极管阵列检测器（HPLC-DAD）分析全虫裂解液（图 2b）。在 selectivin-A 处理组的裂解液中，我们发现了 5 个未处理对照中不存在的色谱峰。在 7 分钟处洗脱的峰与直接进样的 selectivin-A 标准品具有相同的保留时间和吸收光谱——这可能是孵育后残留在虫体组织中的未修饰 selectivin-A 母体。其余 4 个峰比 selectivin-A 更早洗脱，提示其亲脂性更低。这些峰在 selectivin-A 标准品中不存在，也不存在于接触 selectivin-A 的死虫裂解液中，这支持它们是真正的 selectivin-A 代谢物，而非积累的污染物或自发氧化产物（图 2b、c）。我们将这四种推定代谢物命名为 M1、M2、M3 和 M4。 与 selectivin-A 被生物激活的假设一致，敲低 emb-8 后虫体组织中全部四种代谢物的丰度大幅下降，而未修饰的 selectivin-A 母体丰度则上升了近两倍（图 2b、d）。未修饰的 selectivin-A 不太可能是体内的活性成分，因为 emb-8 敲低的线虫体内 selectivin-A 浓度几乎是野生型的两倍，却能在 100 µM selectivin-A 处理下存活（图 2a、d）。因此，selectivin 是被生物激活的前体型杀线虫剂（pro-nematicide）。 图 2｜selectivin 是生物激活型杀线虫剂。a：野生型线虫被 selectivin 杀死，而 emb-8 敲低（CYP 系统失能）的线虫存活；对照化合物 wact-11 不受影响。b：HPLC 色谱图显示活虫体内出现 4 个代谢物峰（M1–M4），死虫（无法代谢）和 emb-8 敲低线虫体内代谢物几乎消失、母体堆积。c、d：代谢物定量证实上述差异。（图片来源：原文 Fig. 2）6.2 解读 解读：全文最巧妙的一组证据 这一节的逻辑链非常漂亮： （1）EMB-8 是所有微粒体 P450 酶的供电子搭档，敲低它等于让整个 P450 代谢系统瘫痪。 （2）P450 瘫痪后，线虫反而对 selectivin 免疫了——说明杀死线虫的不是药物本身，而是 P450 代谢产生的某个东西。 （3）色谱证据完美闭环：emb-8 敲低虫体内母体药物堆积更多（近 2 倍）却安然无恙，直接排除了母体药物是活性成分的可能。 （4）死虫对照排除了代谢物是死后自氧化产物的假象。 这一设计把生物激活从相关性推测变成了因果性结论。七、生物激活产生毒性亲电体7.1 原文译文 为鉴定有毒的 selectivin 代谢物，我们收集了含有全部四种 selectivin-A 代谢物的 HPLC 馏分，用电喷雾电离质谱（ESI-MS）及 MS/MS 碎裂分析其结构。基于对 M4 馏分的分析，我们推测 M4 是两个 4-(4-氯苯基)-1H-咪唑-2-硫醇单体形成的二硫醚（扩展数据图 1a、b）。烷基化裂解实验得到了推定的烷基化单体而非二硫醚，说明单体是在线虫体内形成的，而二硫醚是在裂解之后才形成的。用可商业购买的咪唑-硫醇单体进行剂量-反应分析发现，尽管它能在虫体组织中大量积累，却在高达 100 µM 时也无法杀死线虫。因此，咪唑-硫醇并不是 selectivin 致死作用的原因。 M1、M2、M3 馏分中的主要质荷比信号及其 MS/MS 碎裂模式，分别与 selectivin-A 某种亲电性亚砜代谢物的 γ-谷氨酰半胱氨酸结合物、谷胱甘肽结合物和半胱氨酸结合物相符（图 3a–c）。对 HPLC 纯化的 M2 馏分进行核磁共振（NMR）表征，结果与谷胱甘肽的硫原子在该亚砜代谢物的亲电 β-碳上发生加成反应的结构相符（图 3d 及扩展数据图 2）。因此，我们将代谢物 M2 鉴定为 selectivin-A 亲电性亚砜代谢物的谷胱甘肽结合物。正如反应性亲电体的普遍情况，我们无法分离得到未结合态代谢物的纯品，因此根据谷胱甘肽结合物推断其结构——这是药物生物激活研究中的通行做法。我们推测 M1 和 M3 分别是同一亚砜代谢物的 γ-谷氨酰半胱氨酸结合物和半胱氨酸结合物。烷基化裂解并未降低虫体裂解液中亚砜结合物的丰度，表明它们是在体内生成的。 综合而言，我们的数据提示线虫体内存在一条经典的解毒途径：谷胱甘肽在酶的催化下结合到潜在有毒的亲电性亚砜代谢物上，使其与细胞内的亲核物质（如蛋白质和 DNA）隔离；随后，结合态的谷胱甘肽被酶促转化为 γ-谷氨酰半胱氨酸和半胱氨酸，形成易于排出体外的代谢物（图 3e）。另一种并不互斥的可能是，亚砜代谢物无需酶催化即可自发地与谷胱甘肽及其他低分子量硫醇反应。无论哪种机制，亚砜结合物在虫体组织中的大量积累都表明：亚砜代谢物的生成速度超过了线虫的解毒能力。 我们无法直接检验亚砜代谢物是否导致致死，因为尽管尝试了多种氧化方案，仍无法在实验室中合成它。作为替代，我们检验了外源添加 N-乙酰半胱氨酸乙酯（NACET）能否抑制 selectivin 的致死作用——NACET 可被酶促转化为半胱氨酸，用于合成新的谷胱甘肽。NACET 此前被用于阻断对乙酰氨基酚（扑热息痛）过量造成的损伤：该药过量时会积累一种反应性亲电代谢物，耗尽谷胱甘肽并与蛋白质反应，导致肝毒性。我们推测亚砜代谢物可能通过类似机制杀死线虫。结果，给予 2.5 mM NACET 确实抑制了 selectivin 的致死作用，这表明亚砜代谢物就是体内的活性杀线虫物质（图 3f）。 为鉴定负责 selectivin 生物激活的 CYP 酶，我们通过 RNA 干扰（RNAi）逐一敲低了 76 种秀丽隐杆线虫微粒体 CYP 酶中的 60 种，并检测对 selectivin-A 的抗性。cyp-35c1 敲低赋予了对 selectivin-A 的抗性，提示它参与生物激活（图 3g）。我们用 cyp-35c1 缺失突变株验证了这一结果：该突变株对全部三种 selectivin 类似物均表现出抗性（图 3h）。此外，与野生型相比，cyp-35c1 缺失突变体组织中 M1、M2、M3 的丰度减少了一半（图 3i），支持反应性亚砜代谢物由 CYP-35C1 产生。缺失突变体中代谢物的生成并未完全消失，提示还有其他 CYP 酶以冗余方式参与亚砜代谢物的生成——这种冗余或许解释了为什么我们的正向遗传筛选未能找到 cyp-35c1：遗传筛选使用的 L1 幼虫对 selectivin-A 的敏感性是 RNAi 筛选及后续剂量-反应分析所用年轻成虫的两倍。为直接证明 CYP-35C1 能产生反应性代谢物，我们将它在出芽酵母中异源表达，并检测反应性代谢物的生成及 selectivin 诱导的生长抑制。与野生型酵母不同，表达线虫 CYP-35C1 的酵母大量产生了 selectivin-A 的亚砜结合物，并对 selectivin 的细胞毒性敏感（图 3j–l）。这些结果证明，CYP-35C1 对 selectivin 亚砜代谢物的生成既必要又充分，并进一步支持 selectivin 被生物激活为毒性亲电体的结论。 图 3｜selectivin 被生物激活为毒性亲电体。a–c：代谢物 M1/M2/M3 的质谱与碎裂分析，鉴定为亚砜代谢物的 γ-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、半胱氨酸结合物。d：M2 的 NMR 结构确证。e：代谢通路示意图——CYP-35C1 将 selectivin-A 氧化为亲电性亚砜，再经谷胱甘肽途径解毒。f：补充谷胱甘肽前体 NACET 可拯救线虫。g–i：RNAi 筛选与缺失突变体验证 CYP-35C1 的作用。j–l：在酵母中表达 CYP-35C1 足以让酵母产生代谢物并被 selectivin 杀死。（图片来源：原文 Fig. 3）7.2 解读 解读：杀虫机制全解析 这一节拼出了完整的分子机制图景：selectivin-A 被线虫的 CYP-35C1 在噻唑环的硫原子上氧化，生成一个高反应性的亚砜中间体。这个亚砜是亲电体，会攻击细胞内的亲核物质（蛋白质、核酸），造成广泛的细胞损伤——这正是它难以通过单基因突变产生抗性的原因。 线虫自己也知道这东西危险：谷胱甘肽（GSH）系统会把它结合掉并逐步降解为可排泄的 M1/M2/M3。但 CYP-35C1 生产亚砜的速度超过了谷胱甘肽系统的解毒能力，防线被压垮，线虫死亡。补充 NACET（谷胱甘肽原料）能救活线虫，直接证明压垮解毒系统就是致死机制。 这与扑热息痛过量的肝毒性机制（NAPQI 亲电代谢物耗尽谷胱甘肽）如出一辙——作者巧妙借用了药物毒理学的经典概念。 遗传与生化证据互补：cyp-35c1 缺失只让代谢物减少一半（说明有其他 CYP 酶冗余参与），但酵母异源表达实验证明 CYP-35C1 单独就足够完成激活。必要性加充分性，论证完整。八、生物激活为线虫所特有8.1 原文译文 鉴于 selectivin 具有选择性杀线虫活性，我们提出其生物激活可能在系统发育上局限于线虫。为检验这一点，我们分析了 5 种线虫（横跨 4 个属、2 个进化分支）以及 3 种来自不同门的非线虫物种的裂解液和孵育缓冲液中的 selectivin-A 代谢物（扩展数据图 3a、b）。受试的非线虫物种是酿酒酵母、黑腹果蝇和斑马鱼。全部 5 种线虫——包括植物寄生线虫南方根结线虫——都大量产生了亚砜代谢物的低分子量硫醇结合物。相比之下，3 种非线虫物种产生的结合物显著更少。值得注意的是，在酵母的裂解液和缓冲液中，用 HPLC-DAD 和质谱均检测不到这些结合物；在果蝇的裂解液和缓冲液中，用 HPLC-DAD 也检测不到，仅能用质谱在果蝇裂解液中检测到极低水平的半胱氨酸结合物。斑马鱼产生的结合物不到秀丽隐杆线虫的四分之一，也不到其他受试线虫的一半。 此外，在整个孵育期间，谷胱甘肽结合物（M2）在所有 5 种线虫的组织中都大量积累，而在非线虫物种的组织中则不然。这说明大量生成亚砜代谢物并使解毒途径饱和，是线虫的共性而非其他门类的共性。值得注意的是，selectivin-A 母体化合物在非线虫物种组织中的积累量与在秀丽隐杆线虫组织中相当、甚至更高——这说明生物利用度不足不太可能是非线虫物种代谢物生成少的原因，也进一步证明 selectivin 必须经过生物激活才能致死。综合而言，这些数据表明：包括 PPN 在内的不同线虫物种都能强烈地生物激活 selectivin，而将 selectivin 激活为急性毒性代谢物的能力在系统发育上为线虫所特有。未来还需要进一步研究在某些非线虫物种中观察到的低水平代谢物生成的长期影响。 扩展数据图 3｜selectivin 的生物激活具有线虫特异性。对 5 种线虫与酵母、果蝇、斑马鱼进行比较：亚砜结合物 M1–M3 只在线虫体内大量生成并在组织中积累；而非线虫物种虽然摄入了等量甚至更多的母体药物，却几乎不产生毒性代谢物。（图片来源：原文 Extended Data Fig. 3）8.2 解读 解读：选择性从哪里来 图 1 已经证明 selectivin 对其他生物毒性低，这一节则回答了为什么：选择性的根源不在摄入（非线虫生物照样吸收母体药物），而在代谢——只有线虫拥有能把 selectivin 转化为毒性亚砜的 P450 酶组合。 这相当于把选择性建立在物种间酶系的进化差异之上，比依赖某个受体蛋白的结构差异更稳健：斑马鱼虽有大量 P450 酶，却不能有效完成这一步硫氧化。 从应用角度看，这解释了为什么 selectivin 对鱼类、昆虫和（推测的）哺乳动物安全，也为农药登记中的生态毒理评估提供了机制性依据。九、防治植物寄生线虫的先导杀线虫剂9.1 原文译文 selectivin 的选择性、广谱活性和全新作用机制令人鼓舞，因此我们进行了类似物系列筛选，以鉴定能有效控制根部感染的先导杀线虫剂——防治对象是南方根结线虫（M. incognita），世界上最具破坏性的作物病原体之一。筛选系列包括 11 种类似物，以及全部 4 种可购得粉末的市售新一代土壤施用合成杀线虫剂：氟砜灵、氟吡菌酰胺、异菌脲和 tioxazafen。selectivin 类似物通过购买或合成获得。试验在土壤环境中以番茄为宿主植物进行（图 4a）。基于土壤的测定对确立候选杀线虫剂的实际应用价值至关重要，因为许多体外有效的化合物会因迁移性差和/或易降解而在土壤中失效。测定方法：向 90 g 盆栽土壤中加入 20 ml 浓度为 45 µM 的化合物水溶液，以及 1000–2500 条侵染性二龄幼虫（J2）。最终土壤浓度约为 2.5 ppm，即每公顷 4.5 kg，与商业杀线虫剂的施用率相当。24 小时后，将 2–3 周龄的番茄幼苗栽入土壤。8 周后，计算各化合物相对于未处理对照减少根部虫卵数量的有效率。 在受试的 15 种化合物中，selectivin 类似物 A、C、E 和 4 种商业杀线虫剂的有效率与零效应有显著差异（单样本 t 检验，P < 0.01）（图 4a）。氟砜灵和氟吡菌酰胺的有效率接近 100%，表现最佳；与先前报道一致，异菌脲是效果最差的商业杀线虫剂（38% 有效）。selectivin-A 和 selectivin-E 是最有效的 selectivin 类似物（分别为 43% 和 56% 有效），其效力与 tioxazafen 无显著差异（单尾 t 检验，P > 0.05）。值得注意的是，我们用于侵染植物的线虫密度至少是田间高密度的两倍，这可能是部分杀线虫剂在本测定中未能完全奏效的原因。包括 selectivin-A 和 selectivin-E 在内的大多数 selectivin 处理使番茄根重相对未处理对照增加，这很可能是因为线虫负担减轻了。 为评估 selectivin-A 和 selectivin-E 对植物寄生线虫的选择性，我们用一组系统发育多样且易于实验操作的非靶标体系进行了测试，包括根际细菌、真菌、植物、自由生活线虫（包括土壤有益线虫 Phasmarhabditis hermaphrodita）、昆虫、鱼类和两种人体细胞（图 4b、c）。其中一种人体细胞是 HepaRG——一种肝祖细胞系，是评估人肝药物代谢和生物激活的成熟模型。我们还将所有可购得的新开发合成杀线虫剂、天然产物杀线虫剂阿维菌素（abamectin）、有机磷杀线虫剂苯线磷（fenamiphos）以及仍在使用的氨基甲酸酯杀线虫剂杀线威（oxamyl）纳入测试。selectivin-E 的选择性在所有受试杀线虫剂中表现最佳：在最高测试浓度 100 µM 下，它对所有非靶标体系均无活性。相比之下，每一种商业杀线虫剂都至少在一种非靶标测定中表现出不希望出现的毒性。值得注意的是，selectivin-E 对分析中纳入的三种自由生活线虫均不致死，提示它对非靶标的土壤有益线虫可能无害——这些自由生活线虫并不产生 selectivin-E 的反应性亚砜代谢物，而很可能是通过羟基化及随后的磷酸葡萄糖苷化将其解毒（扩展数据图 5）。selectivin-A 对自由生活线虫有活性（若干市售新一代杀线虫剂同样如此），但其对线虫的选择性仍优于大多数受试商业杀线虫剂。selectivin-A 和 selectivin-E 具有亲脂性（logP 约为 4），水溶性中等。这些性质表明它们不易淋溶进入地下水，也不太可能被植物系统性吸收，从而限制了水果和其他供消费者食用的植物产品中的农药残留。综合来看，这些数据表明，我们表现最佳的先导杀线虫剂能够高效且选择性地控制线虫害虫。展望未来，还需要针对更多影响土壤健康的生物以及具有商业价值的植物测试 selectivin。 图 4｜selectivin-A 和 selectivin-E 是防治植物寄生线虫的先导杀线虫剂。a：11 种类似物与 4 种商业药剂在土壤-番茄体系中防治南方根结线虫的有效率（约 2.5 ppm）。b：拟南芥幼苗在不同药剂处理下的生长与绿化情况，selectivin 处理组长势良好。c：10 种药剂对 9 类非靶标生物（根际细菌、真菌、自由生活线虫、果蝇、斑马鱼、人体细胞）的剂量-反应热图——selectivin-E 整行几乎全白（无毒性），而多数商业药剂至少在一种非靶标生物上有毒性。（图片来源：原文 Fig. 4）9.2 解读 解读：从培养皿走向土壤 农药研发中大量体外有效的化合物会死在土壤这一关（被吸附、被降解、迁移不到靶标）。作者直接用土壤-番茄-线虫体系做 8 周盆栽试验，且接虫量是田间高密度线的两倍以上，条件相当苛刻。 结果：selectivin-E 有效率 56%、selectivin-A 为 43%，与已上市的新一代药剂 tioxazafen 相当，但不及氟砜灵和氟吡菌酰胺（近 100%）。不过图 4c 揭示了 selectivin 的差异化优势——安全性：selectivin-E 对全部 9 类非靶标生物在 100 µM 下完全无毒，包括有益根际细菌和土壤有益线虫；而高效的两个商业药剂都有非靶标毒性。这正是低 ppm 用量下的选择价值。 值得注意的转化细节：自由生活线虫能抵抗 selectivin-E，不是因为没有 P450，而是其 P450 走了羟基化-磷酸葡萄糖苷化的解毒路线——同一骨架、不同卤素取代，代谢命运完全不同，这为后续结构微调指明了方向。 logP≈4 的理化性质意味着药剂留在根际而不下渗污染地下水、也不进入果实，对农药登记非常有利。十、CYP4731A3 对 Selectivin-A 的生物激活10.1 原文译文 为鉴定南方根结线虫中负责生物激活 selectivin 的 CYP 酶，我们利用了此前用于验证秀丽隐杆线虫 CYP-35C1 的酵母 CYP 表达系统（图 3j–l）。我们在不同的酵母菌株中分别表达了 19 种不同的南方根结线虫 CYP 酶，并测定它们在 50 µM selectivin-A 或 selectivin-E 存在与否时的生长情况。这 19 种 CYP 酶是通过生物信息学分析从最新版本的南方根结线虫基因组中鉴定出的 31 种 CYP 酶的代表性子集。在 selectivin-A 处理下，表达南方根结线虫 CYP4731A3 的酵母细胞比未处理细胞生长更慢（图 5a、b）；相比之下，携带空载体的酵母对 selectivin-A 处理相对不敏感。表达 CYP4731A3 的酵母产生了 selectivin-A 的亚砜结合物，而空载体对照菌株则没有（图 5c、d）。这些数据证明 CYP4731A3 能够生物激活 selectivin-A。 值得注意的是，CYP4731A3 在南方根结线虫组织中具有很高的基础表达水平，位列所有表达基因的前 3.5%，并且是我们在基因组中鉴定出的 31 种 CYP 酶中表达量第三高的 CYP。此外，当线虫受到商业杀线虫剂处理时，CYP4731A3 的表达会被诱导上调。综合来看，这些结果提示 CYP4731A3 很可能在体内负责生物激活 selectivin-A。而用 selectivin-E 处理时，19 株表达 CYP 的酵母均未出现生长异常。我们推测，selectivin-E 可能是由未测试的 CYP 酶激活，或由多种 CYP 酶逐步接力激活，也可能具有不依赖 CYP 的作用机制。无论如何，我们为先导杀线虫剂 selectivin-A 鉴定出了靶标 CYP 酶——这将有助于先导化合物的进一步优化，并确立了 CYP 介导的生物激活作为实现选择性杀灭线虫的一条全新途径。 图 5｜南方根结线虫 CYP4731A3 生物激活 selectivin-A。a：19 种 M. incognita CYP 酶的酵母表达筛选火山图，只有 CYP4731A3 达到显著阈值。b：表达 CYP4731A3 的酵母对 selectivin-A 敏感。c、d：该酵母产生亚砜代谢物 M2/M3，空载体对照不产生。（图片来源：原文 Fig. 5）10.2 解读 解读：从模式生物到靶标害虫的最后一公里 前文的机制都是在模式生物秀丽隐杆线虫中阐明的，农业上真正关心的是根结线虫。这一节证明：靶标害虫体内确实存在对应的激活酶 CYP4731A3，且它高表达（所有基因的前 3.5%）、可被杀线虫剂诱导——即害虫在接触药剂时反而可能增强激活能力，这对药效是利好。 酵母异源表达系统在这里扮演了桥梁角色：根结线虫难以培养、难以做遗传操作，借助酵母可以快速完成 19 个候选酶的功能筛选。这套系统本身也申请了专利，可推广用于筛选其他生物激活型农药。 selectivin-E 在这 19 个酶中找不到激活者，留下一个开放问题——它的激活机制可能更复杂，这既是科学悬念，也是后续优化的空间。十一、讨论与展望11.1 原文译文 本文报道了 selectivin 的杀线虫用途及其作用模式的发现——这是一类能通过在线虫体内发生代谢性生物激活而发挥毒杀作用的杀线虫剂。从一小组类似物中，我们鉴定出了能有效防治植物寄生线虫南方根结线虫的有前景的先导化合物。鉴于 selectivin 对多种线虫的广谱活性及其对非线虫门类的无害性，这类新杀线虫剂有潜力选择性地防治多种多样的植物寄生线虫。与市场上若干由杀菌剂或杀虫剂改作他用的新一代杀线虫剂不同，selectivin 是选择性靶向线虫的真正的杀线虫剂。 杀线虫剂以吨级规模施用，因此必须具备可放大的合成路线和低廉的生产成本。我们选择的 selectivin 类似物合成方案满足大规模工业化工艺的许多标准：只需两步反应、两种易得溶剂、温和的反应温度和压力，且无需过渡金属催化剂。此外，selectivin-A 和 selectivin-E 的合成使用廉价、易得且相对无毒的起始试剂。本文报告的产率是两步总产率，中间体在步骤之间未经纯化或分离，这对大规模合成十分有利。 近年来，将土壤有益微生物——如昆虫病原细菌、真菌和线虫，以及植物促生根际细菌（PGPR）和菌根真菌——施用于土壤或种子，已成为综合害虫管理策略的常见组成部分。理想情况下，新杀线虫剂应当与这些生物相辅相成而非相互拮抗。值得注意的是，我们的先导杀线虫剂 selectivin-E 对 PGPR 中的 Pseudomonas simiae 以及土壤有益的灭螺线虫 P. hermaphrodita 均无影响，提示它可以与土壤有益微生物联合用于 PPN 防治而不损害后者的效用。我们的另一种先导杀线虫剂 selectivin-A 对 P. simiae 和两种不同的真菌同样无害。然而，尽管 selectivin-A 的线虫选择性优于所考察的大多数商业杀线虫剂，它对 P. hermaphrodita 和其他自由生活线虫却是致死的。这一性质并不排除其商业开发的可能——若干新一代商业杀线虫剂（如阿维菌素、氟吡菌酰胺和 tioxazafen）对自由生活线虫同样致死——但应尽量减少其对有益土壤线虫群落的潜在不利影响。原则上，一种缓解办法是将 selectivin-A 制成种子处理剂，使其活性局限在种子与幼苗周围的集中区域。事实上，阿维菌素和 tioxazafen 都是以种子处理剂的形式制剂的。 我们的工作证明，由线虫生物激活的化合物可以对差异悬殊的多种线虫广泛有效。这一结果或许出人意料，因为线虫激活型化合物的广谱活性取决于酶表达与活性在种间和种内的低变异性，而药物代谢在同一物种的不同个体之间通常存在差异。因此，工业界的药物发现项目此前忽视了前体型杀线虫剂（pro-nematicide）策略，并不令人意外。尽管本研究聚焦于 PPN 防治，这一策略同样可以应用于开发驱虫药，用于治疗寄生于人类、家畜和伴侣动物的蠕虫感染。11.2 讨论解读 解读：这项工作改变了什么 范式价值：把药物代谢从减毒因素变成增毒武器。传统农药筛选追求直接活性，代谢通常被视为失效或毒性隐患；本文反其道而行，证明宿主选择性代谢激活可以同时解决效力与选择性两大难题。前药概念在医药领域很成熟（如许多抗病毒药），在农药领域却是开创性的。 应用价值：selectivin-E 是目前报道的选择性 profile 最干净的杀线虫剂——对所有测试的非靶标生物无毒，且兼容生物防治微生物，契合综合害虫管理（IPM）的趋势；两步合成工艺则照顾了吨级生产的成本约束。 局限与展望：（1）田间效力（43–56%）尚不及最好的商业药剂（近 100%），需要结构优化提升；（2）selectivin-A 对有益自由生活线虫有毒，种子处理剂化是务实的缓解方案；（3）selectivin-E 的激活机制未明；（4）非线虫物种低水平代谢的慢性影响待评估；（5）尚需更多土壤生态与多种作物的验证。 更远的前景：这一前体型（bioactivated）策略有望拓展到人畜驱虫药领域——抗寄生虫药物同样面临抗性危机与选择性难题。十二、研究方法概要 论文的方法部分非常详尽，涵盖八大类实验体系。以下按主题编译要点，便于读者把握研究的技术路线（细节请参见原文 Methods）。12.1 线虫培养与剂量-反应测定 使用秀丽隐杆线虫 N2 野生型、emb-8 温敏突变株、cyp-35c1 缺失株及 8 株抗药性突变株；另有 C. briggsae、P. pacificus、Rhabditophanes KR3021、P. hermaphrodita 等自由生活线虫。L1 幼虫在 96 孔板中与化合物共孵育 3 天后计数存活率，计算相对存活率与 LC50。牛寄生虫 C. oncophora 采用虫卵孵化抑制实验；根结线虫（M. incognita、M. chitwoodi、M. hapla）采用 J2 幼虫微孔板测定。12.2 代谢物分析（HPLC-DAD 与质谱） 线虫、斑马鱼、果蝇幼虫和酵母分别与 100 µM selectivin-A 孵育 6 小时，裂解后经反相 HPLC（Zorbax SB-C8 柱）分离，以二极管阵列检测器在 190–602 nm 扫描。色谱图经干重归一化并扣除溶剂对照背景。代谢物馏分经 Q-TOF 电喷雾质谱与 MS/MS 碎裂鉴定结构；M2 馏分经大规模培养（600 万条 L1）富集纯化后用 NMR（COSY、HSQC、HMBC）确证结构。12.3 遗传学与筛选 正向遗传筛选：EMS 诱变后在 100% 致死剂量平板上筛选幸存突变体，共筛 1030 万个诱变基因组。RNAi 筛选：在 96 孔板中逐一敲低 60 个微粒体 cyp 基因，Z-score > 3 判定为显著抗性。酵母异源表达：将密码子优化的线虫 cyp-35c1、emb-8 及 19 个南方根结线虫 CYP 基因克隆入半乳糖诱导型载体，在酿酒酵母中表达后检测生长抑制与代谢物生成。12.4 非靶标生物与哺乳类安全性 涵盖酿酒酵母与白色念珠菌（生长曲线）、根际细菌 P. simiae、果蝇（成虫运动能力与子代孵化率）、斑马鱼胚胎（心跳与触觉反应）、人 HEK293 与 HepaRG 细胞（CellTiter-Blue 活力测定）、拟南芥幼苗绿化实验，以及小鼠口服毒性实验（50 mg/kg，连续 5 天，设盲评估病理）。12.5 土壤盆栽药效试验 90 g 砂壤土 + 20 ml 45 µM 药液 + 1000–2500 条 J2 幼虫，24 小时后移栽番茄幼苗，温室培养 8 周，次氯酸钠法提取根部虫卵计数，按单位根重虫卵数计算有效率。所有商业对照统一为 4.5 kg/公顷有效成份以保证可比性。12.6 化学合成 selectivin 类似物经 α-溴代苯乙酮与 2-氨基噻唑在乙醇中回流缩合、柱层析纯化制得，两步总产率约 28–38%；产物经 NMR、红外、高分辨质谱表征。研究者曾尝试用过氧化氢、oxone、m-CPBA 三种氧化剂合成亚砜代谢物，均未成功（原料回收、开环或分解），从侧面说明该反应性代谢物极不稳定。十三、附录：扩展数据图表 以下选取原文最具代表性的三幅扩展数据图，帮助读者深入理解正文结论的支撑证据。13.1 扩展数据图 1：咪唑-硫醇代谢物并非活性成分 扩展数据图 1｜selectivin-A 的咪唑-硫醇代谢物（ITM）没有杀线虫活性。a：M4 代谢物的质谱鉴定为 ITM 的二硫醚。b：推测的 ITM 生成途径（咪唑噻唑环经 CYP 依赖方式开环）。c–e：碘乙酰胺烷基化实验证明 ITM 单体在体内形成、二硫醚在裂解后形成。f–h：商业来源的 ITM 即使在 100 µM 下也不杀死线虫，尽管能在虫体内大量积累。（图片来源：原文 Extended Data Fig. 1） 该图排除了一个假阳性候选：M4/ITM 虽然能在虫体内积累，却无毒性，从而把致死的矛头指向亚砜类亲电代谢物。13.2 扩展数据图 4：selectivin 处理改善番茄根系生长 扩展数据图 4｜在南方根结线虫侵染压力下，大多数 selectivin 类似物处理（尤其 selectivin-A 与 selectivin-E）使番茄根重高于未处理对照，说明药剂减轻了线虫危害、帮助根系恢复生长。（图片来源：原文 Extended Data Fig. 4）13.3 扩展数据图 5：自由生活线虫对 selectivin-E 的解毒途径 扩展数据图 5｜自由生活线虫不产生 selectivin-E 的毒性亚砜代谢物，而是生成羟基化（E-M1）、葡萄糖苷化（E-M2）和磷酸葡萄糖苷化（E-M3）代谢物将其解毒，解释了 selectivin-E 为何对土壤有益线虫安全。（图片来源：原文 Extended Data Fig. 5） 此外，扩展数据表 1 显示 8 株对主流驱虫药/杀线虫剂抗药的突变株对 selectivin 的 LC50 与野生型相当（无交叉抗性）；扩展数据表 2 显示，筛选 1000 万个基因组未获 selectivin 抗性株，而同样方法对左旋咪唑、阿苯达唑、伊维菌素、wact-11 分别筛得 31、22、8、15 株抗性突变体——对比鲜明。十四、术语对照表 术语（英文） 中文释义 nematicide 杀线虫剂 plant-parasitic nematode (PPN) 植物寄生线虫 selectivin selectivin，本文命名的选择性杀线虫剂家族（selective + nematicide 的缩合），可译作选择性杀线虫素 bioactivation / pro-nematicide 生物激活／前体型杀线虫剂：母体化合物本身低毒，需经生物体代谢转化为活性毒物 cytochrome P450 (CYP) 细胞色素 P450：一类广泛参与药物与外源物氧化代谢的血红素酶 EMB-8 / POR 秀丽隐杆线虫的 P450 氧化还原酶，为所有微粒体 CYP 酶提供电子 CYP-35C1 秀丽隐杆线虫中负责激活 selectivin 的主要 P450 酶 CYP4731A3 南方根结线虫中负责激活 selectivin-A 的 P450 酶 electrophilic sulfoxide 亲电性亚砜：selectivin 被氧化后生成的高反应性毒性代谢物 glutathione (GSH) 谷胱甘肽：细胞内主要的抗氧化与解毒分子，可结合亲电体 NACET N-乙酰半胱氨酸乙酯，谷胱甘肽合成前体，用于验证致死机制 HPLC-DAD 高效液相色谱-二极管阵列检测器 ESI-MS / MS/MS 电喷雾电离质谱／串联质谱 Meloidogyne incognita 南方根结线虫，最具破坏性的植物寄生线虫之一 Caenorhabditis elegans 秀丽隐杆线虫，模式生物 root-knot nematode 根结线虫 logP 油水分配系数的对数，衡量化合物的亲脂性 ppm / kg ha⁻¹ 百万分之一浓度／每公顷千克数（农药施用剂量单位） 【说明】本文为学术论文的翻译解读作品，仅供学习交流使用；原文版权归 Springer Nature 所有（© The Author(s), under exclusive licence to Springer Nature Limited 2023）。文中图片截取自原文，仅用于辅助理解。引用请回归原文：Burns, A. R. et al. Selective control of parasitic nematodes using bioactivated nematicides. Nature 618, 102–109 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06105-5 感谢阅读 生物激活型杀线虫剂 Selectivin · Nature 618, 102–109 (2023) 版权声明 版权属于原作者所有，文章翻译和转载为学术传播。 团队水平有限，翻译和转载难免有不恰当之处，请批评指正，多多包涵！ 往期精彩回顾： #多组学研究 #感染与免疫 #生物医药与生态环境研究 #科技资讯与学术诚信 #衰老研究Aging #人工智能与大数据 点赞！分享！转发！