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OTC2025论坛深度聚焦类器官与疾病建模、新药发现/研发、3D细胞培养、类器官培养及质控。展位咨询请联系：王晨 180 1628 8769。在《Nature》期刊上发表的这篇文章中，日本的科研团队探讨了通过激活Wnt和STAT3信号通路来实现人类成年肝细胞类器官的长期自我更新。这项研究解决了肝细胞在体外培养中扩增能力与功能保持之间的权衡问题。研究发现，YAP的激活促进了肝细胞的增殖，但会导致其向胆管导管谱系的分化。相反，OSM诱导的STAT3激活不仅促进了肝细胞的增殖，还抑制了导管化生，维持了肝细胞的特性。移植到小鼠体内的肝细胞类器官能够重新构建受体小鼠肝脏的代谢分区结构，并在去除培养基中的特定因子后形成具有胆管网络的绳索状结构，表现出与体内肝细胞相当的主要肝脏代谢功能。该研究为开发针对人类肝脏疾病的治疗策略提供了新的途径。01研究背景首先，肝脏是人体内一个关键的代谢器官，负责多种重要的生物化学过程，如葡萄糖生成、糖原合成、尿素循环、脂质生成、胆汁酸合成、蛋白质生产和药物代谢。这些功能的严重损害会导致肝功能衰竭，通常需要进行肝移植。近年来，随着抗病毒治疗的进步，肝功能衰竭的病因从病毒性肝炎转向与现代生活方式相关的代谢性肝病，特别是代谢功能障碍相关的脂肪性肝病。这种疾病如果不加以治疗，会进展为脂肪性肝炎、肝硬化和肝功能衰竭。然而，由于缺乏能够真实再现肝脏代谢功能的人类肝细胞模型，预防代谢性肝病的成功率有限。其次，体外分离的肝细胞在增殖能力上迅速下降，与其在体内的强大再生能力形成对比。现有的培养方法只能暂时维持初级人类肝细胞的功能性，但会影响其扩增能力。虽然一些研究尝试通过不同的策略来克服这一限制，如使用小分子抑制剂促进肝细胞的扩增，但这些方法往往导致胆管化生，即功能性细胞被重新编程为增殖能力较强的细胞。这种现象被称为“paligenosis”，使得在再生医学、药物发现和毒理学领域中使用人类肝细胞面临重大挑战。因此，开发一种能够长期扩增且保持功能性的人类肝细胞培养系统至关重要。02研究发现人类成年肝细胞类器官的长期扩增和功能保持：研究团队通过激活Wnt和STAT3信号通路，实现了人类成年肝细胞类器官的长期自我更新。YAP信号的激活促进了肝细胞的增殖，但会导致其向胆管细胞谱系分化。相反，Oncostatin M通过激活STAT3信号，促进了肝细胞的增殖，同时抑制了胆管化生，保持了肝细胞的特性。研究表明，这种类器官在移植到小鼠体内后，能够重建受体小鼠肝脏的代谢分区结构，并在去除特定培养因子后，形成具有胆小管网络的肝索样结构，表现出与体内肝细胞相当的主要肝脏代谢功能。类器官在基因编辑和疾病建模中的应用潜力：研究表明，这些肝细胞类器官可以进行基因编辑，从而为代谢性肝病的功能建模提供了可能性。新开发的培养系统为人类肝病的治疗策略开发提供了一个有前景的途径。通过优化的培养条件，研究团队成功地在体外模拟了肝细胞的代谢功能，这标志着功能性类器官医学的新时代。03临床意义肝移植的替代方案：HHOs可能成为肝移植的替代方案，特别是在供体短缺或无法进行肝移植的情况下。  药物筛选和毒性测试：HHOs展示的药物代谢能力与体内肝细胞相似，使其成为药物筛选和毒性测试的理想模型。这可以加速新药的开发和安全性评估。  代谢性肝病的研究和治疗开发：HHOs提供了一个真实反映人类肝脏代谢功能的平台，有助于深入研究代谢性肝病的病理机制，并开发针对这些疾病的治疗策略。  再生医学的应用：由于HHOs能够进行基因编辑，它们可用于研究遗传性肝病并探索基因治疗的可行性。  总之，该研究不仅为肝细胞的体外长时间培养提供了新的策略，还为肝脏相关疾病的基础研究和临床应用开辟了新的方向。04实验策略1. 信号通路激活与抑制：  通过激活Wnt和STAT3信号通路，实现人类成年肝细胞类器官的长期自我更新。 YAP激活促进肝细胞增殖，但同时导致其向胆管导向分化。 通过抑制TGFβ信号和使用Oncostatin M激活STAT3，促进肝细胞增殖并抑制导管化生，从而保持肝细胞特性。2. 类器官培养体系的优化：  在培养基中添加EGF、HGF、FGF-10、Wnt/R-spondin、TGFβ抑制剂（A83-01和Noggin）、IL-6和PKA激活剂（Forskolin），支持小囊状类器官的形成。 通过去除某些培养因子（如Noggin和forskolin），并补充激素（如生长激素、催乳素和皮质醇），促进肝细胞类器官的线索状结构形成及胆小管网络的建立。3. 体内移植实验：  将类器官移植到经过药物处理以去除肝细胞的小鼠体内，评估其在小鼠肝脏中的再生能力和代谢分区结构的重建。4. 基因编辑与功能建模：  类器官易于进行基因编辑，从而用于代谢性肝病的功能建模。05数据解读图1：人类成人肝细胞类器官在特定因子下的扩增Figure 1 展示了人类成人肝细胞类器官（HHOs）在特定培养条件下的扩增情况，包括使用不同因子如IL-6和OSM对类器官的影响。  A. 为了观察PHH来源的类器官在扩增培养基（加IL-6）中的表达情况，作者进行了免疫荧光染色。结果显示，HHOs表达白蛋白，而ICOs则显示CK19和EpCAM的表达。此结果在三个供体中获得一致性。  B. 为了研究HHOs在扩增培养基中添加OSM或IL-6后的扩增情况，作者通过传代比率和基于ATP的细胞计数估算了细胞数量。每个点代表一次传代事件，三个类器官系在初始3个月内大约每2周传代一次，传代比率为3-12倍，‘x’表示传代失败。供体分别为39岁、53岁和61岁。  C. 为了观察OSM对单个PHH来源类器官生长的影响，作者拍摄了时间推移图像。相同的类器官在相同放大倍率下显示。此结果在两个供体中获得一致性。  D. 为了研究OSM对HHOs基底极性的影响，作者进行了代表性明场和整体免疫染色，标记了CDH1（蓝色）、ZO-1（红色）、整合素β4（绿色）和细胞核（白色）。此结果在四个供体中获得一致性。  E. 为了分析胆管细胞相关转录因子、YAP靶基因和TGFβ信号相关基因的转录组，作者对PHHs、ICOs和HHOs在有无OSM和LATSi（TRULI，5 μM）条件下进行了分析。供体分别为11个月和16个月。  F. 为了观察HHOs在±OSM和±LATSi（5 μM）培养14天后的情况，作者进行了Alb和CK19的免疫染色（左）。细胞核用Hoechst 33342标记。结果显示，CK19+类器官仅在无OSM和有LATSi的条件下观察到（右）。  结论：人类成人肝细胞类器官在特定因子如IL-6和OSM的影响下能够有效扩增，并且不同因子组合对类器官的极性和表型有显著影响。图2：小鼠肝脏用人类肝类器官（HHO）再生Figure 2 展示了通过异种移植方法，将人类肝类器官（HHO）移植到小鼠肝脏中，观察其在小鼠肝脏中的再生情况。  a. 为了研究HHO在小鼠肝脏中的再生能力，作者设计了异种移植实验流程。TK-NOG小鼠在接受ValGCV处理以消融肝细胞后，被移植了HHO或人类原代肝细胞（PHH）。每周采集血液样本，并在8周后收集肝脏样本。  b. 通过苏木精-伊红染色（H&E）和STEM121染色，展示了HHO移植物的代表性图像。结果显示，移植的小鼠和人类肝细胞之间有明显的界限。类似结果在21个PHH移植物（来自五个供体）和104个HHO移植物（来自八个供体）中获得。  c–h. 研究了PHH或HHO（来自两个供体）在小鼠肝脏中的再生情况。通过测量血清中人类白蛋白（hALB）的浓度随时间的变化来评估再生效果。不同的HHO传代次数用不同颜色表示；‘x’表示小鼠死亡。STEM121染色显示了PY53和PY30 HHO移植物。再生效率通过人类肝细胞面积相对于总肝脏面积的比例计算。每个点代表一只小鼠。统计分析显示，与对照组PHH相比，HHO组的再生效率显著提高。  i. 对HHO移植物进行了hALB（红色）、闭合蛋白（绿色）和人类MRP2（蓝色）的染色。结果显示，来自PHH（一个供体）和eHHO（三个供体）的数据具有相似的结果。  j. 在HHO移植物中对分区标记物进行染色，HAL（红色；顶部）位于门静脉附近，CYP2E1（红色；底部）位于中央静脉附近。细胞核用Hoechst 33342（白色）染色；移植细胞为STEM121+（绿色）。门静脉和中央静脉的腔用虚线标出（*表示门静脉）。来自PHH（两个供体）和eHHO（HAL为六个供体，CYP2E1为八个供体）的代表性数据显示了相似的结果。  k,l. 分别显示了在STEM121+区域内HAL+（k）或CYP2E1+（l）面积的比例。每个点代表一只小鼠的一个切片；每种条件下来自两到三只小鼠的平均比例。使用Welch双侧t检验进行统计分析。  结论：HHO能够在小鼠肝脏中有效再生，并表现出与人类肝细胞相似的功能特性。图3：建立具有代谢功能的dHHOs（分化后的人体肝细胞类器官）Figure 3 展示了文章中的一项关键实验，即分化后的人体肝细胞类器官（dHHO）建立及其代谢功能的评估。  形态变化： dHHOs从上皮样结构转变为肝细胞样结构，显示出成熟的形态特征。 胆汁酸代谢： 实验证明dHHOs可以合成胆汁酸，并在胆汁小管中运输荧光标记的胆汁酸衍生物，表明其具有生理功能。 胆汁酸的合成和分泌： LC–MS/MS分析显示，与体外培养的人体肝细胞相比，dHHOs产生更高浓度的胆汁酸。 甘油三酯生产： dHHOs能够合成甘油三酯，并在存在微粒体甘油三酯传输蛋白抑制剂时被阻断，验证了其代谢活性。 结论： 这些成功的分化实验及其结果表明，通过优化培养条件，dHHOs不仅展示了典型的胆汁酸代谢功能，还具备了潜在的药物发现和毒理学研究的应用能力。这为将来利用类器官模型进行更深层次的人类肝脏代谢研究奠定了基础。图4：建立门静脉肝细胞类器官Figure 4 展示了对分化后的人体肝细胞类器官（dHHOs）的功能评估，特别是在再现肝脏门静脉区域特定功能方面的能力。  葡萄糖合成与糖异生： dHHOs在饥饿后展示了较高的葡萄糖生成能力，并成功追踪到13C标记的葡萄糖合成路径，证实了其有效的糖异生能力。 尿素合成： 使用15N标记氯化铵进行追踪，发现dHHOs能够转变氨为尿素，验证了其尿素循环的完整性。 线粒体功能活性： dHHOs显示出高于eHHOs的最大呼吸能力，提示其具有更活跃的氧化磷酸化水平。 白蛋白和凝血因子生产： dHHOs能够合成接近人体生理水平的白蛋白，并在维生素K存在下增加凝血因子的活性。 结论： 通过一系列功能性实验，Figure 4展示了dHHOs在多种重要肝脏代谢功能方面的恢复能力，特别是与门静脉区域相关的功能。这包括葡萄糖生成、尿素合成及相应代谢途径的活跃性，表明dHHOs可以作为体外研究人类肝脏功能和代谢疾病的有效模型。图5：生成基因敲除的肝细胞类器官Figure 5 展示了通过基因编辑技术生成基因敲除的人体肝细胞类器官（HHOs）的过程和结果。  基因敲除成功： 成功通过sgRNA实现了对G6PC和OTC基因的敲除，Sanger测序和免疫检测确认了对应蛋白的缺失。 形态和功能保持： 尽管基因敲除，G6PC和OTC缺失的HHOs仍然保持了正常的类器官形态，并能够合成一定水平的白蛋白。 功能影响： G6PC敲除使得糖异生功能降低，而OTC敲除导致瓜氨酸生成的缺失，验证了各基因在其代谢途径中的关键角色。 培养条件优化： 通过使用LATSi和人血小板裂解物，促进了基因编辑HHOs的扩增，而没有引起生长停滞或管道分化。 结论： Figure 5描述了一种有效的流程来对成人肝细胞类器官进行基因敲除，从而提供一种稳定的模型来研究肝脏代谢疾病。这一进展为通过基因编辑技术探索肝脏功能、发现疾病机理和开发治疗策略提供了可能性。06主要结论这项研究展示了一种新的培养系统，该系统能够在体外长期扩增人类成体肝细胞类器官（HHOs），并保持其代谢功能。通过激活Wnt和STAT3信号通路，研究人员成功实现了HHOs的自我更新，并避免了导管化生的发生。HHOs能够重新构建受体小鼠肝脏的代谢分区结构，并在体外展示出与体内肝细胞相当的主要肝脏代谢功能。这种文化系统为肝脏疾病的治疗策略开发提供了新的途径。07讨论总结研究强调了HHOs技术在解决人类成体肝细胞体外扩增与功能性之间权衡的潜力。通过基因组学分析，关键的培养因子如EHF、Wnt/R-spondin、Noggin、TGFβ抑制剂、OSM和福司可林被确定为促进肝细胞扩增的必要因素。特别地，OSM-STAT3激活不仅促进了肝细胞的增殖，还保留了肝脏谱系的完整性，防止了导管化生和上皮-间质转化。  研究指出，HHOs技术代表了一种新的类器官培养系统，兼具肝细胞的扩增性和功能性。其优点包括提供了一个稳定、可重复且成本效益高的平台，用于探索人类肝脏代谢，超越了传统的人类肝细胞模型的局限性。此外，HHOs在再生医学中的潜在应用为解决肝衰竭问题打开了新的视野。END免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。OTC2025论坛深度聚焦类器官与疾病建模、新药发现/研发、3D细胞培养、类器官培养及质控。展位咨询请联系：王晨 180 1628 8769。戳“阅读原文”立即领取OTC2025免费参会名额!

缺氧诱导因子 2α (HIF-2α, hypoxia-inducible factor 2α) 是透明细胞肾细胞癌 (ccRCC) 的关键致癌驱动因素。默沙东的第一代 HIF-2α 抑制剂 PT2385 在 ccRCC 患者中表现出良好的临床活性。然而，PT2385 受到可变且剂量有限的药代动力学的限制。本文描述了第二代 HIF-2α 抑制剂 PT2977 的发现，该抑制剂通过氟取代实现了药效增强、及减少 2 相代谢促进药代动力学特征的改善。对于小分子药物的PK优化具有显著参考意义，同样强调了临床候选分子多动物模型PK研究的重要性。PT2977（Belzutifan）已于2021年获批上市治疗透明细胞肾细胞癌，2025-02-18 批准上市用于治疗VHL综合征相关肿瘤。 肾癌是最常见的 10 种癌症之一。透明细胞肾细胞癌 (ccRCC) 是最常见的肾癌形式。尽管靶向疗法和免疫疗法已大大改善了 ccRCC 患者的预后，晚期或转移性疾病患者 5 年存活率只有 12%。对于患有转移性疾病的 ccRCC 患者，迫切需要更好的治疗方案。 在大多数患者中，ccRCC 的特征是由于遗传易感性、体细胞突变或甲基化导致肿瘤抑制因子 von Hippel–Lindau (VHL) 失活。VHL 蛋白 (pVHL) 是 E3 泛素连接酶复合物的组成部分，可介导蛋白酶体的蛋白质降解。pVHL 的主要作用是调节缺氧诱导因子 (HIF) 转录因子家族，包括 HIF-1α、HIF-2α 和较少表征的 HIF-3α。与 HIF-1α 不同，在成人中，HIF-2α 的表达仅限于内皮细胞、肾成纤维细胞、肝细胞、肠腔上皮细胞、胰腺间质细胞、心肌细胞、间质细胞和肺 II 型肺泡细胞。重要的是，HIF-2α 活性已被证实是 ccRCC 中的关键致癌驱动因素。在小鼠 ccRCC 肿瘤模型中，pVHL 缺陷细胞系中 HIF-2α 表达的抑制可抑制肿瘤生长，效果与重新引入 pVHL 相当。此外，稳定变体 HIF-2α 的表达能够克服 pVHL 的肿瘤抑制作用。HIF-2α 还被证实有助于其他恶性肿瘤（如多形性胶质母细胞瘤）的肿瘤形成，其中缺氧是肿瘤微环境的一个关键特征，并且已观察到 HIF-2α 活性与生存率之间的相关性。 HIF-2α 的活性受氧依赖性缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶 (PHD) 控制。 当氧气供应充足（常氧）时，这些酶会使 HIF-2α 氧依赖结构域上的特定脯氨酰残基羟基化，从而为 pVHL 产生底物识别位点。pVHL 识别修饰形式的 HIF-2α，与其结合，并将其作为靶标进行快速蛋白酶体降解。在缺氧条件下，PHD 没有足够的氧气来催化 HIF-2α 的羟基化，并且 pVHL 无法结合未修饰的 HIF-2α。因此，HIF-2α 会积聚并转移到细胞核中，在那里它与组成性表达的芳烃受体核转运蛋白 (ARNT，也称为 HIF-1β) 二聚化，形成活性转录因子复合物。该复合物可识别 DNA 上的缺氧反应元件 (HRE)，从而增加多种蛋白质的表达，其中许多蛋白质协同调节血管生成、增殖、迁移和免疫逃避。在 ccRCC 中，绝大多数患者的 pVHL 存在缺陷或缺失，这导致 HIF-2α 即使在常氧条件下也会积累和转录激活。 尽管靶向 DNA 结合转录因子存在固有困难，但开创性的研究表明，与 HIF-2α 内袋结合的小分子可以变构抑制 HIF-2α 和 ARNT 之间的蛋白质 - 蛋白质相互作用，从而抑制转录活性。在之前的报告中，我们披露了我们在迭代基于结构的药物设计和合理修改的指导下所做的努力，以确定一系列具有优异效力和物理和药理特性的新型 HIF-2α 抑制剂。这项工作导致了第一代 HIF-2α抑制剂化合物 1 （PT2385）的发现（图 1），这是第一个进入临床开发的 HIF-2α 抑制剂。虽然 PT2385 与高度可变的药物暴露相关，但在接受过大量治疗的晚期 ccRCC 患者中观察到抗肿瘤活性，提供了 HIF-2α 靶点验证。本文通过优化效力和 DMPK 特性导致了从 PT2385 到第二代临床候选化合物 2 （PT2977）的发现。 图 1.　化合物 1 和 2 的结构。 2. 第一代HIF-2α抑制剂PT2385： 人体临床暴露/药效不足 此前，评估 PT2385 安全性、药代动力学 (PK) 和药效学 (PD) 的首次人体研究在晚期 ccRCC 患者中完成。PT2385 以 100-1800 毫克的剂量口服(bid)，按照标准 3 + 3 剂量递增设计，随后以推荐的 2 期剂量 (RP2D，800 mg bid ) 进行扩展阶段。PT2385 耐受性良好，未观察到剂量限制性毒性。PT2385 治疗导致血浆促红细胞生成素 (EPO)（一种 HIF-2α 调节基因）在所有剂量下迅速下降，表明靶标参与的生物活性。PT2385 在这些接受过大量治疗的患者中表现出良好的抗肿瘤活性。与 PT2385 水平低于 500 ng/mL（1.4 个月）的患者相比，PT2385 谷浓度高于 500 ng/mL 的患者的 PFS（14.3 个月）有所改善（图 2）。PT2385 血浆浓度 500 ng/mL 相当于 786-O 细胞（VHL 突变 ccRCC 细胞）中VEGFA分泌试验中的 EC85。 在 786-O 小鼠异种移植模型中，PT2385 谷血浆浓度也需要达到 500 ng/mL 才能达到最大抗肿瘤活性。 图 2.　稳态暴露谷浓度为 <500 ng/mL（红线）的患者与谷浓度为 >500 ng/mL（黑线）的患者无进展生存期 (PFS) 曲线比较。 3. PT2385 的人体 PK 分析 对患者体内 PT2385 药代动力学曲线的评估表明，相当一部分患者暴露不足。所有 25 名接受单剂量 800 mg PT2385 (RP2D) 的患者的个体时间-血浆浓度曲线表明，患者可分为“正常暴露”组和“低暴露”组（ 图 3）。有 6 名患者属于“低暴露”组，他们从 PT2385 治疗中获得的临床益处很少。 图 3.　接受 800 mg PT2385 治疗患者的浓度-时间曲线。红线代表血浆中 PT2385 浓度较低的患者。 预计 PT2385 在人体中的肝清除率将处于低到中等水平，在人肝微粒体 (HLM) 中的提取率 (ER 或观察到的清除率/肝血流量) 为 22%，在人肝细胞中为 44%。在人肝细胞孵育中，HPLC-UV 色谱图唯一可检测到的代谢物是葡萄糖醛酸 PT2639 ( 图 4A)，这表明 PT2385 在人体中的主要代谢途径可能是葡萄糖醛酸化。在临床前研究中，PT2639 不与 HIF-2α 结合，在闪烁近距离分析 (SPA) 中 IC50 大于 100 μM。在 1 期临床试验中，单次口服 800 mg PT2385 后 ，PT2639 的浓度明显高于 PT2385（图 4B）。平均 AUC 和 C max 的代谢物/母体比分别为 6.9 和 9.7。根据临床前数据，患者体内 PT2639 的高浓度有些令人惊讶。虽然犬体内的 PT2639 循环水平很高（PT2639：PT2385 的 AUC 比 = 1.8），但小鼠体内并不存在，且大鼠体内的 PT2639 浓度明显低于 PT2385（PT2639：PT2385 的 AUC 比 = 0.24）。 图 4.　(A) 葡萄糖醛酸代谢物 3 (PT2639) 的结构。(B) 单次口服 800 mg PT2385 后 PT2385 和 PT2639 的平均血浆浓度。 在 I 期剂量递增研究中，PT2385 的 AUC 随着剂量从 100 mg 增加至 800 mg，通常与剂量成比例增加，而当剂量递增至 1800 mg 时并未进一步增加（ 图 5 A）。与母体药物不同，其代谢物 PT2639 在较高剂量下暴露量增加超过比例（ 图 5 B）。对于口服药物，水溶性是一个重要参数，可能导致生物利用度不足和变化。PT2385 是 BCS 2 类化合物，在 pH 7.4（15 μg/mL）时具有中等热力学水溶性，并且具有高渗透性。在临床前物种中，PT2385 在小鼠、大鼠和狗中表现出良好的口服生物利用度。这表明PT2385 大量地代谢为 PT2639 可能是导致其药代动力学特征不佳的主要因素。 图 5.　(A) 剂量-反应图显示 PT2385 的剂量限制性暴露。 (B) 剂量-反应图显示 PT2639 的超比例暴露。 4. PT2385 临床中药代问题的机制？ 为了确定哪种人类尿苷 5'-二磷酸葡萄糖醛酸转移酶 (UGT) 负责直接葡萄糖醛酸化 PT2385，将 11 种重组表达的 UGT 与 50 μM PT2385 一起孵育，并监测 PT2639 的形成 ( 图 6)。结果表明 PT2385 是 UGT2B17 的底物。UGT2B17 主要在人体肠道中表达，其在肠道中的含量远高于肝脏。UGT2B17 在肠道中的 mRNA 表达量比在肝脏中高出约 13 倍， 肠道中的蛋白质丰度比肝脏中高 4.4 倍。在所有 UGT 中，2B17 异构体在肠道中的表达最高。它占肠道中 UGT 异构体总量的 59%，但在肝脏中仅占 3%。基因多态性、肠道中高丰度都导致了口服 UGT2B17 代谢药物的暴露量不同，这可能是首过代谢的结果。 图 6.　重组人 UGT 催化形成 PT2639。 此外，评估了导致患者观察到的 PT2385 剂量限制性药物暴露的其他潜在机制。在小肠中，外排转运蛋白在葡萄糖醛酸代谢物的处置中起着重要作用。P-gp、BCRP 和 MRP2 是小肠中表达的三种主要外排转运蛋白。浓度高达 300 μM 时，PT2385 和 PT2639 在 MDCKII-MDR1 和 MDCKII-BCRP 细胞中的外排比小于 2，这表明它们不是 P-gp 或 BCRP 的底物。在表达人类 MRP2 蛋白的膜囊泡中的 MRP2 转运蛋白测定中，还评估了 PT2385 和 PT2639。未观察到 PT2385 的 MRP2 依赖性摄取。然而，与不含 ATP 的囊泡相比，含有 ATP 的囊泡对 PT2639 的 MRP2 摄取量大约高 32 倍，表明存在主动运输。随着 PT2639 浓度的增加，表达 MRP2 的囊泡对 PT2639 的摄取量达到稳定水平，表明主动运输已达到饱和。MRP2 抑制剂苯溴马隆可消除 ATP 依赖性活性。因此, PT2639 是 MRP2 的底物，并且在较高浓度下 PT2639 可以使 MRP2 饱和。 最终, 提出了一个吸收模型来解释 PT2385 的肠道代谢（ 图 7 ）。口服后，PT2385 通过被动跨细胞扩散被肠细胞吸收。一小部分 PT2385 作为母体运输到血液中，而其余药物则被 UGT2B17 大量代谢形成 PT2639。然后 PT2639 可以遵循两种途径之一：吸收进入血液或主动 MRP2 介导运输到肠腔。一旦进入胃肠道，PT2639 就可以在细菌 β-葡萄糖醛酸酶的作用下转化为 PT2385，后者可以进行肠道重吸收，从而形成再循环。 PT2639 在犬中的 PK数据支持该模型, 给犬静脉 (iv) 和口服管饲 (po) 给药 PT2639 后，两种途径均产生了显著水平的 PT2385，并且口服给药比静脉给药产生的 PT2385 更多。 图 7.　PT2385 吸收模型。 其中, UGT2B17、MRP2 和 β-葡萄糖醛酸酶单独发挥作用和协同作用。这三个成分的遗传多态性和不规则表达可能都在观察到的 PT2385 可变暴露中发挥作用。 5. 化合物设计和先导物优化 尽管模型很复杂，但 PT2385 的药代动力学问题可能都与肠道中 UGT2B17 将 PT2385 大量代谢为 PT2639 有关。因此，主要策略是减少葡萄糖醛酸代谢物的形成，同时保留 PT2385 的效力、选择性和药理学特性。 葡萄糖醛酸化是人体药物代谢的重要途径。葡萄糖醛酸化通常是药物代谢的第二步，作用于氧化代谢产生的羟基化产物。然而，它也可以直接与含有羟基、羧酸、氨基或硫醇官能团的药物发生反应。葡萄糖醛酸化是一种由 UGT 酶催化的 SN2 反应，其中代谢药物或母体药物充当亲核试剂，PT2385 作为二级醇，辅因子 UDP-α-D- 葡萄糖醛酸 (UDPGA, 4 ) 充当亲电试剂（ 图 8）。 图 8.　PT2385 的葡萄糖醛酸化反应。 如图 9 所示，PT2385 的蛋白质抑制剂晶体结构揭示了两种关键的蛋白质-配体相互作用。PT2385 中的羟基与 Tyr281（结合水分子）和 His293 形成氢键网络。HIF-2α 中的三个残基，Met252、His293 和 Tyr278 必须移动以适应这种氢键网络的形成。这些移动导致 HIF-2α 中的 Tyr278 与 ARNT 中的 Phe446 之间发生极为不利的空间冲突，从而导致 HIF-2α：ARNT 二聚体破坏并抑制 HIF-2α 转录活性。PT2385 中的吸电子甲基砜基团通过降低苯环的电子密度来增强结合亲和力。 图9. PT2385（橙色）与 HIF-2α PAS-B*/ARNT PAS-B* 二聚体（pdb: 5TBM）的复合结构。Tyr281 和 His293 突出显示（洋红色）。虚线表示氢键相互作用，红色球体表示水分子。 由于羟基对二聚体破坏、细胞效力和物理特性的重要性，作者对第二代 HIF-2α 抑制剂的设计策略是保留羟基，但显著降低其在葡萄糖醛酸化中的反应性，从而提高药代动力学性能。与未取代的类似物相比，茚满醇系列中的孪生二氟基团可使细胞效力提高 10 到 20 倍。推测顺式氟原子参与分子内 C–F···H–O 静电相互作用，从而降低配体结合所需的脱溶惩罚。然而，高电负性的氟原子通过强诱导作用，也可能增加羟基部分在葡萄糖醛酸化反应中的反应性。最终，对核心茚满醇（Indanols）的一系列取代发现了化合物2 PT2639 和化合物13 活性显著提高（表 １）。 表 1. 核心茚满醇（Indanols）取代的 SAR 为了探索氟对葡萄糖醛酸化速率的影响，在 HIM 和UGT2B17 Supersomes™ (重组代谢酶系统) 中评估了化合物 1、2、6-9 和 13 的稳定性。酶动力学参数 V max 和 K m 总结在 表 2 中。对于 PT2385，在 HIM 和重组 UGT2B17 中 Vmax 值分别为 49 和 280 (pmol/min)/mg 蛋白质， K m 值分别为 20 和 11 μM。化合物 13 具有最高的葡萄糖醛酸化率(最高 V max 值和最低 K m 值)。葡萄糖醛酸化率第三高的化合物是化合物 8。 在化合物 2 和 7 中，仅保留了高效力，和低反应性的顺式氟原子。化合物 2 和 7 产生葡萄糖醛酸代谢物的速度至少慢 20 倍。预计这两种化合物将提供更好的口服暴露量，并且对人类的影响更小。 此外，化合物 2 中的顺式苄基氟进一步增强了药效。 图 10.  葡萄糖醛酸形成底物浓度与速率图：(A) 在人肠微粒体 HIM 中孵育；(B) 在 UGT2B17 Supersomes 中孵育。 表 2. 代表性化合物的酶动力学参数 6. PT2977 的体外药效和ADMET表征 在 HIF-2α 荧光素酶测定和 VEGFA 分泌测定中，PT2977 的效力强 2 至 3 倍（ 表 3 ）。PT2977 的 log D 7.4 比 PT2385 低约 1 个对数单位。通常，用氟取代氢会略微增加亲脂性。然而，文献中已报道的例子表明氟化会降低分子亲脂性。PT2977 极性的增加可能是由于靠近醇的氟原子与两个具有顺式构型的邻位电负性氟原子产生的高分子偶极子相结合所致。 亲脂性降低意味着血浆蛋白结合率显著降低。在人血浆蛋白结合试验中，PT2977 的结合率比 PT2385 低约 30%（52% VS. 82%）。通过结合游离分数和细胞效力的改善，计算出 VEGFA 分泌试验中 PT2977 的游离分数调整 EC85 为 75 ng/mL。PT2977 在各种物种的微粒体和肝细胞中都是一种低清除率化合物，并且它在浓度高达 50 μM 时不会抑制 CYP P450 酶。 表 3. 抑制剂 PT2385 和 PT2977 的体外概况 7. PT2977 在临床前物模型的 PK 表 4 总结了静脉注射后 PT2977 的药代动力学特性。PT2977 在小鼠、狗和猴子中的血浆清除率 (Clp) 较低，在大鼠中的清除率中等。体内形成葡萄糖醛酸代谢物的可能性较低。 表 4. PT2977 在临床前物种中静脉给药后的 PK 参数 小鼠、大鼠、狗和猴子口服 PT2977 可获得良好的血浆暴露量。 图 11 比较了 PT2977 和 PT2385 的平均血浆浓度-时间曲线， 表 5 总结了母体和葡萄糖醛酸代谢物的药物暴露量 (AUC)。有趣的是，在啮齿动物中，PT2977 的口服暴露量仅略高于 PT2385，而这两种化合物在高等物种中的表现却截然不同。 PT2977 葡萄糖醛酸代谢物 (PT3317) 在狗体内的 AUC 约为母体的 30%，而 PT2639 (PT2385 葡萄糖醛酸代谢物) 的 AUC 几乎比母体高 2 倍。对于 PT2385，狗药代动力学可以更好地预测人类体内葡萄糖醛酸代谢物 PT2639 的形成。因此，PT2977 在人体内的葡萄糖醛酸化倾向会降低，药代动力学特征有显著改善。 图 11. 单次口服剂量后小鼠、大鼠、狗和猴子体内 PT2385 和 PT2977 的平均血浆浓度随时间的变化。 表 5. PT2385 与 PT2977 口服 PK 比较 8. PK/PD 关系和体内疗效 在皮下ccRCC 肿瘤的小鼠中进行了药代动力学/药效学 (PK/PD) 研究。口服 6 剂 PT2977（0.3、1 和 3 mg/kg）或 PT2385（10 mg/kg），每日两次。PT2977 有效且剂量依赖性地降低人类细胞周期蛋白 D1（受 HIF-2α 调控的靶基因）的 mRNA 水平（ 图 12A）。PT2977 在 1 mg/kg 时达到最大 PD 反应，而 PT2385 则需要更高的剂量 10 mg/kg。并且为了达到相同的 PD 效果，PT2977 的稳态谷血浆药物浓度约为 PT2385 浓度的 1/10（ 图 12B）。化合物 PT2977 在体内的效力比 PT2385 高约 10 倍。以 0.3、1 和 3 mg/kg 的剂量 PT2977 均导致肿瘤快速消退（ 图 12C），证实化合物 PT2977 的体内活性优于 PT2385。因此，PT2977 被选为第二代 HIF-2α 临床候选药物。 图 12. (A) PT2977 和 PT2385 在体内的 PK/PD 评估。 9. PT2977 的 1 期临床数据 在 1 期剂量递增试验中，晚期实体瘤患者接受 PT2977 治疗，剂量范围为 20 至 240 mg，每天一次，共 15 天（图 13）。PT2977 的暴露量随剂量增加而增加，直至剂量达到 120 mg（表 6）。高于 120 mg 的剂量并未显著增加暴露量。20 mg 剂量时达到目标稳态谷浓度 75 ng/mL，40 mg 及以上剂量时超过该浓度。 图 13. 实体肿瘤患者的平均血浆浓度-时间响应变化。虚线表示 786-O 细胞 VEGFA 分泌试验中 PT2977 的游离部分调整 EC85 为 75 ng/mL。 表 6. 每日口服一次 PT2977 的 PK 参数 如图 14A 所示，PT2977 治疗导致 EPO 表达快速且剂量依赖性降低。PT2977 120 mg qd 的 EPO 减少与 PT2385 高暴露患者的减少水平相当（ 图 14 B）。PT2977 耐受性良好，贫血是与药理作用一致的最常见不良事件。第 1 期剂量递增研究中未达到最大耐受剂量 (MTD)。根据 PK、PD 和安全性数据，RP2D 确定为 120 mg qd。 图 14. (A) 通过 HIF-2α 靶标促红细胞生成素 (EPO) 的降低来评估药效学反应。 (B) 高暴露 PT2385 患者的 EPO 降低。 图 15A 显示 PT2977 和葡萄糖醛酸代谢物 (PT3317) 的平均稳态血浆浓度随时间的变化。第 15 天，120 mg qd 剂量的 PT2977 的谷浓度 (24 小时) 为 500 ng/mL（代谢物/母体比为 0.32）。对于 PT2385，需要 13 倍的总日剂量才能在 12 小时时达到 860 ng/mL 的谷浓度（代谢物/母体比为6.0) 远高于 PT2977 ( 图 15B)。除了效力和游离分数更高之外，PT2977 暴露更一致，没有暴露不足的患者( 图 16)。 图 15.  PT2977（PT2385）和葡萄糖醛酸代谢物 PT3317（PT2639） 的平均血浆浓度随时间的变化。 图 16. 每天120 mg PT2977 或每天800 mg PT2385 的患者的 AUC。 10. 讨论 本文研究了首创 HIF-2α 抑制剂 PT2385 在患者中的个体间 PK 变异性和低暴露量的潜在原因。根据循环代谢物鉴定和 UGT 表型分析，确定降低葡萄糖醛酸化速率将改善暴露量并降低患者中的变异性。 通过将 PT2385 中的一氟原子取代，可增强药效、显著降低亲脂性并大幅降低葡萄糖醛酸化。HIM 和 UGT 超体中的酶动力学研究揭示了氟取代和立体化学对葡萄糖醛酸化速率的影响。近年来，氟在现代药物化学和药物开发中的应用迅速扩展。 如2018 年 FDA 批准的 40% 以上的新化学实体 (NCE) 含有一个或多个氟原子。 该案例研究，强调了氟替代模式对内在效力、代谢物稳定性和药代动力学特性的重大影响。 参考:10.1021/acs.jmedchem.9b0071９ 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

OTC2024类器官前沿应用与3D细胞培养论坛圆满落幕，点击图片可查看会后报告，OTC2025论坛展位咨询请联系：王晨 180 1628 8769。 文章来源：绿钥学术 浙江大学医学院附属邵逸夫医院王一帆教授与浙江大学机械工程学院尹俊研究员作为通讯在《Materials Today Bio》期刊上发表文章"3D bioprinting lobule-like hepatorganoids with induced vascularization for orthotopic implantation"。该研究开发了一种3D生物打印方法，通过明胶甲基丙烯酰（GelMA）水凝胶制造类似肝小叶的肝类器官（hepatorganoids），并通过负载长效释放系统的血管内皮生长因子（VEGF）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）构建了血管化肝小叶类器官（VLH）。该肝类器官在体外展现出优异的功能，并在原位移植中促进血管生成和维持活性，表现出更长的存活时间及更丰富的血管化。研究结果为肝类器官的原位移植、血管化以及相关治疗提供了新的思路。 WHAT-什么是肝类器官模型？ 肝类器官（Hepatic Organoids）是一种体外培养的三维细胞结构，旨在模拟天然肝脏的组织结构和功能。它们通常由肝脏细胞（如肝细胞、胆管细胞等）和/或支持细胞（如内皮细胞、成纤维细胞等）组成，通过特定的培养条件和生物工程技术构建而成。肝类器官在基础研究、药物筛选、疾病建模和再生医学等领域具有广泛的应用前景。 WHY——为什么要进行血管化类器官？ 血管化3D生物打印类器官是一种结合了血管生成和3D生物打印技术的先进组织工程方法，旨在制造具有功能性血管网络的三维类器官。这种技术的目标是模拟天然组织的复杂结构和功能，特别是解决传统3D生物打印类器官中常见的缺氧和营养供应不足的问题。血管化（Vascularization）是指在组织或器官中形成新的血管网络的过程。血管化对于以下方面至关重要：营养和氧气供应：为细胞提供必要的营养和氧气，维持细胞的活性和功能。代谢废物排出：帮助清除细胞代谢产生的废物。组织修复和再生：促进组织的修复和再生，特别是在受损或移植的组织中。 HOW——使用GelMA水凝胶作为基础材料，通过NHS修饰的PEG交联剂实现了VEGF的控释。 图1 3D生物打印血管化小叶样肝器官原位植入方案图 首先，作者通过将VEGF负载在NHS修饰的双功能PEG交联剂中，构建了具有控释功能的GelMA水凝胶，促进人脐静脉内皮细胞自发形成毛细血管网络。利用3D生物打印技术，开发了能够诱导血管化的肝类器官，并在原位移植后促进血管生成、维持活性和功能。RNA测序分析显示，GAS6/AXL和LAMB3/ITGA3信号通路在血管化肝小叶类器官中显著上调，有助于血管生成和细胞增殖，支持器官功能生长。 图2 GelMA/NHS/VEGF水凝胶的表征 为了评估了用于3D生物打印肝类器官的GelMA水凝胶，作者团队重点考察了其生物相容性、降解性和应力模量。在细胞活性实验中，HUVEC和Huh7细胞在2D和3D培养中表现出相似的细胞存活率，然而，HUVEC细胞在3D培养中显示出显著增强的增殖能力，而Huh7细胞在两种培养条件下的增殖无显著差异。为了确定适合的生物墨水浓度，研究了不同浓度GelMA的压缩和应力模量。结果表明，4%的GelMA浓度最适合用于3D打印，能够模拟肝脏基质的刚度，支持细胞的生存和功能。此外，为了促进肝类器官的血管化，研究合成了具有控释VEGF的GelMA/NHS/VEGF水凝胶，并进行了材料特性评估。体内降解实验表明GelMA和GelMA/NHS/VEGF的降解率相似，但体外释放研究表明GelMA/NHS/VEGF的VEGF释放速率显著低于对照组。这表明NHS通过化学相互作用增强了VEGF的锚定，调节了其释放速率，从而为肝类器官的生长和功能提供了更为持久的支持。 图3 3D生物打印小叶样肝类器官的表征 接下来，作者团队设计并制造了类似肝小叶的肝类器官，受天然肝小叶结构的启发，旨在克服扩散限制并维持细胞活性。实验结果表明，这种设计能有效支持细胞的功能，活/死实验显示所有部分均有较高的细胞活性。缺氧实验进一步表明，与其他结构相比，肝类器官中的肝细胞氧气摄取能力更强。扫描电子显微镜（SEM）图像揭示了GelMA水凝胶的多孔结构，有利于细胞的增殖、迁移及营养、氧气的扩散，体现了其良好的生物相容性。免疫荧光结果确认，肝类器官中表达了ALB和MRP2等关键肝脏标志物。ALB分泌实验显示，类似肝小叶结构的肝类器官表现出显著更高的ALB分泌能力。尿素氮实验则显示其尿素产生显著增加。通过原位移植实验，我们发现类似肝小叶的肝类器官在宿主中保持了最高的活性，并在组织中表现出良好的血管生成，为器官提供了充足的氧气和血液供应。这些结果证明了该结构在肝类器官构建中的潜力。 图4 HUVECs和GelMA/NHS/VEGF诱导血管形成 随后，作者团队探讨了HUVECs对肝细胞生长的影响。实验表明，HUVECs的条件培养基促进了Huh7肝细胞的增殖，并且HUVECs与Huh7的共培养显著增强了Huh7的生长，表现为细胞增殖速率和白蛋白、尿素的分泌水平显著提高。此外，本文设计了一种包含HUVECs、GelMA和Matrigel的生物墨水，并通过3D打印将其注入肝小叶中心，成功构建了类似肝小叶的肝类器官。该生物墨水结合了GelMA的结构优势和Matrigel的生物活性，为血管生成提供了支持。观察结果表明，HUVECs在类肝小叶结构中形成了自组装的血管网络，最终实现了血管化。免疫荧光分析进一步证实了血管标志物CD31在肝类器官表面和间隙中的表达，支持了血管生成的发生。 图5 血管化小叶样肝类器官的转录组学分析 为了探索血管化类似肝小叶的肝类器官（VLH）的潜在机制，作者团队研究建立了多个实验组并进行了RNA测序及生物信息学分析。分析结果表明，VLH和HUVECs-肝类器官（HH）组显示出显著不同的基因表达模式，而VEGF/肝类器官（VH）和3D对照（3DC）组则呈现不同的表达特征。VLH组的KEGG通路分析揭示了多个上调的通路，如粘着斑、ECM-受体相互作用、肌动蛋白细胞骨架调节等。通过维恩图分析，发现6个通路仅在VLH组中上调。基因集富集分析（GSEA）进一步表明，VLH组的特异性上调与细胞黏附、增殖、细胞相互作用及代谢过程相关，而VH和HH组则分别富集了糖酵解、缺氧、血管生成等不同的生物学过程。 图6 血管化小叶样肝类器官中激活的GAS6/AXL和LAMB3/ITGA3信号通路 作者研究发现，在VLH中，GAS6/AXL信号通路和层粘连蛋白/整合素复合物的上调与肝细胞增殖和ECM受体相互作用密切相关。通过细胞再生的基因本体（GO）分析和ECM受体相互作用的KEGG通路分析，揭示了GAS6/AXL信号通路在肝脏再生中的重要作用。火山图结果显示，VLH中GAS6/AXL和LAMB3/ITGA3的表达显著升高，RNA测序数据进一步证实了这一点。RT-qPCR结果也显示VLH中GAS6/AXL和LAMB3/ITGA3的表达水平较对照组显著增加。免疫荧光染色进一步验证了VLH中这两种蛋白的上调。这些结果表明，GAS6/AXL和LAMB3/ITGA3的上调可能在VLH中通过促进细胞增殖和ECM相互作用，支持肝脏的再生和功能恢复。 图7 血管化小叶样肝类器官原位植入术后的长期生存能力维持 最后，作者评估了在VLH、HH、VH和3DC肝类器官原位移植能力。活体成像评估显示VLH组表现出最强的活性，并且荧光素信号在观察期间持续增长。VLH组的血清AFP水平显著高于其他组，表明其肝脏功能活跃。移植组织分析显示VLH组的移植组织显著大于其他组，且移植组织与肝脏的比率最高，显示出更好的生长潜力。组织学分析显示VLH和HH组的移植组织血管生成较为丰富，而VH和3DC组相对较少。此外，免疫组化分析结果表明，移植组织内的血管内皮细胞为小鼠来源，提示血管的形成主要由宿主诱导，而非移植的HUVECs。 总结：本研究提供一种创新且高效的3D生物打印类似肝小叶的肝类器官，用于原位移植并诱导血管化。它旨在揭示促进血管化和维持功能活性的机制，最终为治疗各种急性和慢性肝损伤以及临床实践中重大肝切除术后残留肝脏功能不足提供一种有希望且有效的策略。 文章来源：https://doi.org/10.1016/j.mtbio.2025.101515 END 免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。 OTC2024类器官前沿应用与3D细胞培养论坛圆满落幕，点击图片可查看会后报告，咨询OTC2025类器官论坛请联系：王晨 180 1628 8769 戳“阅读原文”立即注册OTC2025，抢免费参会名额!