PDE2A

这篇文章深入探讨了自由能微扰法（FEP）在药物发现中的应用与进展。作者详细回顾了FEP技术的发展历史、其在药物设计中取得的成功案例，以及该技术如何通过计算模拟药物分子与蛋白靶标的结合自由能，助力药物研发过程。文章还探讨了FEP面临的挑战，如力场模型的精确性和计算资源的需求，展望了深度学习与FEP技术结合的未来发展方向，尤其是在提高预测效率和化学变换模拟方面的潜力。  01   引言 自由能计算，尤其是涉及化学变换的计算，已经成为药物发现过程中不可或缺的工具。这些计算方法通过量化配体与蛋白质靶标之间的结合亲和力，为筛选和优化药物分子提供了高效的策略。在此过程中，结合自由能（binding free energy）是衡量潜在药物分子与其生物靶标相互作用的关键指标。 在众多的计算方法中，自由能微扰法（FEP）以其理论上的严谨性和日益增长的实用性脱颖而出。尽管该方法曾因高计算成本和对准确力场模型的依赖而受到限制，但近年来，软件、硬件和算法的进步大大提升了FEP的实用性。由钱润通等人主导的这篇综述文章集中探讨了FEP在药物发现中的最新应用，特别是配体和残基相关的转化，以及深度学习技术在自由能计算中的整合。  02   FEP在药物发现中的演变 FEP的应用最早可以追溯到20世纪80年代，当时的研究展示了其在计算配体结合与解离自由能差异方面的潜力。然而，由于当时的计算资源有限以及力场模型的准确性不足，FEP在制药工业中的应用受到了限制，直到2000年代，技术的进步为FEP的广泛使用铺平了道路。 图1: 历年 MD 和 FEP 在药物研发中的应用增长（1980-2022 年） 综述文章中指出了FEP发展的三个关键阶段： 1986-2003年：这是FEP应用的初期，标志性事件是少数几项回顾性和前瞻性研究的成功。 2003-2010年：该阶段FEP技术迅速增长，得益于分子动力学引擎和复合交换方法的创新。 2010年至今：FEP进入现代阶段，随着如Schrödinger公司的FEP+等软件工具的推出，该方法能够接近化学精度（误差在1 kcal/mol之内）。 特别是FEP+，该工具集成了增强采样技术和分子动力学模拟，已成为基于结构的药物设计（SBDD）的核心平台之一。该平台通过GPU计算引擎和直观的用户界面，为药物发现中的实际应用提供了巨大的支持。  03   FEP的关键组成部分 FEP计算依赖于三个主要因素：力场的准确性、采样效率和化学变换协议。每一个因素对于获得可靠的自由能估计至关重要。 力场模型：力场模型是描述分子系统中原子之间相互作用的数学模型。其准确性至关重要，因为力场中的错误会导致结合亲和力预测出现显著偏差。文章讨论了几种常见的力场模型，如AMBER、OPLS和CHARMM，并详细阐述了它们对FEP结果的影响。面临的挑战在于在准确性和计算效率之间进行权衡，较复杂的模型（如极化力场）尽管准确性高，但计算成本也较高。 采样效率：为了确保FEP计算的准确性，分子构象空间的高效采样至关重要。常用的采样技术包括复合交换、λ动力学以及软核势能。这些方法允许研究人员更深入地探索分子的不同状态（例如配体结合与未结合状态），从而减少FEP的计算负担。 化学变换协议：化学变换是通过一系列非物理的中间状态，完成从一种化学状态向另一种状态的过渡。这些变换用于计算相对结合自由能（RBFEs）和绝对结合自由能（ABFEs），这对于优化药物候选物至关重要。文章还介绍了先进的协议，例如热力学积分法（TI）和Bennett接受比法（BAR）。 图2: FEP 研究中典型的热力学循环  04   FEP的实际应用 FEP在药物发现中的应用主要体现在配体相关和残基相关的化学变换。这些方法在药物研发的多个阶段广泛应用，从初期命中物的识别到候选药物的优化。 图3:  FF 参数设立及评估示意图 配体相关的FEP：多数FEP应用集中于优化配体的化学结构以提高其与靶标蛋白的结合亲和力。文章列举了几个成功的案例，如TYK2抑制剂和PDE2A抑制剂的开发，其中FEP计算在优化活性和选择性方面起到了关键作用。例如，TYK2抑制剂TAK279的发现就是通过FEP指导的支架跃迁（scaffold hopping）策略实现的，该药物已进入临床III期试验。 残基相关的FEP：除了配体的优化，FEP也被用于研究蛋白质残基突变对结合的影响。这对于理解药物耐药性机制和蛋白质蛋白质相互作用尤为重要。文章特别提到了FEP在预测EGFR和BTK突变影响方面的应用，这两个靶点与癌症和自身免疫疾病密切相关。通过这些模拟，研究人员能够揭示特定突变如何影响药物结合，并为下一代抑制剂的设计提供参考。  05   面临的挑战与未来发展方向 尽管FEP在药物研发中的应用已经非常广泛，但它依然面临着一些挑战。主要的限制之一是其对力场不准确性的敏感性，特别是在建模复杂体系时（如含有溶剂环境的蛋白质配体复合物）。此外，采样收敛性也是一个瓶颈，尤其是在配体或蛋白质残基发生显著构象变化的情况下。 未来，机器学习（ML）和深度学习技术的引入为解决这些挑战带来了新的希望。机器学习算法可以帮助预测配体的结合模式及力场参数，从而提高FEP的准确性和效率。此外，随着实验结合数据的逐渐增多，FEP预测结果的基准化也将得到进一步加强。 另一种值得期待的方向是FEP与量子力学（QM）方法的结合，特别是QM/MM（量子力学/分子力学）混合模型。此类混合方法可以为化学变换，尤其是共价抑制剂和其他化学反应活性药物提供更为精确的描述。  06   结论 近年来，FEP技术已经发展成为一种成熟且可靠的工具，用于药物研发中结合自由能的预测。该技术在多个治疗领域取得了成功应用，帮助加速了药物开发过程，同时降低了研发成本和风险。随着增强采样技术、改进力场模型以及深度学习技术的进一步整合，FEP的应用前景愈加广阔。 随着计算能力的不断提升以及机器学习方法逐渐融入药物发现流程，FEP有望在未来的制药行业中占据更加核心的位置。研究人员和制药公司将继续受益于这一工具，它能够通过数据驱动的预测提供准确的分子相互作用信息，最终为更有效和更具针对性的治疗手段铺平道路。Reference： Qian R, Xue J, Xu Y, Huang J. Alchemical Transformations and Beyond: Recent Advances and Real-World Applications of Free Energy Calculations in Drug Discovery. J Chem Inf Model. 2024 Oct 3. doi: 10.1021/acs.jcim.4c01024. Epub ahead of print. PMID: 39360948. 版权信息 本文系AIDD Pro接受的外部投稿，文中所述观点仅代表作者本人观点，不代表AIDD Pro平台，如您发现发布内容有任何版权侵扰或者其他信息错误解读，请及时联系AIDD Pro (请添加微信号sixiali_fox59)进行删改处理。 本文为原创内容，未经授权禁止转载，授权后转载亦需注明出处。有问题可发邮件至sixiali@stonewise.cn 关注我，更多资讯早知道↓↓↓

关注并星标CPHI制药在线 阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种神经系统退化性疾病，多发于65岁以上老年人群。目前，AD发病机制尚未完全明晰，其机理复杂，发生发展涉及多种机制，基于AD的病理特征，主要包括Aβ学说、tau蛋白学说、胆碱能损伤学说、免疫炎症学说和肠道微生物群等。天然产物中蕴涵多样化的活性成分，具有多组分、多靶点作用的特色和优势，符合AD多因素、多种病理机制的神经系统性病变发病特点。随着现代化分离鉴定技术的不断优化，从天然产物中筛选发现高效、高选择性、低毒性的靶向抗AD活性成分成为抗AD药物研发的重要途径之一。 01 多糖类 多糖是能够维持生命活动的链状聚合物，通过醛糖或酮糖脱水形成的糖苷键线性或分枝连接而成，普遍存在于植物、动物和微生物组织中。具有药效作用的活性多糖主要存在于菌类、藻类、根茎类药材中。其中有抗AD药理作用的多糖主要包括五味子多糖、当归多糖、灵芝多糖、茯苓多糖、绞股蓝多糖、枸杞多糖、桦褐孔菌多糖、平菇菌多糖、灰树花多糖、黄精多糖、阿里红多糖、红豆杉多糖、姬松茸多糖、肉苁蓉多糖、山茱萸多糖等。当归多糖和地黄多糖均可通过调节胆碱能系统功能、抗氧化应激及炎症反应改善记忆障碍。枸杞多糖能够减少淀粉样病理，促进AD小鼠海马神经发生，提高受损的长时程增强（LTP）。蒸制黄精多糖可通过Nrf2/血红素氧合酶-1（HO-1）信号通路减轻氧化应激、神经炎症和突触损伤来减轻AD。肉苁蓉多糖能够恢复肠道菌群稳态，缓解氨基酸失衡、外周炎症和氧化应激，从而改善D-gal诱导的衰老模型小鼠的认知能力。 02 皂苷类 皂苷类皂苷是由皂苷配基与糖、糖醛酸等缩合而成的苷类化合物，结构上分为甾体皂苷和三萜皂苷。目前皂苷类成分治疗 AD 的报道中，研究较多的是三七及人参皂苷。现代药理研究表明皂苷类化合物主要通过减轻Aβ聚集、抗氧化应激损伤、抗神经元损伤、降低Tau蛋白磷酸化水平、调控 ACh代谢等作用，改善 AD引起的脑损伤。细叶远志皂苷源自远志的根部，通过维持钙蛋白酶系统稳定，抑制氧化应激、铁死亡和神经元凋亡等多种途径改善突触损伤和记忆障碍。人参皂苷CK是二醇型人参皂苷在体内的代谢产物；研究发现，人参皂苷CK通过调控APP及相关剪切和降解酶，调节Aβ单体生成和清除之间的平衡，与Aβ 单体结合抑制Aβ聚集体的形成，并能激活Nrf2通路，抑制Aβ诱导的神经元氧化损伤，减少神经元凋亡，改善神经元突触功能障碍。人参皂苷Rk3是热处理人参中一种重要而罕见的皂苷，通过激活单磷酸腺苷活化蛋白激（AMPK）/Nrf2通路产生抗氧化和神经保护作用，有效地减轻小鼠的认知障碍和病理，且治疗效果优于阳性药多奈哌齐。 03 酚类 紫檀芪是白藜芦醇的甲基化衍生物，研究发现紫檀芪可以显著减少AD小鼠脑内Aβ聚集，抑制神经炎症，体外研究进一步证实紫檀芪可阻断Toll样受体4（TLR4）和髓样分化蛋白 2（MD2）的相互作用，抑制 TLR4介导的炎症反应，并通过自噬依赖机制调控细胞对Aβ1-42寡聚体（oAβ1-42）的内吞作用。此外，紫檀芪还通过激活SIRT1/核因子E2相关因子2（Nrf2）通路发挥抗氧化作用，抑制线粒体依赖的细胞凋亡，改善神经元的可塑性。天麻素是从天麻的干燥根块中提取的有机化合物，可通过部分靶向“微生物-肠-脑”轴和减轻神经炎症，维持肠道屏障和BBB完整性来改善AD小鼠模型的记忆。红景天苷是红景天的主要活性成分，可直接与Nrf2结合并抑制Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap1）-Nrf2复合物的形成，进而促进Nrf2介导的SIRT3转录发挥保护神经突起和线粒体的作用；还可靶向 NOD 样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体抑制细胞焦亡，防止神经元损伤。此外，红景天苷可激活 Nrf2/谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）轴和铁转运，抑制神经元铁死亡，并能减少 CD8+T细胞浸润、MG 活化和炎症反应，改善AD小鼠认知障碍、Aβ积累和神经元丢失。 04 黄酮类 黄酮类化合物是经苯丙氨酸途径合成的一类化合物，普遍存在于中草药中。其在植物体内多与糖类结合成苷，或以游离的形式存在。天然黄酮类化合物可分为黄酮类、黄酮醇类、双氢黄酮类、双氢黄酮醇类、查耳酮类、异黄酮类等。现代药理研究表明黄酮类化合物可以从多靶点改善AD模型动物的认知功能障碍、减轻AD症状、抑制AD进程。 研究发现，川陈皮素、木犀草素能降低活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）水平，提高谷胱甘肽（GSH）及线粒体膜电位，减轻AD 模型氧化应激和线粒体功能障碍。川陈皮素还可通过调节磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（Akt）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）及NF-κB通路抑制神经炎症，通过激活沉默信息调节因子（SIRT）1/叉头框转录因子 O3a（Fox O3a）通路增强自噬，同时减轻胆碱能神经变性和病理蛋白沉积，发挥其抗 AD 作用。木犀草素可通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）依赖的途径调节β淀粉样前体蛋白水解酶1（BACE1）活性，并上调 IDE水平，从而抑制 Aβ 诱导的氧化应激、线粒体损伤和神经元凋亡。研究发现芦丁能够通过抑制p-Tau的产生和聚集治疗AD。柚皮素、金雀异黄酮均可通过激活自噬促进AD相关病理蛋白的降解清除。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，不仅能够调节脑内胰岛素信号、葡萄糖转运蛋白（GLUTs）表达及APP加工途径，抑制Aβ积累和Tau 磷酸化；还可以调节BDNF/酪氨酸蛋白激酶受体B（Trk B）信号通路修复神经元损伤，增强突触可塑性，改善学习记忆障碍。此外，淫羊藿苷和金雀异黄酮还可通过抑制ERS介导的凋亡途径发挥神经保护作用。黄芩素主要来源于黄芩干燥根，黄芩素不 仅抑制CX3C趋化因子受体1（CX3CR1）/NF-κB 通路调控MG表型转化，减轻神经炎症；还可通过调节磷酸二酯酶（PDE）2A/PDE4亚型依赖的神经保护途径，上调突触相关蛋白表达，改善小鼠记忆障碍和神经元萎缩。槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷能调节肠道菌群及其代谢产物，改善脑内炎症和胰岛素抵抗，减轻Aβ 聚集和Tau磷酸化。 参考资料       [1]黄丹蓉,程亚敏,冯紫涵,等.基于靶点机制的抗阿尔茨海默病天然活性成分研究进展[J].天然产物研究与开发,2023,35(10):1808-1819.        [2]曹珊,陈智慧,秦静琪,等.中药及其有效成分治疗阿尔茨海默病研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2024,30(10):258-268.        [3]杜正彩,胡润华,李瑞林,等.治疗阿尔茨海默病中药化学成分及机制的研究概况[J].中国实验方剂学杂志,2024,30(05):236-245. 作者简介：小米虫，药品质量研究工作者，长期致力于药品质量研究及药品分析方法验证工作，现就职于国内某大型药物研发公司，从事药品检验分析及分析方法验证。 来源：CPHI制药在线 声明：本文仅代表作者观点，并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。 投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com ▼更多制药资讯，请关注CPHI制药在线▼ 点击阅读原文，进入智药研习社~

——背景——深入了解蛋白-配体间的相互作用有助于我们更好地进行蛋白结构分析及药物设计。今天我们分享一篇2017年发表在Med. Chem. Commun. 的研究文章，文章作者对PDB数据库中蛋白-配体复合物结构进行了筛选，收集到了11016套质量够高（分辨率≤2.5埃）的蛋白-配体复合物数据用于后续分析。作者对数据集中所有距离≤4埃的原子间非共价接触进行了统计，得到750873对相互作用并将其分为了7类。在做整体分析之后，作者依次对每类相互作用的组成、几何形状、出现的频率、蛋白质侧链偏好进行了分析，并以特定案例为例说明了该类相互作用对配体结合亲和力和药物活性的影响。希望本文能对大家理解蛋白-配体间相互作用有所帮助。——分析结果——蛋白质-配体原子相互作用的主要类型作者提取了PDB中所有分辨率高于2.5埃的蛋白-小分子复合物的晶体结构，得到11016个复合物结构。排除了含有蛋白缓冲液和结晶条件相关的小分子的结构后，作者最终得到了750873个距离小于等于4埃的配体-蛋白相互作用原子对。前100种最常见的配体-蛋白原子对（表S2，见文末）可以聚类为7种相互作用类型。其中，出现频率最高的相互作用类型依次是疏水相互作用、氢键和π堆积。接下来是弱氢键、盐桥、酰胺堆积和阳离子-π相互作用。图1. PDB中提取的蛋白配体间非共价相互作用的频率分布作者收集得到的数据集中有超过五百个蛋白家族成员。前十的家族如图2a所示，其中激酶、胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶数量上位居前三。前十中除核激素受体和溴结构域家族外，其余都是酶。 作者选择了三个不相关的蛋白家族来评估同种相互作用在不同家族中出现频率的差异（图2b）。首先，作者发现离子相互作用（即盐桥）和阳离子-π相互作用在三个家族中频率都很低，π堆积在三个家族中频率接近。然后，作者发现氢键在激酶和胰蛋白酶样蛋白中的频率比核激素受体高一倍甚至更多。而最令作者惊讶的是，胰蛋白酶样蛋白中氢键和酰胺堆积的相对比例（42%和32%）远高于激酶（16%和6%）和核激素受体（10%和4%）。作者猜测这可能是由于激酶和核激素受体中的结合口袋比胰蛋白酶样蛋白更疏水，蛋白质酰胺基团的极性π面暴露较少导致的。图2. 数据集中十个最常见的蛋白质家族的分布接着作者比较了“高效”配体和“低效”配体中最常见的相互作用类型是否有差异，实验的亲和力数据来源于PDBbind数据库。作者选用FQ评分作为评估配体亲和力的指标，FQ评分反映了配体中平均每个原子对结合的贡献，即FQ越大，分子越精干有效，FQ越小，分子越臃肿低效。结果如图3a所示，疏水相互作用仍然是最常见的互作类型，而其他相互作用类型的比例均有所降低，其中，氢键从59%降到了34%，离子相互作用从13%降到了7%。这一现象可能反映出PDB中的大多数配体都是由先导化合物优化得到，其目的是增加有利疏水相互作用的数量，这比优化方向性受限的氢键更容易。作者也发现相比低FQ评分的配体，高FQ的配体更加疏水。而两类配体的其他性质如极性表面积、氢键受体和氢键供体等均接近。结合以上结果，可以看出，高效结合靶标的小分子配体更疏水，疏水相互作用是提高配体效率的驱动因素。图3. 不同配体结构中最常见的非共价相互作用的相对频率分布作者还探究了疏水相互作用在比类药分子分子量更小的片段（fragment）和蛋白的相互作用中是否仍然出现频率很高。于是作者计算了随机选择的1500个蛋白-配体复合物和蛋白-片段复合物中的互作类型。然后作者发现蛋白-片段复合物具有丰富的极性相互作用: 与疏水接触相比，氢键的频率增加了一倍，从31%增加到62%；静电相互作用的频率增加了三倍，从5%增加到17%（图3b）。作者认为出现这种差异是因为小分子量的片段为了弥补它们原子数量少的缺点，片段之间的相互作用需要非常高效，而静电相互作用决定了配体结合的最大效率。在最初的筛选中，片段（Fragment）的浓度都比较高，这就要求片段本身有高水溶性，反映到结构上带有极性基团。所以与类药物化合物相比，片段中极性相互作用的发生率更高。这也说明，片段（Fragment）比先导化合物及其优化产物（Lead compound）更容易采取结合姿态，从而最优地满足如静电或氢键等高效相互作用的几何约束。总之，这些结果表明，片段利用极性相互作用从有限的相互作用中获得最大的结合效率，但随着小分子配体的优化，几何约束与极性键越来越难满足，疏水相互作用的贡献增加。 为了进一步深入了解，接下来将详细分析PDB中每种蛋白质-配体相互作用类型的组成、几何形状、出现的频率、蛋白质侧链偏好以及对配体结合亲和力和药物活性的影响。疏水相互作用从前面的分析可知，疏水相互作用是蛋白-配体复合物中最常见的相互作用，作者共找到66772对碳原子与碳原子、卤素原子或硫原子之间小于等于4埃的接触（图1）。这些疏水接触可以分为五组。其中数量最多的一组是受体的脂肪碳原子和配体的芳香碳原子之间的接触，共有42443对。这表明在小分子抑制剂中普遍存在芳香环。事实上，76%的上市药物都含有一个或多个芳香环，其中苯环是目前最常见的环系。而疏水氨基酸——首先是亮氨酸，其次是缬氨酸，异亮氨酸和丙氨酸，它们的侧链毫无意外地最多地参与了疏水相互作用。配体的脂肪碳原子和受体的芳香或脂肪碳原子之间的互作原子对分别有8899和8974对。作者观察到这其中脂肪碳原子大多分布在芳环平面的上方或下方，而不是在环的边缘。蛋白中的芳香或脂肪碳原子与配体中的氯原子或氟原子间的接触是第二多的疏水接触（5147对）。第三是甲硫氨酸侧链硫原子和配体芳香碳原子间的接触（1309对）。尽管甲硫氨酸被归类为疏水氨基酸，但有研究表明，与纯疏水相互作用相比，Met-S⋯C(aro)间的相互作用能够产生1-1.5 kcal/mol-1的额外稳定能量。 疏水相互作用是药物受体相互作用的主要驱动力。配体上每个溶剂暴露的甲基在埋入蛋白疏水口袋后，可多贡献约0.7 kcal/mol-1的结合能/使结合能力提高3.2倍。然而，用甲基取代氢原子的效果是高度依赖于环境的，效力的损失和增益一样常见。有8%和0.5%的案例中观察到了10倍和100倍的效力提高。例如，添加一个甲基可以使tankyase-2（TNKS2）抑制剂的效力提高50倍（图4）。添加的甲基占据一个小的疏水口袋，可能释放不利结合的水分子。在极少数情况下，引入甲基增加的效力能够超过两个数量级。这通常是因为配体的结合对受体构象熵的惩罚效应的减弱和甲基包埋到疏水口袋的去溶剂化效应的叠加实现的。图4. TNKS2抑制剂加入甲基的神奇效果。(a) 两种TNKS2抑制剂的化学结构 (b) 结合抑制剂1 (青色) 的TNKS2的晶体结构（pdb: 5C5P）氢键氢键是蛋白-配体复合物中第二常见的相互作用，作者共观察到28577对氢键互作原子对（图1）。其中N-H⋯O的互作最常见（15105对），接下来是O-H⋯O（8251对）和N-H⋯N（333对）。在N-H⋯O相互作用中，中性氢键和带电氢键的数量几乎相等（分别为7554和7551对）。蛋白更多情况是氢键供体而不是受体（分别为9217和5888对）。令人惊讶的是，甘氨酸是最常见的氢键受体，同时也是第二常见的供体，这可能是由于甘氨酸没有侧链掩盖主链原子，主链的灵活性能够更好地满足氢键的空间约束。精氨酸比赖氨酸参与更多的氢键，可能是由于精氨酸侧链的胍基上存在3个氮原子。在O-H⋯O互作中，带电氢键（通常在醇和羧酸之间）的频率是中性氢键的3倍，并且配体通常作为供体而不是受体。在带电氢键中，最常见的受体是天冬氨酸；在中性氢键中，最常见的受体是天冬酰胺、甘氨酸和谷氨酰胺。丝氨酸是最常见的供体。此外，在作者的分析中还观察到4888个由水介导的蛋白质-配体氢键。其中，在配体中涉及氧原子的水介导氢键的频率大约是涉及氮原子的两倍。 作者通过分析发现，在N-H⋯O，N-H⋯N，O-H⋯O氢键中，重原子（N或O）间的中位距离约为3.0埃（图5），这个值比先前报道的酰胺（C=O）和OH/NH 之间的氢键略高（~ 0.1-0.2 Å）。此外，中性氢键和带电氢键的中位距离几乎相同（相差0.1 Å）。D-H⋯A氢键的角度主要分布在130-180°，而N-H⋯O氢键的偏好角度集中在180°左右。图5. 弱氢键（C-H⋯O）和强氢键（N-H⋯O, N-H⋯N, O-H⋯O）的长度分布氢键是生物复合物中普遍存在的定向的分子间相互作用，也是分子识别特异性的主要贡献者。氢键的自由能在-1.5 kcal/mol-1到-4.7 kcal/mol-1。然而，如果新形成的相互作用不超过配体结合时的去溶剂化损失，则氢键对结合的贡献可能非常有限（甚至不利）。同样，氢键的贡献也取决于局部环境：暴露于溶剂的氢键对净相互作用能的贡献明显小于埋藏在疏水袋中的相同氢键。因此，通常认为优化疏水相互作用比优化氢键更容易。在药物设计中，氢键由于其严格的距离和几何约束而被用来保证配体-受体结合的特异性。 现有案例中，有一系列凝血酶抑制剂通过简单添加作为氢键供体的氨基实现了结合亲和力的显著增加（>500倍，图6a）。在晶体结构中，氨基与216位的甘氨酸的羰基氧和周围的水形成带电氢键(图6b)。图6. 在凝血酶抑制剂中加入氢键的效果。(a) 两种凝血酶抑制剂的化学结构 (b) 结合抑制剂4（青色）的凝血酶的晶体结构 (pdb: 2ZC9)。氢键用绿色虚线表示π堆积相互作用蛋白-配体复合物中第三常见的相互作用是芳香相互作用。芳香环相互作用在化学和生物系统中普遍存在，可以被认为是疏水相互作用的一种特殊情况。作者通过统计发现，边对面（edge-to-face）和面对面（face-to-face）的互作出现频率接近（分别为8704和8537对）。这与苯二聚体相互作用能的量子力学计算结果一致。计算预测边对面和有平行位移的面对面是等能的，并且比重叠的面对面π堆积更稳定。有将近一半的π堆积相互作用发生在苯丙氨酸的芳香环和配体的芳香环之间，其次是酪氨酸（36.8%），色氨酸（8.7%）和组氨酸（5.1%）。 涉及芳香环的相互作用也是蛋白质配体识别的主要贡献者，同样也被应用于药物设计中。一个通过形成π堆积相互作用极大增加结合亲和力的例子是可溶性环氧化物水解酶（sEH）抑制剂的设计。晶体结构显示，抑制剂6的苯环能够和524位的组氨酸形成π堆积相互作用，而不含这个苯环的5号抑制剂的结合能力降低了100倍（图7）。虽然π堆积相互作用可以增加抑制剂对靶标的结合亲和力，但有研究指出，减少分子芳香环的数量可能会改善其物理化学性质，如溶解度。图7. 在人源环氧化物水解酶抑制剂中加入芳香环的效果。(a) 两种人源sEH抑制剂的化学结构 (b)结合抑制剂6（青色）的sEH的晶体结构（pdb:3I1Y）。苯环用粉色/透明球面表示弱氢键蛋白-配体复合物中第四常见的相互作用是C-H⋯O 氢键。当相互作用的供体碳原子是芳香碳时，受体氧原子更多地来源于蛋白而非配体（分别为4927和708对）。这简单地反映了这样一个事实：大多数配体具有芳香环，而大多数侧链则没有。甘氨酸、天冬氨酸和谷氨酸始终是 C-H⋯O 相互作用中最常见的受体，而亮氨酸是最常见的供体。C-H⋯O氢键的中位距离为3.4 Å，比传统氢键（N-H⋯O, N-H⋯N, O-H⋯O）长0.4 Å，并且两个重原子之间的距离很少低于3.2 Å（图3）。C-H⋯O相互作用的角度集中在130°左右，这与以前的报道一致。 人们对弱氢键的存在已经进行了广泛的分析和评述。计算表明，Cα-H⋯O=C相互作用的强度约为NH⋯O=C氢键强度的一半。此外，对蛋白质配体复合物的分析表明，Cα-H⋯O氢键更应解释为次级相互作用，因为它们经常伴随着分叉的N-H⋯O氢键。现在越来越多的人认识到C-H⋯O氢键在多种生命活动如分子识别，蛋白质折叠的稳定，核酸与蛋白质的相互作用，酶催化，以及蛋白质-配体结合复合物的稳定中起着重要作用。一对配对的CDK2抑制剂说明了C-H⋯O氢键对蛋白质配体复合结合的贡献（图8）。抑制剂7和8之间的唯一区别是8的噻唑环上的甲基取代了NH2。虽然7的N-H⋯O氢键比8的C-H⋯O氢键更强，但后者更有效，可能是与7的NH2在结合时脱溶剂惩罚有关(图8b)。图8. 在CDK2抑制剂中用C-H⋯O氢键替换N-H⋯O的效果。(a) 两种CDK2抑制剂的化学结构 (b) 结合抑制剂8（青色）的人源CDK2的晶体结构（pdb:1PXP）。N-H⋯O和C-H⋯O氢键分别以绿色和品红色虚线表示盐桥带正电荷的氮和带负电荷的氧之间的接触（即盐桥）是分析中第五常见的相互作用类型（7276对）。来自蛋白的带正电的氮原子和来自配体的带负电的氧原子之间形成的盐桥的数量是氮氧原子来源相反的盐桥数量的两倍（分别为4882和2394对）。因为蛋白质中精氨酸（5.6%）和赖氨酸（5.0%）的频率与观察到的天冬氨酸（5.4%）和谷氨酸（3.8%）的频率接近，所以这可能反映了PDB中含有羧酸的配体数量（1849个）多于氨基（1103个）。在83.6%的盐桥中，精氨酸提供阳离子。这与量子力学计算相一致。量子力学预测精氨酸比赖氨酸侧链更倾向于形成盐桥。此外，在精氨酸胍基周围的带负电氧的分布表明，负电氧原子在末端（ω）氮周围的密度比在仲胺（ε）氮周围的密度高。 盐桥对蛋白质稳定性的贡献很小，因为形成盐桥所获得的有利结合能不足以抵消带电基团脱溶剂的能量损失。然而，盐桥相互作用的强度强烈依赖于环境，特别是埋藏的盐桥对配体结合起着至关重要的作用。例如，在EGFR抑制剂10的末端N，N二甲基的氮原子能够和EGFR激酶结构域831位的天冬氨酸形成盐桥（图9）。当这个末端二甲基的氮原子被碳原子取代时（即抑制剂9），抑制剂的效价降低了800倍以上。图9. 在EGFR抑制剂中添加盐桥的效果。(a) 两种人源EGFR抑制剂的化学结构 (b) 结合抑制剂10（青色）的EGFR激酶结构域的晶体结构（pdb:4JRV）氢键以绿色虚线表示酰胺⋯π堆积酰胺基团和芳环之间的相互作用是第六常见的相互作用类型。和典型芳香π堆积不同，酰胺⋯π堆积是指酰胺键的π面相对于芳环π面的堆积。和前述的π-π堆积相同，酰胺⋯π堆积中也没有发现对面对面和边对面堆积的明显偏好（分别为2907和2060对）。最常参与面对面酰胺⋯π堆积的氨基酸是甘氨酸（19.4%）和色氨酸（17.9%），而边对面堆积中最常见的氨基酸是甘氨酸（20.1%）和亮氨酸（13.0%）。事实上，88.5%的酰胺π堆叠相互作用发生在蛋白质（通常是甘氨酸）的主链酰胺和配体的芳香环之间。这指向了一种利用结合位点中的肽键的策略。这种策略在基于结构的药物设计中可能未得到充分利用。 酰胺⋯π堆积相互作用在蛋白质结构中常见又重要。这些相互作用有时也在配体结合中发挥重要作用。例如，一对含恶唑的凝血因子Xa抑制剂之间的Ki差异为11倍，这主要是因恶唑环的偶极对酰胺⋯π相互作用的影响（图10）。图10. 恶唑环的偶极对酰胺⋯π相互作用的影响。凝血因子Xa抑制剂11（a）和12（b）的化学结构以及活性位点结合抑制剂（青色）的凝血因子Xa的晶体结构 （pdb:2Y5H, 2Y5G）。恶唑环和肽酰胺的偶极（红色箭头）在11中平行，在12中反平行阳离子-π相互作用在分析中，作者还找到了2577对带正电的氮原子和芳环间的相互作用。这些阳离子-π相互作用本质上是静电相互作用，因为π系统的电子云带负电荷。在90%以上的这类相互作用中，氮原子来自受体，芳环来自配体。这再次反映了前面提到过的一个事实，类药物化合物通常具有芳香环，而氨基则相对更少见。精氨酸参与阳离子-π相互作用的频率是赖氨酸侧链的3倍。先前已在氢键及盐桥的相互作用中观察到类似的趋势。这种偏好可能是由于精氨酸的胍基可以在同时与芳香环结合的同时提供数个氢键。当带正电的氮来自配体时，来自酪氨酸侧链的芳香环最常见（156对），其次常见的是苯丙氨酸和色氨酸（分别为59和24对）。酪氨酸在其羟基氢键上的阳离子-π结合能力的增强被认为是肽相互作用中类似偏差的起源。之前的理论结果认为酪氨酸与苯丙氨酸形成阳离子-π相互作用的能力相同，但实验结果观察到蛋白质分子内阳离子-π作用中酪氨酸占比高于苯丙氨酸，酪氨酸额外的形成阳离子-π相互作用能力可能是由于其羟基形成氢键后，苯环电子云密度升高，形成阳离子-π相互作用能力更强。阳离子-π相互作用在蛋白质中广泛存在，是蛋白质结构、稳定性和功能的重要决定因素。一个特别引人注目的例子是表观遗传读取蛋白家族，其特征是由两到四个芳香残基组成的芳香笼，能够与甲基化修饰的赖氨酸或精氨酸侧链产生阳离子-π和疏水相互作用。 许多药物受体相互作用涉及阳离子-π相互作用。最早的例子之一是烟碱乙酰胆碱受体（nAChR）对乙酰胆碱（ACh）的识别。同样，γ-氨基丁酸, 甘氨酸，和5-羟色胺受体与神经递质的相互作用中也存在阳离子-π相互作用。在一系列对有效的凝血因子Xa抑制剂的富有洞察力的优化实验中，一个氨基的顺序甲基化使得抑制剂的结合亲和力增加了3个数量级。叔丁基类似物（抑制剂15）与三甲基化氨基（抑制剂17）的亲和力的差异，表明阳离子-π相互作用使效力增加了60倍（图11）。图11. 氨基的顺序甲基化对凝血因子Xa抑制剂结合亲和力的提升 (a) 一系列凝血因子Xa抑制剂的化学结构 (b) 结合抑制剂17（青色）的凝血因子Xa的晶体结构 （pdb:2JKH）。阳离子-π相互作用用绿色虚线表示卤键虽然涉及卤素原子的特定相互作用比上面讨论的其他相互作用要少得多，但作者还是将其纳入分析中，因为这些相互作用的影响在药物化学中经常被讨论。作者观察到了351对C-X⋯Y (X = Cl, Br, I; Y = O, N, S)，其中Y来自蛋白质侧链或主链。这些卤素键（XB）相互作用发生在卤素原子（XB供体）和亲核试剂（XB受体）的σ-空穴（正静电势）之间。由于较高的电负性和缺乏极化性，氟不能形成卤素键相互作用，因此在分析中只考虑较重的卤素（Cl, Br和I）。在351对相互作用中，涉及氯原子的相互作用是最多（222对），其次是溴（91对）和碘（38对）。这与其他调查结果一致，并反映了这三种卤素原子在小分子配体中的相对普遍性。C-X⋯Y角的中位数为156°，表明其接近线性排列。氧原子是最常见的XB受体（占所有相互作用的约90%），其次是硫（约9%）和氮（约1%）。总的来说, 所有卤素键中有71%（251对）与主链羰基氧原子发生相互作用，而存在相互作用的天冬酰胺、脯氨酸、精氨酸和色氨酸残基较少。卤素键是一种在小分子中已被良好表征的分子间相互作用，在晶体工程和超分子化学等领域有着广泛的应用。在小分子中引入卤素的策略在药物化学项目中大量使用，这样不仅可以增加化合物的亲和力，还可以增加化合物的膜渗透性和代谢稳定性。通常，在先导化合物中添加卤素原子被用来研究它们的空间和电子效应。直到最近人们才认识到，卤素可以形成独特的分子相互作用，有助于蛋白质识别配体。 关于卤素键对蛋白质配体复合物的影响，已多有报道。关于PDE2a的一系列[1,2,4]三唑基[1,5-a]嘧啶类选择性抑制剂提供了很好的例子。在这项工作中，研究者系统性地分析了19号抑制剂原位H被卤素原子取代的效应（图12）。在19号抑制剂的类似物中，H被F、Cl、Br和I取代。所有化合物以相似的姿势结合，结合位点残基没有明显的构象变化。化合物的活性按H≈F≪Cl