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邢峻豪 药物化学博士，副研究员。2016年毕业于中国药科大学药物科学研究院，2015年10 月至2016年11月赴美国密西根大学安娜堡分校进行访学。主要研究方向为全新小分子药物的发现及药物合成工艺研究。先后主持国家自然科学基金和江苏省自然科学基金等纵向课题多项，并作为主要成员参与重大新药创制项目1项、国家级及省级科研课题多项。近年来以第一作者或通信作者在Angew Chem Int Ed, ACS Catal, Eur J Med Chem 等学科权威期刊发表论文多篇。此外，完成盐酸替罗非班、阿格列汀、利格列汀及阿哌沙班的工艺研究，授权专利8项，成果转化1项。 凋亡信号调节激酶1抑制剂的研究进展 PPS  柏琛，王小宇，邢峻豪* （中国药科大学理学院，江苏 南京 211198） [摘要] 凋亡信号调节激酶1（ASK1）是细胞丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAP3K）家族成员之一，其调控的ASK1-c-Jun氨基末端激酶（JNK）-p38丝裂原活化蛋白激酶（p38）信号通路与多种疾病密切相关。在细胞应激的刺激下ASK1被激活，诱导其下游JNK和p38磷酸化，进而激活下游细胞因子，促进细胞增殖、分化、凋亡及炎症因子的产生，导致机体出现破坏性的炎症反应、细胞 死亡与纤维化。目前，ASK1抑制剂已在如肾脏、肝脏、中枢神经系统和关节等疾病中表现出治疗潜力。综述ASK1抑制剂的研究进展 及其在疾病治疗中的潜在应用，旨在为该类抑制剂的设计与开发提供参考。 细胞凋亡信号调节激酶1（apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1）已成为预防p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinases，p38）和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）介导的细胞死亡和疾病的重要靶点[1-4]。大量研究表明，p38和JNK是细胞应激反应的关键介质，与多种人类疾病密切相关[5-9]。然而p38及JNK等普遍表达的蛋白对细胞存活、维持稳态和调节代谢功能至关重要，因此，完全抑制p38或JNK的活性会导致严重问题[10-12]。此外，p38及JNK抑制剂均表现出严重的肝毒性等副作用，故直接靶向p38或JNK的治疗策略欠佳[13-15]。ASK1与p38和JNK类似，均在多种细胞中普遍表达，但ASK1主要在细胞应激下被激活，受氧化还原信号的严格控制[16]。因此，作为p38和JNK的上游调节因子，ASK1是较理想的可成药靶点，能够在p38和JNK介导的疾病中发挥显著的治疗作用。 1 细胞凋亡信号调节激酶1 ASK1 是人丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase kinases， MAP3K）家族成员之一，可激活人丝裂原活化蛋白激酶激酶4/7（mitogen-activated protein kinase kinase 4/7，MKK4/7）-JNK 通路和人丝裂原活化蛋白激酶激酶3/6（mitogen-activated protein kinase kinase 3/6，MKK3/6）-p38通路，然后磷酸化多种底物以促进炎症和细胞死亡（见图1）[17]。ASK1可响应各种应激源，包括活性氧（reactive oxygen species，ROS）、内质网（endoplasmic reticulum，ER）应激、热、渗透休克、受体介导的炎症信号[如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）或脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）]、钙离子超载和病原体感染等[18-19]。在正常条件下，ASK1通常被含硫醇的抗氧化蛋白结合和抑制，包括硫氧还蛋白（thioredoxin，Trx）、谷氧还蛋白（glutaredoxin，Grx）和过氧化物还原蛋白（peroxiredoxin，Prx）[20]。在细胞应激下，这些抗氧化蛋白发生氧化并与ASK1解离，导致激活环内ASK1同型二聚体，在Thr838位点发生反式自磷酸化。磷酸化的ASK1具有更高的催化活性并磷酸化MKK3、MKK4、MKK6和MKK7，进而磷酸化并激活p38和JNK，这些磷酸化的激酶通过核内转录因子诱导细胞凋亡、炎症和纤维化，从而导致组织损伤[21]。鉴于前述的广泛影响，多项研究表明，异常的ASK1信号与人类疾病密切相关[22-23]。此外，ASK1敲除小鼠在基础条件下未显示任何明显的表型[24]。该证据表明，ASK1抑制剂可能是一种可用于治疗多种疾病的安全且有效的药物，具有较大的临床应用价值。 2 细胞凋亡信号调节激酶1抑制剂与疾病 2.1 非酒精性脂肪肝病 目前已报道的ASK1抑制剂主要应用于非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）治疗。NASH是非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）最严重的类型，也是慢性肝衰竭的主要诱因[25]。2016年，吉利德科学公司公布了高选择性ASK1抑制剂化合物1的Ⅱ期临床试验结果，确定其对患有Ⅱ期或Ⅲ期肝纤维化NASH患者安全有效[26]。在该项试验中，接受化合物1治疗的受试者肝病进展显著减缓；治疗24周后，在给药剂量18 mg组中，30例NASH患者中有13例纤维化得到逆转，给药剂量6 mg组中，27例中有8例纤维化症状明显缓解。上述研究结果表明，化合物1治疗对NASH患者安全有效。随后，大规模Ⅲ期临床试验评估化合物1用于NASH诱导的代偿性肝硬化治疗，该试验原计划持续240周，但在48周后停止，中止的原因为未达到预期临床终点[27]。然而，评估化合物1、firsocostat（GS-0976，一种ACC抑制剂）、cilofexor（GS-9674，一种非甾体类FXR激动剂）单一及联合用药治疗NASH（NCT02781584）以及NASH引起的桥接性 纤维化或代偿性肝硬化（NCT03449446）等2项Ⅱ期临床试验显示，使用组合疗法进行为期12周的治疗是安全的，并能改善肝脏脂肪变性、肝脏生化指标和纤维化指标，疗效与单一疗法相似。上述研究结果表明，ASK1抑制剂仍具有治疗NASH的潜力[28-29]。 在化合物1的基础上，江苏豪森药业集团有限公司发现了一系列新型ASK1抑制剂，可用于治疗NASH[30]。其中，通过环化法获得的化合物2和消旋化合物3对ASK1表现出相同的体外生化抑制活性，其IC50均为3.9 nmol · L-1；然而它们的药代动力学参数在小鼠中显示出显著差异。化合物3是在化合物2的结构基础上将甲基引入异吲哚啉酮环中获得，但表现出更好的药代动力学性质。该结果表明，当脂溶性基团（如甲基）被引入ASK1抑制剂 的结构中时，化合物在体内的代谢一般会减慢，其生物半衰期也会相应延长。在高脂饲料和CCl4诱导的NASH小鼠的体内实验表明，化合物2具有比化合物1更好的疗效，提示通过环化策略开发新型ASK1抑制剂是可行的。 此外，江苏豪森和广东东阳光分别用适当的连 接子环化化合物1的环丙基和三氮唑基团，获得另一类新型ASK1抑制剂[31-32]。该研究首先制备了化合物4 ~ 6以分析其环大小对活性的影响，体外活性实验结果显示，这些化合物均在低纳摩尔水平下对ASK1表现出抑制活性，表明该位置环的大小对ASK1蛋白的抑制活性具有良好的耐受性。随后，该研究引入含有杂原子的官能团进入新环，结果表明，除三氮唑吡嗪骨架化合物8的抑制活性（IC50 = 47.8 nmol · L-1）大幅下降以外，氧杂环产物7和砜杂环产物9对ASK1的抑制活性基本保持不变，IC50 均低于10 nmol · L-1。然后，该研究向化合物 4 的吡咯环引入了不同性质的取代基以进行详细的构效关系研究，得到了化合物10 ~ 13，并发现除 化合物13以外，该类化合物均显示出较高的抑制活性，但这些脂溶性基团反而促进了其在体内的代谢，半衰期均比化合物4短。为了探究该类抑制剂与ASK1蛋白的作用机制，将化合物4和ASK1蛋白进行分子对接，结果显示，化合物4的羰基与 ASK1 的铰链区氨基酸残基Val757产生关键性的氢键作用，而三氮唑伸入疏水口袋和Lys709形成氢键，吡咯环在疏水口袋边缘（见图2）。该研究结果表明，虽然环的大小不会影响对ASK1的抑制活性，但当环上含有NH等极性较大的基团时，可能会影响三氮唑伸入疏水口袋而使抑制活性降低。在对高脂饲料和CCl4诱导的NASH小鼠的体内实验表明，该类化合物均可显著降低小鼠的谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平，且效果优于化合物1。综上可见，通过环化策略开发新型ASK1抑制剂具有可行性，且引入不同大小及性质的环能够在保留较高ASK1抑制活性的同时，改善药物分子的药代动力学性质。 2.2 慢性肾脏疾病 在慢性肾脏疾病（chronic kidney disease，CKD）患者中，ASK1-JNK-p38信号通路被激活，驱动肾小管上皮细胞、足细胞和系膜细胞的凋亡，引起肾脏炎症和纤维化[33]。目前已有大量研究表明，抑制ASK1活性能够通过减少细胞死亡、炎症和纤维化来维持肾功能[34]。为了开发出新型ASK1抑制剂，吉利德科学公司使用竞争性时间分辨荧光共振能量转移免疫测定法针对ASK1激酶结构域筛选了含约100 000种化合物的化合物库，筛选出的先导化合物吡啶酰胺衍生物14具有中等抑制活性（IC50 = 2.2 μmol · L-1）[35]。对化合物14与ASK1的结合模式分析表明，三氮唑N-甲基取代基周围有一个疏水口袋，可以填充更大的基团，而在吡啶环上引入亲水性芳香基团可以改善其理化性质。通过组合这些优选元素发现，化合物15具有较高的活性。随后，研究人员进一步优化了氢键受体的性质以提高选择性，在对该位置的芳基、杂芳基和杂环取代基进行广泛筛选后发现，将吡啶环替换为咪唑不仅保持了抑制活性，而且还提高了溶解度。随后，引入4-环丙基咪唑合成了化合物16，其生物活性比化合物14提高了750倍以上。分子对接结果显示，化合物16与Val757和Lys709形成关键性的氢键，三氮唑的N-环丙基填充了Ser821、Asp822、Leu810和Asn808等氨基酸残基形成的口袋，咪唑环延伸到铰链区，并与Tyr814形成氢键。体内外实验研究表明，化合物16是一种有效的选择性ASK1小分子抑制剂，在啮齿动物中口服有效且耐受性良好。另外，多个急性和慢性肾脏疾病的体内模型研究表明，ASK1是肾纤维化、细胞凋亡和炎症的关键介质；接受化合物16预防性或治疗性给药的啮齿动物，其肾小管间质纤维化和凋亡、肾小球硬化和蛋白尿等症状明显减缓，且肾功能得到改善。 基于吉利德科学公司的研究，广东东阳光公司开发了一系列酰胺类新型ASK1抑制剂（化合物17 ~ 23），用于慢性肾脏疾病的治疗[36]。值得注意的是，该研究所涉及化合物的酰胺结构位置与化合物16等其他抑制剂的结构位置不同，其中氨基和羰基的位置发生了交换，但仍保留了较高的抑制活性，化合物17的IC50为2.43 nmol · L-1，与化合物16的活性基本相同。提示，这可能是因为化合物16吡啶环上氮原子能够与酰胺键形成分子内氢键使整体构象趋近于平面，将化合物16的氨基和羰基互换位置并将苯环替换为吡啶环后，分子内的氢键得以保留因而不影响其抑制活性。化合物16和化合物17与ASK1的分子对接结果（见图3）也证明了这一点，并且其作用模式均与化合物1相似。将环丙基替换为异丙基得到的化合物18活性有显著提高，但将溶剂区吡啶氮原子更换位置后，活性会下降。另外，当溶剂区吡啶环上引入N-吗啉基、甲氧基、甲硫基等亲水性取代基时活性显著高于引入亲脂性的氟原子。体内实验结果表明，该系列化合物在口服给药后大鼠体内血药浓度及暴露量水平较高，清除率较低，口服生物利用度较好，在肝和肾中的浓度较高，具有良好的药代动力学性质；将其应用于单侧输尿管梗阻的肾纤维化大鼠模型中，可以显著降低肾纤维化水平。 2.3 神经退行性疾病 阿尔茨海默病（Alzheimer , s disease，AD）和帕金森综合征（Parkinson , s disease，PD）等神经退行性疾病发病率逐年提升，严重威胁人类健康。目前的研究表明，在氧化应激的条件下，神经毒性氧化物能够显著且持续地使ASK1磷酸化，激活ASK1-JNK-p38信号通路，造成神经元细胞死亡，引起相应疾病的发生[37]。因此，通过调节ASK1的 活性治疗人类神经系统疾病具有巨大的潜在价值。为了开发强效、高选择性和高脑渗透性的ASK1抑制剂，Felix研究小组采用基于结构的药物设计策略（structure-based drug design，SBDD），通过检测被人ASK1-V5全长质粒转染的高表达ASK1 的HEK-293T细胞系中的磷酸化水平，发现化合物24具有中等ASK1磷酸化抑制活性（细胞IC50 = 138 nmol · L-1），并且药物在大鼠脑间质液与血液中的游离药物浓度比Kp, uu达0.38，具有较好的中枢渗透性[38]。为了提高活性及选择性，研究人员首先将化合物24中的异丙基位置引入三氟甲基，旨在靶向极性氨基酸残基Asp807、Asn808和Ser821，得到化合物25。研究结果显示，化合物25具有更好的药效及药代动力学性质，但选择性并没有较大改善；通过分子对接分析（见图4）表明，手性三氟甲基更偏向溶剂区而远离疏水口袋，无法与极性氨基酸形成额外的作用。随后，研究人员将化合物25的溶剂区替换为极性表面积（polar surface area， PSA）更小的甲氧基吡啶基，并且让杂原子处于合适的位置与酰胺的NH形成分子内氢键，因为更小的PSA有利于提高化合物的脑渗透性，分子内的氢键有利于降低分子的极性并使分子构象趋近于平面而保持较高活性。该研究结果显示，化合物26活性（细胞IC50 = 25 nmol · L-1）、脑渗透性（Kp, uu = 0.46）等理化性质均较佳。此外，虽然化合物26激酶选择性仍低于化合物1，但在0.1 μmol · L-1下，其仅对468种激酶中的9种结合率超过90%。体内实验结果表明，化合物26通过抑制ASK1活性，可减少Tg4510转基因AD小鼠模型中异常升高的IL-1β、趋化因子KC/GRO及单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）等脑细胞因子以达到治疗疾病的效果。上述实验结果显示，用中枢神经系统渗透性ASK1抑制剂是治疗神经退行性疾病的潜在方案，可通过对溶剂结合区的结构修饰提升ASK1抑制剂的选择性及脑渗透性。 2.4 自身免疫引起的炎症性疾病 当机体受到热、渗透压、病原体感染等外界刺激时，ASK1-JNK-p38信号通路被激活，释放出白介素-6（interleukin-6，IL-6）、TNF-α 和 IL-1β 等促炎细胞因子，诱导细胞程序性死亡以清除体内多余或受损的细胞[39]。然而当免疫功能紊乱时，ASK1被持续激活，释放出的炎症因子对机体造成持久性损伤。因此，选择性抑制ASK1的活性有望治疗自身免疫引起的炎症性疾病[40-41]。Swinnen等[42]采用基于靶点的高通量筛选（high throughput screening，HTS）开发了三唑并吡啶类小分子ASK1抑制剂（化合物27 ~ 30），其先导化合物27显示出对ASK1 中等抑制活性，其IC50为3 000 nmol · L-1。分子对接结果（见图5）显示，化合物27的羰基与Val757形成氢键。为了提高其药效和药代动力学性质，研究人员合成了182种三唑并吡啶类衍生物。分子对接和活性测试结果表明，三唑并吡啶环伸入疏水口袋，因此，在7位碳原子上引入亲脂性的三氟甲基有助于活性的提高；在5位碳原子上引入单取代的含氮基团可以与疏水口袋边缘的Leu686形成额外的氢键作用从而大幅度提高活性及选择性，且氮原子上取代基为柔性基团时活性要优于刚性基团，刚性环越大活性越低；将苯环替换为吡啶环后，不仅可以使吡啶环氮原子与Tyr814形成额外的氢键作用，同时分子构象产生了较大的变化，三唑并吡啶环的1位氮原子及酰胺键的NH与Val757形成氢键网络从而大幅度提升活性。药代动力学和药效学研究表明，化合物28不仅具有较高的ASK1抑制活性（IC50 = 93 nmol · L-1）和优异的选择性，其代谢稳定性强、 细胞膜渗透性高且血浆蛋白结合率适宜。同时，体内实验表明，化合物28可以改善由自身免疫紊乱引起的变态反应性脑脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）和自身免疫性视神经炎（autoimmune optic neuropathy，AON），并可能有助于治疗包括多发性硬化症（multiple sclerosis， MS）在内的自身免疫引起的神经性炎症。 陈亚东课题组采用SBDD策略，开发了1H-吲唑衍生物作为有效的ASK1抑制剂[43]。为了使1H吲唑骨架靶向ASK1，研究人员向先导化合物31（IC50 = 532 nmol · L-1）引入化合物1的异丙基和4环丙基咪唑片段，合成了化合物32，其IC50达到 62.2 nmol · L-1。随后，研究人员进行了构效关系研究，合成了20多种衍生物，筛选出了候选化合物33，其在体外显示出优异的ASK1激酶抑制活性（IC50 = 29.9 nmol · L-1）。分子对接结果（见图6）表明，该类化合物与化合物1的作用模式类似，但化合物33 是通过1H-吲唑环的2位氮原子与Val757形成氢键，并且1位NH与Glu755形成额外的氢键作用，这为ASK1抑制剂的开发提供了新的思路。研究人员采用AP1-HEK293细胞系进行了机制及细胞活性验证，该细胞系含有一个萤火虫荧光素酶基因，当细胞受到佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）刺激时，ASK1-JNK信号通路被激活而使荧光素酶基因表达增加，使用ASK1抑制剂可抑制 ASK1 活性进而使其表达降低，化合物33对该细胞系中的ASK1具有良好的抑制作用。在TNF-α诱导的HT-29 肠上皮细胞模型中，化合物33对细胞的保护作用与化合物1相当，且在高达25 μmol · L-1的浓度下对正常的HT-29细胞无明显的细胞毒性。通过蛋白质印迹分析表明，化合物33能够通过抑制TNF-α诱导的HT-29细胞中ASK1-JNK-p38信号通路的磷酸化调控细胞凋亡相关蛋白的表达水平，可能是一种治疗免疫性肠炎（inflammatory bowel disease，IBD）的潜在化合物。 3 结语与展望 ASK1是一种广泛表达且进化上保守的诱导细胞死亡、纤维化和炎症的关键介质，抑制ASK1的活性有望为肾脏、肝脏、中枢神经系统、炎症等多系统疾病提供新的治疗策略。目前已开发出多种具有良好药效和高选择性的ASK1抑制剂。这些 ASK1 抑制剂大多数为小分子，且具有出色的药代动力学性质。然而，目前大多数ASK1抑制剂是基于化合物1作为先导化合物通过环化策略或生物电子等排原理开发的类似物，母核结构类型较为单一且作用机制类似。此外，目前报道的抑制剂构效关系研究尚不够深入，多数化合物的激酶选择性仍不够理想，ASK1在靶标特异性、配体结合力方面的结构基础仍需进一步探索。 除了采用SBDD及HTS开发新型ASK1抑制剂以外，已有分子胶、蛋白水解靶向嵌合体等多种异双功能分子被报道能够用于调控蛋白激酶活性，并且在细胞层面表现出显著的活性和较高的选择性，这些策略的应用将进一步拓展基于ASK1开发新药分子的研究思路。 参考文献： [1] Matsuzawa A. 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“ 点击蓝字 关注我们 邢峻豪 药物化学博士，副研究员。2016年毕业于中国药科大学药物科学研究院，2015年10 月至2016年11月赴美国密西根大学安娜堡分校进行访学。主要研究方向为全新小分子药物的发现及药物合成工艺研究。先后主持国家自然科学基金和江苏省自然科学基金等纵向课题多项，并作为主要成员参与重大新药创制项目1项、国家级及省级科研课题多项。近年来以第一作者或通信作者在Angew Chem Int Ed, ACS Catal, Eur J Med Chem 等学科权威期刊发表论文多篇。此外，完成盐酸替罗非班、阿格列汀、利格列汀及阿哌沙班的工艺研究，授权专利8项，成果转化1项。 凋亡信号调节激酶1抑制剂的研究进展 PPS  柏琛，王小宇，邢峻豪* （中国药科大学理学院，江苏 南京 211198） [摘要] 凋亡信号调节激酶1（ASK1）是细胞丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAP3K）家族成员之一，其调控的ASK1-c-Jun氨基末端激酶（JNK）-p38丝裂原活化蛋白激酶（p38）信号通路与多种疾病密切相关。在细胞应激的刺激下ASK1被激活，诱导其下游JNK和p38磷酸化，进而激活下游细胞因子，促进细胞增殖、分化、凋亡及炎症因子的产生，导致机体出现破坏性的炎症反应、细胞 死亡与纤维化。目前，ASK1抑制剂已在如肾脏、肝脏、中枢神经系统和关节等疾病中表现出治疗潜力。综述ASK1抑制剂的研究进展 及其在疾病治疗中的潜在应用，旨在为该类抑制剂的设计与开发提供参考。 细胞凋亡信号调节激酶1（apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1）已成为预防p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinases，p38）和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）介导的细胞死亡和疾病的重要靶点[1-4]。大量研究表明，p38和JNK是细胞应激反应的关键介质，与多种人类疾病密切相关[5-9]。然而p38及JNK等普遍表达的蛋白对细胞存活、维持稳态和调节代谢功能至关重要，因此，完全抑制p38或JNK的活性会导致严重问题[10-12]。此外，p38及JNK抑制剂均表现出严重的肝毒性等副作用，故直接靶向p38或JNK的治疗策略欠佳[13-15]。ASK1与p38和JNK类似，均在多种细胞中普遍表达，但ASK1主要在细胞应激下被激活，受氧化还原信号的严格控制[16]。因此，作为p38和JNK的上游调节因子，ASK1是较理想的可成药靶点，能够在p38和JNK介导的疾病中发挥显著的治疗作用。 1 细胞凋亡信号调节激酶1 ASK1 是人丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase kinases， MAP3K）家族成员之一，可激活人丝裂原活化蛋白激酶激酶4/7（mitogen-activated protein kinase kinase 4/7，MKK4/7）-JNK 通路和人丝裂原活化蛋白激酶激酶3/6（mitogen-activated protein kinase kinase 3/6，MKK3/6）-p38通路，然后磷酸化多种底物以促进炎症和细胞死亡（见图1）[17]。ASK1可响应各种应激源，包括活性氧（reactive oxygen species，ROS）、内质网（endoplasmic reticulum，ER）应激、热、渗透休克、受体介导的炎症信号[如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）或脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）]、钙离子超载和病原体感染等[18-19]。在正常条件下，ASK1通常被含硫醇的抗氧化蛋白结合和抑制，包括硫氧还蛋白（thioredoxin，Trx）、谷氧还蛋白（glutaredoxin，Grx）和过氧化物还原蛋白（peroxiredoxin，Prx）[20]。在细胞应激下，这些抗氧化蛋白发生氧化并与ASK1解离，导致激活环内ASK1同型二聚体，在Thr838位点发生反式自磷酸化。磷酸化的ASK1具有更高的催化活性并磷酸化MKK3、MKK4、MKK6和MKK7，进而磷酸化并激活p38和JNK，这些磷酸化的激酶通过核内转录因子诱导细胞凋亡、炎症和纤维化，从而导致组织损伤[21]。鉴于前述的广泛影响，多项研究表明，异常的ASK1信号与人类疾病密切相关[22-23]。此外，ASK1敲除小鼠在基础条件下未显示任何明显的表型[24]。该证据表明，ASK1抑制剂可能是一种可用于治疗多种疾病的安全且有效的药物，具有较大的临床应用价值。 2 细胞凋亡信号调节激酶1抑制剂与疾病 2.1 非酒精性脂肪肝病 目前已报道的ASK1抑制剂主要应用于非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）治疗。NASH是非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）最严重的类型，也是慢性肝衰竭的主要诱因[25]。2016年，吉利德科学公司公布了高选择性ASK1抑制剂化合物1的Ⅱ期临床试验结果，确定其对患有Ⅱ期或Ⅲ期肝纤维化NASH患者安全有效[26]。在该项试验中，接受化合物1治疗的受试者肝病进展显著减缓；治疗24周后，在给药剂量18 mg组中，30例NASH患者中有13例纤维化得到逆转，给药剂量6 mg组中，27例中有8例纤维化症状明显缓解。上述研究结果表明，化合物1治疗对NASH患者安全有效。随后，大规模Ⅲ期临床试验评估化合物1用于NASH诱导的代偿性肝硬化治疗，该试验原计划持续240周，但在48周后停止，中止的原因为未达到预期临床终点[27]。然而，评估化合物1、firsocostat（GS-0976，一种ACC抑制剂）、cilofexor（GS-9674，一种非甾体类FXR激动剂）单一及联合用药治疗NASH（NCT02781584）以及NASH引起的桥接性 纤维化或代偿性肝硬化（NCT03449446）等2项Ⅱ期临床试验显示，使用组合疗法进行为期12周的治疗是安全的，并能改善肝脏脂肪变性、肝脏生化指标和纤维化指标，疗效与单一疗法相似。上述研究结果表明，ASK1抑制剂仍具有治疗NASH的潜力[28-29]。 在化合物1的基础上，江苏豪森药业集团有限公司发现了一系列新型ASK1抑制剂，可用于治疗NASH[30]。其中，通过环化法获得的化合物2和消旋化合物3对ASK1表现出相同的体外生化抑制活性，其IC50均为3.9 nmol · L-1；然而它们的药代动力学参数在小鼠中显示出显著差异。化合物3是在化合物2的结构基础上将甲基引入异吲哚啉酮环中获得，但表现出更好的药代动力学性质。该结果表明，当脂溶性基团（如甲基）被引入ASK1抑制剂 的结构中时，化合物在体内的代谢一般会减慢，其生物半衰期也会相应延长。在高脂饲料和CCl4诱导的NASH小鼠的体内实验表明，化合物2具有比化合物1更好的疗效，提示通过环化策略开发新型ASK1抑制剂是可行的。 此外，江苏豪森和广东东阳光分别用适当的连 接子环化化合物1的环丙基和三氮唑基团，获得另一类新型ASK1抑制剂[31-32]。该研究首先制备了化合物4 ~ 6以分析其环大小对活性的影响，体外活性实验结果显示，这些化合物均在低纳摩尔水平下对ASK1表现出抑制活性，表明该位置环的大小对ASK1蛋白的抑制活性具有良好的耐受性。随后，该研究引入含有杂原子的官能团进入新环，结果表明，除三氮唑吡嗪骨架化合物8的抑制活性（IC50 = 47.8 nmol · L-1）大幅下降以外，氧杂环产物7和砜杂环产物9对ASK1的抑制活性基本保持不变，IC50 均低于10 nmol · L-1。然后，该研究向化合物 4 的吡咯环引入了不同性质的取代基以进行详细的构效关系研究，得到了化合物10 ~ 13，并发现除 化合物13以外，该类化合物均显示出较高的抑制活性，但这些脂溶性基团反而促进了其在体内的代谢，半衰期均比化合物4短。为了探究该类抑制剂与ASK1蛋白的作用机制，将化合物4和ASK1蛋白进行分子对接，结果显示，化合物4的羰基与 ASK1 的铰链区氨基酸残基Val757产生关键性的氢键作用，而三氮唑伸入疏水口袋和Lys709形成氢键，吡咯环在疏水口袋边缘（见图2）。该研究结果表明，虽然环的大小不会影响对ASK1的抑制活性，但当环上含有NH等极性较大的基团时，可能会影响三氮唑伸入疏水口袋而使抑制活性降低。在对高脂饲料和CCl4诱导的NASH小鼠的体内实验表明，该类化合物均可显著降低小鼠的谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平，且效果优于化合物1。综上可见，通过环化策略开发新型ASK1抑制剂具有可行性，且引入不同大小及性质的环能够在保留较高ASK1抑制活性的同时，改善药物分子的药代动力学性质。 2.2 慢性肾脏疾病 在慢性肾脏疾病（chronic kidney disease，CKD）患者中，ASK1-JNK-p38信号通路被激活，驱动肾小管上皮细胞、足细胞和系膜细胞的凋亡，引起肾脏炎症和纤维化[33]。目前已有大量研究表明，抑制ASK1活性能够通过减少细胞死亡、炎症和纤维化来维持肾功能[34]。为了开发出新型ASK1抑制剂，吉利德科学公司使用竞争性时间分辨荧光共振能量转移免疫测定法针对ASK1激酶结构域筛选了含约100 000种化合物的化合物库，筛选出的先导化合物吡啶酰胺衍生物14具有中等抑制活性（IC50 = 2.2 μmol · L-1）[35]。对化合物14与ASK1的结合模式分析表明，三氮唑N-甲基取代基周围有一个疏水口袋，可以填充更大的基团，而在吡啶环上引入亲水性芳香基团可以改善其理化性质。通过组合这些优选元素发现，化合物15具有较高的活性。随后，研究人员进一步优化了氢键受体的性质以提高选择性，在对该位置的芳基、杂芳基和杂环取代基进行广泛筛选后发现，将吡啶环替换为咪唑不仅保持了抑制活性，而且还提高了溶解度。随后，引入4-环丙基咪唑合成了化合物16，其生物活性比化合物14提高了750倍以上。分子对接结果显示，化合物16与Val757和Lys709形成关键性的氢键，三氮唑的N-环丙基填充了Ser821、Asp822、Leu810和Asn808等氨基酸残基形成的口袋，咪唑环延伸到铰链区，并与Tyr814形成氢键。体内外实验研究表明，化合物16是一种有效的选择性ASK1小分子抑制剂，在啮齿动物中口服有效且耐受性良好。另外，多个急性和慢性肾脏疾病的体内模型研究表明，ASK1是肾纤维化、细胞凋亡和炎症的关键介质；接受化合物16预防性或治疗性给药的啮齿动物，其肾小管间质纤维化和凋亡、肾小球硬化和蛋白尿等症状明显减缓，且肾功能得到改善。 基于吉利德科学公司的研究，广东东阳光公司开发了一系列酰胺类新型ASK1抑制剂（化合物17 ~ 23），用于慢性肾脏疾病的治疗[36]。值得注意的是，该研究所涉及化合物的酰胺结构位置与化合物16等其他抑制剂的结构位置不同，其中氨基和羰基的位置发生了交换，但仍保留了较高的抑制活性，化合物17的IC50为2.43 nmol · L-1，与化合物16的活性基本相同。提示，这可能是因为化合物16吡啶环上氮原子能够与酰胺键形成分子内氢键使整体构象趋近于平面，将化合物16的氨基和羰基互换位置并将苯环替换为吡啶环后，分子内的氢键得以保留因而不影响其抑制活性。化合物16和化合物17与ASK1的分子对接结果（见图3）也证明了这一点，并且其作用模式均与化合物1相似。将环丙基替换为异丙基得到的化合物18活性有显著提高，但将溶剂区吡啶氮原子更换位置后，活性会下降。另外，当溶剂区吡啶环上引入N-吗啉基、甲氧基、甲硫基等亲水性取代基时活性显著高于引入亲脂性的氟原子。体内实验结果表明，该系列化合物在口服给药后大鼠体内血药浓度及暴露量水平较高，清除率较低，口服生物利用度较好，在肝和肾中的浓度较高，具有良好的药代动力学性质；将其应用于单侧输尿管梗阻的肾纤维化大鼠模型中，可以显著降低肾纤维化水平。 2.3 神经退行性疾病 阿尔茨海默病（Alzheimer , s disease，AD）和帕金森综合征（Parkinson , s disease，PD）等神经退行性疾病发病率逐年提升，严重威胁人类健康。目前的研究表明，在氧化应激的条件下，神经毒性氧化物能够显著且持续地使ASK1磷酸化，激活ASK1-JNK-p38信号通路，造成神经元细胞死亡，引起相应疾病的发生[37]。因此，通过调节ASK1的 活性治疗人类神经系统疾病具有巨大的潜在价值。为了开发强效、高选择性和高脑渗透性的ASK1抑制剂，Felix研究小组采用基于结构的药物设计策略（structure-based drug design，SBDD），通过检测被人ASK1-V5全长质粒转染的高表达ASK1 的HEK-293T细胞系中的磷酸化水平，发现化合物24具有中等ASK1磷酸化抑制活性（细胞IC50 = 138 nmol · L-1），并且药物在大鼠脑间质液与血液中的游离药物浓度比Kp, uu达0.38，具有较好的中枢渗透性[38]。为了提高活性及选择性，研究人员首先将化合物24中的异丙基位置引入三氟甲基，旨在靶向极性氨基酸残基Asp807、Asn808和Ser821，得到化合物25。研究结果显示，化合物25具有更好的药效及药代动力学性质，但选择性并没有较大改善；通过分子对接分析（见图4）表明，手性三氟甲基更偏向溶剂区而远离疏水口袋，无法与极性氨基酸形成额外的作用。随后，研究人员将化合物25的溶剂区替换为极性表面积（polar surface area， PSA）更小的甲氧基吡啶基，并且让杂原子处于合适的位置与酰胺的NH形成分子内氢键，因为更小的PSA有利于提高化合物的脑渗透性，分子内的氢键有利于降低分子的极性并使分子构象趋近于平面而保持较高活性。该研究结果显示，化合物26活性（细胞IC50 = 25 nmol · L-1）、脑渗透性（Kp, uu = 0.46）等理化性质均较佳。此外，虽然化合物26激酶选择性仍低于化合物1，但在0.1 μmol · L-1下，其仅对468种激酶中的9种结合率超过90%。体内实验结果表明，化合物26通过抑制ASK1活性，可减少Tg4510转基因AD小鼠模型中异常升高的IL-1β、趋化因子KC/GRO及单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）等脑细胞因子以达到治疗疾病的效果。上述实验结果显示，用中枢神经系统渗透性ASK1抑制剂是治疗神经退行性疾病的潜在方案，可通过对溶剂结合区的结构修饰提升ASK1抑制剂的选择性及脑渗透性。 2.4 自身免疫引起的炎症性疾病 当机体受到热、渗透压、病原体感染等外界刺激时，ASK1-JNK-p38信号通路被激活，释放出白介素-6（interleukin-6，IL-6）、TNF-α 和 IL-1β 等促炎细胞因子，诱导细胞程序性死亡以清除体内多余或受损的细胞[39]。然而当免疫功能紊乱时，ASK1被持续激活，释放出的炎症因子对机体造成持久性损伤。因此，选择性抑制ASK1的活性有望治疗自身免疫引起的炎症性疾病[40-41]。Swinnen等[42]采用基于靶点的高通量筛选（high throughput screening，HTS）开发了三唑并吡啶类小分子ASK1抑制剂（化合物27 ~ 30），其先导化合物27显示出对ASK1 中等抑制活性，其IC50为3 000 nmol · L-1。分子对接结果（见图5）显示，化合物27的羰基与Val757形成氢键。为了提高其药效和药代动力学性质，研究人员合成了182种三唑并吡啶类衍生物。分子对接和活性测试结果表明，三唑并吡啶环伸入疏水口袋，因此，在7位碳原子上引入亲脂性的三氟甲基有助于活性的提高；在5位碳原子上引入单取代的含氮基团可以与疏水口袋边缘的Leu686形成额外的氢键作用从而大幅度提高活性及选择性，且氮原子上取代基为柔性基团时活性要优于刚性基团，刚性环越大活性越低；将苯环替换为吡啶环后，不仅可以使吡啶环氮原子与Tyr814形成额外的氢键作用，同时分子构象产生了较大的变化，三唑并吡啶环的1位氮原子及酰胺键的NH与Val757形成氢键网络从而大幅度提升活性。药代动力学和药效学研究表明，化合物28不仅具有较高的ASK1抑制活性（IC50 = 93 nmol · L-1）和优异的选择性，其代谢稳定性强、 细胞膜渗透性高且血浆蛋白结合率适宜。同时，体内实验表明，化合物28可以改善由自身免疫紊乱引起的变态反应性脑脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）和自身免疫性视神经炎（autoimmune optic neuropathy，AON），并可能有助于治疗包括多发性硬化症（multiple sclerosis， MS）在内的自身免疫引起的神经性炎症。 陈亚东课题组采用SBDD策略，开发了1H-吲唑衍生物作为有效的ASK1抑制剂[43]。为了使1H吲唑骨架靶向ASK1，研究人员向先导化合物31（IC50 = 532 nmol · L-1）引入化合物1的异丙基和4环丙基咪唑片段，合成了化合物32，其IC50达到 62.2 nmol · L-1。随后，研究人员进行了构效关系研究，合成了20多种衍生物，筛选出了候选化合物33，其在体外显示出优异的ASK1激酶抑制活性（IC50 = 29.9 nmol · L-1）。分子对接结果（见图6）表明，该类化合物与化合物1的作用模式类似，但化合物33 是通过1H-吲唑环的2位氮原子与Val757形成氢键，并且1位NH与Glu755形成额外的氢键作用，这为ASK1抑制剂的开发提供了新的思路。研究人员采用AP1-HEK293细胞系进行了机制及细胞活性验证，该细胞系含有一个萤火虫荧光素酶基因，当细胞受到佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）刺激时，ASK1-JNK信号通路被激活而使荧光素酶基因表达增加，使用ASK1抑制剂可抑制 ASK1 活性进而使其表达降低，化合物33对该细胞系中的ASK1具有良好的抑制作用。在TNF-α诱导的HT-29 肠上皮细胞模型中，化合物33对细胞的保护作用与化合物1相当，且在高达25 μmol · L-1的浓度下对正常的HT-29细胞无明显的细胞毒性。通过蛋白质印迹分析表明，化合物33能够通过抑制TNF-α诱导的HT-29细胞中ASK1-JNK-p38信号通路的磷酸化调控细胞凋亡相关蛋白的表达水平，可能是一种治疗免疫性肠炎（inflammatory bowel disease，IBD）的潜在化合物。 3 结语与展望 ASK1是一种广泛表达且进化上保守的诱导细胞死亡、纤维化和炎症的关键介质，抑制ASK1的活性有望为肾脏、肝脏、中枢神经系统、炎症等多系统疾病提供新的治疗策略。目前已开发出多种具有良好药效和高选择性的ASK1抑制剂。这些 ASK1 抑制剂大多数为小分子，且具有出色的药代动力学性质。然而，目前大多数ASK1抑制剂是基于化合物1作为先导化合物通过环化策略或生物电子等排原理开发的类似物，母核结构类型较为单一且作用机制类似。此外，目前报道的抑制剂构效关系研究尚不够深入，多数化合物的激酶选择性仍不够理想，ASK1在靶标特异性、配体结合力方面的结构基础仍需进一步探索。 除了采用SBDD及HTS开发新型ASK1抑制剂以外，已有分子胶、蛋白水解靶向嵌合体等多种异双功能分子被报道能够用于调控蛋白激酶活性，并且在细胞层面表现出显著的活性和较高的选择性，这些策略的应用将进一步拓展基于ASK1开发新药分子的研究思路。 参考文献： [1] Matsuzawa A. 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导读 在生物制药领域，重组蛋白的生产是一项至关重要的技术，而大肠杆菌表达系统因其诸多优势，如生长迅速、易于培养、遗传背景清晰等，成为了生产重组蛋白的常用选择。然而，要在大肠杆菌中实现高效、高质量的重组蛋白表达，并非一帆风顺，而是面临着诸多挑战。今天，让我们一起解读发表于International Journal of Biological Macromolecules（IF:7.7）的文章“Strategies for optimization of heterologous protein expression in E. coli: Roadblocks and reinforcements”，探讨实现天然重组蛋白产量最大化的策略。 图1 在大肠杆菌中目的基因异源表达的示意图 一、大肠杆菌重组蛋白表达的基础要素 重组蛋白的表达依赖于表达载体和宿主的协同作用。表达载体是实现基因转录和翻译的关键工具，其包含多个重要元件（图2）。其中，启动子尤为关键，它如同基因表达的“开关”，控制着转录的起始。理想的启动子应具备强大的转录活性，以确保目的蛋白的高效积累，同时还需具备严格的调控能力，防止产物毒性对宿主细胞造成损害。在大肠杆菌表达系统中启动子的种类繁多（如lac、tac、trc），每种启动子都有其独特的性能，可以根据蛋白的性质和需求进行选择。同时，为了提高蛋白表达水平，一些研究对启动子进行了优化，如通过对lacUV5启动子进行突变，或调节T7 RNA聚合酶的活性，来优化膜蛋白基因的转录[1]。在实际应用中，可根据蛋白的具体情况，选择合适的启动子优化策略，以达到最佳表达效果。 图2 大肠杆菌表达载体的关键部分 宿主菌株的选择对于重组蛋白的成功表达至关重要，需根据表达载体的特性进行适配。此外，针对一些特殊蛋白，如膜蛋白、含有稀有密码子的蛋白或对细胞有毒性的蛋白，还需选用经过特殊改造的宿主菌株，这些菌株通过优化自身的基因表达调控机制或蛋白质折叠环境，能够更好地适应这些难表达蛋白的生产需求。例如，Rosetta菌株携带了识别稀有密码子的tRNA基因，可有效解决因密码子偏好导致的表达问题；Origami、Origami B、Rosetta-gami和SHuffle等菌株则通过突变关键基因，增强了胞内二硫键的形成能力，有利于含有二硫键的蛋白正确折叠[2]。 二、影响重组蛋白表达的关键因素 2.1 蛋白特性的影响 蛋白的大小对其在大肠杆菌中的表达有着显著影响，小于100kDa的蛋白通常较易表达，而大于100kDa的蛋白则可能面临表达困难，甚至被降解或提前终止翻译的问题，且小蛋白（<10kDa）也可能因折叠不当和易受蛋白酶降解而难以稳定表达。不同生物对密码子的使用存在偏好可能导致重组蛋白在大肠杆菌中表达时出现问题，当mRNA中的密码子不被宿主细胞的tRNA识别时，会出现翻译停滞、提前终止、移码或氨基酸错误掺入等情况，从而降低蛋白表达的数量和质量。 2.2  蛋白毒性的挑战 部分重组蛋白对宿主细胞具有毒性，这会严重阻碍其表达。这些毒性蛋白可能干扰宿主细胞的正常生理功能，如破坏细胞膜完整性、影响代谢途径或引发细胞应激反应，导致细胞生长受限甚至死亡。因此，在表达这类蛋白时，必须采取特殊策略，如使用严格调控的表达载体。 2.3 膜蛋白表达的难点 由于膜蛋白通常具有跨膜结构域，其在细胞内的过量表达容易使Sec转运系统饱和，导致蛋白无法正确插入细胞膜，进而在细胞质中聚集形成包涵体。此外，膜蛋白的疏水性使其易于相互作用并聚集，进一步加剧了表达和折叠的困难。为克服这些问题，研究人员尝试通过调控转录水平来控制膜蛋白基因的表达速度，减少蛋白聚集的发生。 2.4 蛋白翻译后修饰的需求 许多真核来源的蛋白质需要特定的翻译后修饰才能具备生物学活性，如二硫键形成、糖基化等。然而，大肠杆菌作为原核生物，其细胞质环境呈还原性，不利于二硫键的形成，这会导致含有二硫键的蛋白无法正确折叠，从而失去活性。对于一些需要复杂糖基化修饰的蛋白，大肠杆菌表达系统则无法满足其修饰需求，此时则需选择真核表达系统来实现蛋白的正确修饰和功能表达。 三、重组蛋白表达的优化策略 3.1 诱导条件的精细调控 诱导剂的浓度对蛋白表达至关重要，浓度过低会导致诱导效率低下，蛋白表达量不足；而浓度过高则可能产生毒性，抑制细胞生长，同时使蛋白合成速度超过折叠能力，导致包涵体形成。因此，针对不同蛋白，需精确优化诱导剂浓度，以实现高效可溶性表达。此外，温度对蛋白表达影响也很显著，较低温度通常有助于减少蛋白聚集，提高可溶性蛋白的比例，因为低温可降低疏水相互作用，抑制蛋白聚集反应。然而，对于某些蛋白，高温或热休克处理在诱导前进行，可通过激活热休克蛋白等机制，提高蛋白的溶解度，避免其进入包涵体。诱导时的细菌生长阶段也会影响蛋白表达，在早对数生长期诱导，通常可获得较高的蛋白产量和活性，同时降低内源性蛋白的干扰，有利于蛋白纯化。但在某些情况下，晚对数期或稳定期诱导可能对特定蛋白的表达更为有利，如对于对宿主细胞有毒性的蛋白。 3.2 培养基成分的优化 由于大肠杆菌的二阶段生长特性，葡萄糖的存在会抑制乳糖操纵子的表达，即所谓的“代谢物阻遏”现象。在诱导前添加适量葡萄糖可有效抑制基础表达，减少毒性蛋白对细胞的损害。同时，合理控制葡萄糖浓度还能调节细胞生长和重组蛋白表达，避免葡萄糖过量导致的细胞生长抑制和蛋白表达下降。此外，如表1所示，向培养基中添加特定添加剂可改善蛋白折叠和稳定性，从而提高可溶性蛋白的产量[3]。 表1 添加剂及其可能的作用 3.3 融合标签的应用策略 融合标签是提高蛋白可溶性表达和简化纯化过程的有效手段。例如，麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、硫氧还蛋白等标签（表2），它们不仅能促进蛋白正确折叠，还可通过亲和层析实现一步纯化。为将重组蛋白转运至周质空间或分泌到培养基中，可使用特定信号序列或融合标签，如PelB、OmpA、PhoA等信号序列可引导蛋白通过内膜转运至周质空间，利用周质空间的氧化环境促进二硫键形成，提高蛋白稳定性和活性[4]。 表2 用于可溶性蛋白表达的各种融合标签 3.4 分子伴侣共表达的协同作用 分子伴侣在蛋白折叠过程中发挥着关键作用，它们能够协助新生多肽链正确折叠，防止其聚集形成非功能性结构。在大肠杆菌中，共表达分子伴侣如GroEL/GroES或DnaK/DnaJ/GrpE系统，可显著提高某些难表达蛋白的可溶性和活性[5]。然而，不同蛋白可能需要特定的分子伴侣协助，因此准确识别并共表达与之匹配的分子伴侣至关重要。通过优化分子伴侣的共表达策略，可有效改善蛋白折叠环境，提高蛋白表达质量。 结语 大肠杆菌表达系统在重组蛋白表达中具有重要地位，但面临诸多挑战。通过深入理解影响蛋白表达的各种因素，并针对性地运用优化策略，如精细调控诱导条件、优化培养基成分、合理应用融合标签、共表达分子伴侣以及有效处理包涵体等，能够显著提高重组蛋白的表达水平和质量。随着生物技术的不断发展，相信未来会有更多创新策略涌现，进一步推动大肠杆菌表达系统在生物制药、工业酶生产等领域的广泛应用，为生命科学研究和人类健康事业做出更大贡献。 参考文献 [1] Wagner S, Klepsch MM, Schlegel S, Appel A, Draheim R, Tarry M, Högbom M, van Wijk KJ, Slotboom DJ, Persson JO, de Gier JW. Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008, 105(38):14371-14376. [2] Lobstein J, Emrich CA, Jeans C, Faulkner M, Riggs P, Berkmen M. SHuffle, a novel Escherichia coli protein expression strain capable of correctly folding disulfide bonded proteins in its cytoplasm. Microb Cell Fact. 2012, 11(1):753. [3] Patil G, Rudolph R, Lange C. In vitro-refolding of a single-chain Fv fragment in the presence of heteroaromatic thiols. J Biotechnol. 2008, 134(3):218-221. [4] Malik A. Protein fusion tags for efficient expression and purification of recombinant proteins in the periplasmic space of E. coli. 3 Biotech. 2016, 6(1):44. [5] Voulgaridou GP, Mantso T, Chlichlia K, Panayiotidis MI, Pappa A. Efficient E. coli expression strategies for production of soluble human crystallin ALDH3A1. PLoS One. 2013, 8(2):e56582. 识别微信二维码，可添加药时空小编 请注明：姓名+研究方向！