MEK3

邢峻豪 药物化学博士，副研究员。2016年毕业于中国药科大学药物科学研究院，2015年10 月至2016年11月赴美国密西根大学安娜堡分校进行访学。主要研究方向为全新小分子药物的发现及药物合成工艺研究。先后主持国家自然科学基金和江苏省自然科学基金等纵向课题多项，并作为主要成员参与重大新药创制项目1项、国家级及省级科研课题多项。近年来以第一作者或通信作者在Angew Chem Int Ed, ACS Catal, Eur J Med Chem 等学科权威期刊发表论文多篇。此外，完成盐酸替罗非班、阿格列汀、利格列汀及阿哌沙班的工艺研究，授权专利8项，成果转化1项。 凋亡信号调节激酶1抑制剂的研究进展 PPS  柏琛，王小宇，邢峻豪* （中国药科大学理学院，江苏 南京 211198） [摘要] 凋亡信号调节激酶1（ASK1）是细胞丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAP3K）家族成员之一，其调控的ASK1-c-Jun氨基末端激酶（JNK）-p38丝裂原活化蛋白激酶（p38）信号通路与多种疾病密切相关。在细胞应激的刺激下ASK1被激活，诱导其下游JNK和p38磷酸化，进而激活下游细胞因子，促进细胞增殖、分化、凋亡及炎症因子的产生，导致机体出现破坏性的炎症反应、细胞 死亡与纤维化。目前，ASK1抑制剂已在如肾脏、肝脏、中枢神经系统和关节等疾病中表现出治疗潜力。综述ASK1抑制剂的研究进展 及其在疾病治疗中的潜在应用，旨在为该类抑制剂的设计与开发提供参考。 细胞凋亡信号调节激酶1（apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1）已成为预防p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinases，p38）和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）介导的细胞死亡和疾病的重要靶点[1-4]。大量研究表明，p38和JNK是细胞应激反应的关键介质，与多种人类疾病密切相关[5-9]。然而p38及JNK等普遍表达的蛋白对细胞存活、维持稳态和调节代谢功能至关重要，因此，完全抑制p38或JNK的活性会导致严重问题[10-12]。此外，p38及JNK抑制剂均表现出严重的肝毒性等副作用，故直接靶向p38或JNK的治疗策略欠佳[13-15]。ASK1与p38和JNK类似，均在多种细胞中普遍表达，但ASK1主要在细胞应激下被激活，受氧化还原信号的严格控制[16]。因此，作为p38和JNK的上游调节因子，ASK1是较理想的可成药靶点，能够在p38和JNK介导的疾病中发挥显著的治疗作用。 1 细胞凋亡信号调节激酶1 ASK1 是人丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase kinases， MAP3K）家族成员之一，可激活人丝裂原活化蛋白激酶激酶4/7（mitogen-activated protein kinase kinase 4/7，MKK4/7）-JNK 通路和人丝裂原活化蛋白激酶激酶3/6（mitogen-activated protein kinase kinase 3/6，MKK3/6）-p38通路，然后磷酸化多种底物以促进炎症和细胞死亡（见图1）[17]。ASK1可响应各种应激源，包括活性氧（reactive oxygen species，ROS）、内质网（endoplasmic reticulum，ER）应激、热、渗透休克、受体介导的炎症信号[如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）或脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）]、钙离子超载和病原体感染等[18-19]。在正常条件下，ASK1通常被含硫醇的抗氧化蛋白结合和抑制，包括硫氧还蛋白（thioredoxin，Trx）、谷氧还蛋白（glutaredoxin，Grx）和过氧化物还原蛋白（peroxiredoxin，Prx）[20]。在细胞应激下，这些抗氧化蛋白发生氧化并与ASK1解离，导致激活环内ASK1同型二聚体，在Thr838位点发生反式自磷酸化。磷酸化的ASK1具有更高的催化活性并磷酸化MKK3、MKK4、MKK6和MKK7，进而磷酸化并激活p38和JNK，这些磷酸化的激酶通过核内转录因子诱导细胞凋亡、炎症和纤维化，从而导致组织损伤[21]。鉴于前述的广泛影响，多项研究表明，异常的ASK1信号与人类疾病密切相关[22-23]。此外，ASK1敲除小鼠在基础条件下未显示任何明显的表型[24]。该证据表明，ASK1抑制剂可能是一种可用于治疗多种疾病的安全且有效的药物，具有较大的临床应用价值。 2 细胞凋亡信号调节激酶1抑制剂与疾病 2.1 非酒精性脂肪肝病 目前已报道的ASK1抑制剂主要应用于非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）治疗。NASH是非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）最严重的类型，也是慢性肝衰竭的主要诱因[25]。2016年，吉利德科学公司公布了高选择性ASK1抑制剂化合物1的Ⅱ期临床试验结果，确定其对患有Ⅱ期或Ⅲ期肝纤维化NASH患者安全有效[26]。在该项试验中，接受化合物1治疗的受试者肝病进展显著减缓；治疗24周后，在给药剂量18 mg组中，30例NASH患者中有13例纤维化得到逆转，给药剂量6 mg组中，27例中有8例纤维化症状明显缓解。上述研究结果表明，化合物1治疗对NASH患者安全有效。随后，大规模Ⅲ期临床试验评估化合物1用于NASH诱导的代偿性肝硬化治疗，该试验原计划持续240周，但在48周后停止，中止的原因为未达到预期临床终点[27]。然而，评估化合物1、firsocostat（GS-0976，一种ACC抑制剂）、cilofexor（GS-9674，一种非甾体类FXR激动剂）单一及联合用药治疗NASH（NCT02781584）以及NASH引起的桥接性 纤维化或代偿性肝硬化（NCT03449446）等2项Ⅱ期临床试验显示，使用组合疗法进行为期12周的治疗是安全的，并能改善肝脏脂肪变性、肝脏生化指标和纤维化指标，疗效与单一疗法相似。上述研究结果表明，ASK1抑制剂仍具有治疗NASH的潜力[28-29]。 在化合物1的基础上，江苏豪森药业集团有限公司发现了一系列新型ASK1抑制剂，可用于治疗NASH[30]。其中，通过环化法获得的化合物2和消旋化合物3对ASK1表现出相同的体外生化抑制活性，其IC50均为3.9 nmol · L-1；然而它们的药代动力学参数在小鼠中显示出显著差异。化合物3是在化合物2的结构基础上将甲基引入异吲哚啉酮环中获得，但表现出更好的药代动力学性质。该结果表明，当脂溶性基团（如甲基）被引入ASK1抑制剂 的结构中时，化合物在体内的代谢一般会减慢，其生物半衰期也会相应延长。在高脂饲料和CCl4诱导的NASH小鼠的体内实验表明，化合物2具有比化合物1更好的疗效，提示通过环化策略开发新型ASK1抑制剂是可行的。 此外，江苏豪森和广东东阳光分别用适当的连 接子环化化合物1的环丙基和三氮唑基团，获得另一类新型ASK1抑制剂[31-32]。该研究首先制备了化合物4 ~ 6以分析其环大小对活性的影响，体外活性实验结果显示，这些化合物均在低纳摩尔水平下对ASK1表现出抑制活性，表明该位置环的大小对ASK1蛋白的抑制活性具有良好的耐受性。随后，该研究引入含有杂原子的官能团进入新环，结果表明，除三氮唑吡嗪骨架化合物8的抑制活性（IC50 = 47.8 nmol · L-1）大幅下降以外，氧杂环产物7和砜杂环产物9对ASK1的抑制活性基本保持不变，IC50 均低于10 nmol · L-1。然后，该研究向化合物 4 的吡咯环引入了不同性质的取代基以进行详细的构效关系研究，得到了化合物10 ~ 13，并发现除 化合物13以外，该类化合物均显示出较高的抑制活性，但这些脂溶性基团反而促进了其在体内的代谢，半衰期均比化合物4短。为了探究该类抑制剂与ASK1蛋白的作用机制，将化合物4和ASK1蛋白进行分子对接，结果显示，化合物4的羰基与 ASK1 的铰链区氨基酸残基Val757产生关键性的氢键作用，而三氮唑伸入疏水口袋和Lys709形成氢键，吡咯环在疏水口袋边缘（见图2）。该研究结果表明，虽然环的大小不会影响对ASK1的抑制活性，但当环上含有NH等极性较大的基团时，可能会影响三氮唑伸入疏水口袋而使抑制活性降低。在对高脂饲料和CCl4诱导的NASH小鼠的体内实验表明，该类化合物均可显著降低小鼠的谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平，且效果优于化合物1。综上可见，通过环化策略开发新型ASK1抑制剂具有可行性，且引入不同大小及性质的环能够在保留较高ASK1抑制活性的同时，改善药物分子的药代动力学性质。 2.2 慢性肾脏疾病 在慢性肾脏疾病（chronic kidney disease，CKD）患者中，ASK1-JNK-p38信号通路被激活，驱动肾小管上皮细胞、足细胞和系膜细胞的凋亡，引起肾脏炎症和纤维化[33]。目前已有大量研究表明，抑制ASK1活性能够通过减少细胞死亡、炎症和纤维化来维持肾功能[34]。为了开发出新型ASK1抑制剂，吉利德科学公司使用竞争性时间分辨荧光共振能量转移免疫测定法针对ASK1激酶结构域筛选了含约100 000种化合物的化合物库，筛选出的先导化合物吡啶酰胺衍生物14具有中等抑制活性（IC50 = 2.2 μmol · L-1）[35]。对化合物14与ASK1的结合模式分析表明，三氮唑N-甲基取代基周围有一个疏水口袋，可以填充更大的基团，而在吡啶环上引入亲水性芳香基团可以改善其理化性质。通过组合这些优选元素发现，化合物15具有较高的活性。随后，研究人员进一步优化了氢键受体的性质以提高选择性，在对该位置的芳基、杂芳基和杂环取代基进行广泛筛选后发现，将吡啶环替换为咪唑不仅保持了抑制活性，而且还提高了溶解度。随后，引入4-环丙基咪唑合成了化合物16，其生物活性比化合物14提高了750倍以上。分子对接结果显示，化合物16与Val757和Lys709形成关键性的氢键，三氮唑的N-环丙基填充了Ser821、Asp822、Leu810和Asn808等氨基酸残基形成的口袋，咪唑环延伸到铰链区，并与Tyr814形成氢键。体内外实验研究表明，化合物16是一种有效的选择性ASK1小分子抑制剂，在啮齿动物中口服有效且耐受性良好。另外，多个急性和慢性肾脏疾病的体内模型研究表明，ASK1是肾纤维化、细胞凋亡和炎症的关键介质；接受化合物16预防性或治疗性给药的啮齿动物，其肾小管间质纤维化和凋亡、肾小球硬化和蛋白尿等症状明显减缓，且肾功能得到改善。 基于吉利德科学公司的研究，广东东阳光公司开发了一系列酰胺类新型ASK1抑制剂（化合物17 ~ 23），用于慢性肾脏疾病的治疗[36]。值得注意的是，该研究所涉及化合物的酰胺结构位置与化合物16等其他抑制剂的结构位置不同，其中氨基和羰基的位置发生了交换，但仍保留了较高的抑制活性，化合物17的IC50为2.43 nmol · L-1，与化合物16的活性基本相同。提示，这可能是因为化合物16吡啶环上氮原子能够与酰胺键形成分子内氢键使整体构象趋近于平面，将化合物16的氨基和羰基互换位置并将苯环替换为吡啶环后，分子内的氢键得以保留因而不影响其抑制活性。化合物16和化合物17与ASK1的分子对接结果（见图3）也证明了这一点，并且其作用模式均与化合物1相似。将环丙基替换为异丙基得到的化合物18活性有显著提高，但将溶剂区吡啶氮原子更换位置后，活性会下降。另外，当溶剂区吡啶环上引入N-吗啉基、甲氧基、甲硫基等亲水性取代基时活性显著高于引入亲脂性的氟原子。体内实验结果表明，该系列化合物在口服给药后大鼠体内血药浓度及暴露量水平较高，清除率较低，口服生物利用度较好，在肝和肾中的浓度较高，具有良好的药代动力学性质；将其应用于单侧输尿管梗阻的肾纤维化大鼠模型中，可以显著降低肾纤维化水平。 2.3 神经退行性疾病 阿尔茨海默病（Alzheimer , s disease，AD）和帕金森综合征（Parkinson , s disease，PD）等神经退行性疾病发病率逐年提升，严重威胁人类健康。目前的研究表明，在氧化应激的条件下，神经毒性氧化物能够显著且持续地使ASK1磷酸化，激活ASK1-JNK-p38信号通路，造成神经元细胞死亡，引起相应疾病的发生[37]。因此，通过调节ASK1的 活性治疗人类神经系统疾病具有巨大的潜在价值。为了开发强效、高选择性和高脑渗透性的ASK1抑制剂，Felix研究小组采用基于结构的药物设计策略（structure-based drug design，SBDD），通过检测被人ASK1-V5全长质粒转染的高表达ASK1 的HEK-293T细胞系中的磷酸化水平，发现化合物24具有中等ASK1磷酸化抑制活性（细胞IC50 = 138 nmol · L-1），并且药物在大鼠脑间质液与血液中的游离药物浓度比Kp, uu达0.38，具有较好的中枢渗透性[38]。为了提高活性及选择性，研究人员首先将化合物24中的异丙基位置引入三氟甲基，旨在靶向极性氨基酸残基Asp807、Asn808和Ser821，得到化合物25。研究结果显示，化合物25具有更好的药效及药代动力学性质，但选择性并没有较大改善；通过分子对接分析（见图4）表明，手性三氟甲基更偏向溶剂区而远离疏水口袋，无法与极性氨基酸形成额外的作用。随后，研究人员将化合物25的溶剂区替换为极性表面积（polar surface area， PSA）更小的甲氧基吡啶基，并且让杂原子处于合适的位置与酰胺的NH形成分子内氢键，因为更小的PSA有利于提高化合物的脑渗透性，分子内的氢键有利于降低分子的极性并使分子构象趋近于平面而保持较高活性。该研究结果显示，化合物26活性（细胞IC50 = 25 nmol · L-1）、脑渗透性（Kp, uu = 0.46）等理化性质均较佳。此外，虽然化合物26激酶选择性仍低于化合物1，但在0.1 μmol · L-1下，其仅对468种激酶中的9种结合率超过90%。体内实验结果表明，化合物26通过抑制ASK1活性，可减少Tg4510转基因AD小鼠模型中异常升高的IL-1β、趋化因子KC/GRO及单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）等脑细胞因子以达到治疗疾病的效果。上述实验结果显示，用中枢神经系统渗透性ASK1抑制剂是治疗神经退行性疾病的潜在方案，可通过对溶剂结合区的结构修饰提升ASK1抑制剂的选择性及脑渗透性。 2.4 自身免疫引起的炎症性疾病 当机体受到热、渗透压、病原体感染等外界刺激时，ASK1-JNK-p38信号通路被激活，释放出白介素-6（interleukin-6，IL-6）、TNF-α 和 IL-1β 等促炎细胞因子，诱导细胞程序性死亡以清除体内多余或受损的细胞[39]。然而当免疫功能紊乱时，ASK1被持续激活，释放出的炎症因子对机体造成持久性损伤。因此，选择性抑制ASK1的活性有望治疗自身免疫引起的炎症性疾病[40-41]。Swinnen等[42]采用基于靶点的高通量筛选（high throughput screening，HTS）开发了三唑并吡啶类小分子ASK1抑制剂（化合物27 ~ 30），其先导化合物27显示出对ASK1 中等抑制活性，其IC50为3 000 nmol · L-1。分子对接结果（见图5）显示，化合物27的羰基与Val757形成氢键。为了提高其药效和药代动力学性质，研究人员合成了182种三唑并吡啶类衍生物。分子对接和活性测试结果表明，三唑并吡啶环伸入疏水口袋，因此，在7位碳原子上引入亲脂性的三氟甲基有助于活性的提高；在5位碳原子上引入单取代的含氮基团可以与疏水口袋边缘的Leu686形成额外的氢键作用从而大幅度提高活性及选择性，且氮原子上取代基为柔性基团时活性要优于刚性基团，刚性环越大活性越低；将苯环替换为吡啶环后，不仅可以使吡啶环氮原子与Tyr814形成额外的氢键作用，同时分子构象产生了较大的变化，三唑并吡啶环的1位氮原子及酰胺键的NH与Val757形成氢键网络从而大幅度提升活性。药代动力学和药效学研究表明，化合物28不仅具有较高的ASK1抑制活性（IC50 = 93 nmol · L-1）和优异的选择性，其代谢稳定性强、 细胞膜渗透性高且血浆蛋白结合率适宜。同时，体内实验表明，化合物28可以改善由自身免疫紊乱引起的变态反应性脑脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）和自身免疫性视神经炎（autoimmune optic neuropathy，AON），并可能有助于治疗包括多发性硬化症（multiple sclerosis， MS）在内的自身免疫引起的神经性炎症。 陈亚东课题组采用SBDD策略，开发了1H-吲唑衍生物作为有效的ASK1抑制剂[43]。为了使1H吲唑骨架靶向ASK1，研究人员向先导化合物31（IC50 = 532 nmol · L-1）引入化合物1的异丙基和4环丙基咪唑片段，合成了化合物32，其IC50达到 62.2 nmol · L-1。随后，研究人员进行了构效关系研究，合成了20多种衍生物，筛选出了候选化合物33，其在体外显示出优异的ASK1激酶抑制活性（IC50 = 29.9 nmol · L-1）。分子对接结果（见图6）表明，该类化合物与化合物1的作用模式类似，但化合物33 是通过1H-吲唑环的2位氮原子与Val757形成氢键，并且1位NH与Glu755形成额外的氢键作用，这为ASK1抑制剂的开发提供了新的思路。研究人员采用AP1-HEK293细胞系进行了机制及细胞活性验证，该细胞系含有一个萤火虫荧光素酶基因，当细胞受到佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）刺激时，ASK1-JNK信号通路被激活而使荧光素酶基因表达增加，使用ASK1抑制剂可抑制 ASK1 活性进而使其表达降低，化合物33对该细胞系中的ASK1具有良好的抑制作用。在TNF-α诱导的HT-29 肠上皮细胞模型中，化合物33对细胞的保护作用与化合物1相当，且在高达25 μmol · L-1的浓度下对正常的HT-29细胞无明显的细胞毒性。通过蛋白质印迹分析表明，化合物33能够通过抑制TNF-α诱导的HT-29细胞中ASK1-JNK-p38信号通路的磷酸化调控细胞凋亡相关蛋白的表达水平，可能是一种治疗免疫性肠炎（inflammatory bowel disease，IBD）的潜在化合物。 3 结语与展望 ASK1是一种广泛表达且进化上保守的诱导细胞死亡、纤维化和炎症的关键介质，抑制ASK1的活性有望为肾脏、肝脏、中枢神经系统、炎症等多系统疾病提供新的治疗策略。目前已开发出多种具有良好药效和高选择性的ASK1抑制剂。这些 ASK1 抑制剂大多数为小分子，且具有出色的药代动力学性质。然而，目前大多数ASK1抑制剂是基于化合物1作为先导化合物通过环化策略或生物电子等排原理开发的类似物，母核结构类型较为单一且作用机制类似。此外，目前报道的抑制剂构效关系研究尚不够深入，多数化合物的激酶选择性仍不够理想，ASK1在靶标特异性、配体结合力方面的结构基础仍需进一步探索。 除了采用SBDD及HTS开发新型ASK1抑制剂以外，已有分子胶、蛋白水解靶向嵌合体等多种异双功能分子被报道能够用于调控蛋白激酶活性，并且在细胞层面表现出显著的活性和较高的选择性，这些策略的应用将进一步拓展基于ASK1开发新药分子的研究思路。 参考文献： [1] Matsuzawa A. Physiological roles of ASK family members in innate immunity and their involvement in pathogenesis of immune diseases[J]. Adv Biol Regul, 2017, 66: 46-53. DOI: 10.1016/ j.jbior.2017.10.007. [2] Cai D T, Jin H, Xiong Q X, et al. ER stress and ASK1-JNK activation contribute to oridonin-induced apoptosis and growth inhibition in cultured human hepatoblastoma HuH-6 cells[J]. Mol Cell Biochem, 2013, 379(1/2): 161-169. [3] Yin S, Zhao S, Li J, et al. NUMA1 modulates apoptosis of esophageal squamous cell carcinoma cells through regulating ASK1-JNK signaling pathway[J]. Cell Mol Life Sci, 2023, 80(8): 211. DOI: 10.1007/s00018-023-04854-0. [4] Fan M, Xiao H, Song D, et al. A novel N-arylpyridone compound alleviates the inflammatory and fibrotic reaction of silicosis by inhibiting the ASK1-p38 pathway and regulating macrophage polarization[J]. Front Pharmacol, 2022, 13: 848435. DOI: 10.3389/fphar.2022.848435. [5] Machado T R, Machado T R, Pascutti P G. The p38 MAPK inhibitors and their role in inflammatory diseases[J]. ChemistrySelect, 2021, 6(23): 5729-5742. [6] Cicenas J, Zalyte E, Rimkus A, et al. JNK, p38, ERK, and SGK1 inhibitors in cancer[J] . Cancers (Basel), 2017, 10(1): 1. DOI: 10.3390/cancers10010001. [7] Wu Q, Wu W, Jacevic V, et al. Selective inhibitors for JNK signalling: a potential targeted therapy in cancer[J]. J Enzyme Inhib Med Chem, 2020, 35(1): 574-583. [8] Anselmo F, Tatomir A, Boodhoo D, et al. JNK and phosphorylated Bcl-2 predict multiple sclerosis clinical activity and glatiramer acetate therapeutic response[J]. Clin Immunol, 2020, 210: 108297. DOI: 10.1016/j.clim.2019.108297. [9] García-Flores N, Jiménez-Suárez J, Garnés-García C, et al. P38 MAPK and radiotherapy: foes or friends?[J] . Cancers (Basel), 2023, 15(3): 861. DOI: 10.3390/cancers15030861. [10] Hammouda M B, Ford A E, Liu Y, et al. The JNK signaling pathway in inflammatory skin disorders and cancer[J]. Cells, 2020, 9(4): 857. DOI: 10.3390/cells9040857. [11] García-Hernández L, García-Ortega M B, Ruiz-Alcalá G, et al. The p38 MAPK components and modulators as biomarkers and molecular targets in cancer[J]. Int J Mol Sci, 2021, 23(1): 370. DOI: 10.3390/ ijms23010370. [12] Craige S M, Chen K, Blanton R M, et al. JNK and cardiometabolic dysfunction[J]. Biosci Rep, 2019, 39(7): BSR20190267. DOI: 10.1042/bsr20190267. [13] Hammaker D, Firestein G S. "Go upstream, young man": lessons learned from the p38 saga[J]. Ann Rheum Dis, 2010, 69(Suppl 1): i77-i82. DOI: 10.1136/ard.2009.119479. [14] Sun B, Zhang H, Dong Y, et al. Evaluation of the combination mode and features of p38 MAPK inhibitors: construction of different pharmacophore models and molecular docking[J]. Mol Simulat, 2019, 45(12): 975-984. [15] van der Velden J L J, Ye Y, Nolin J D, et al. JNK inhibition reduces lung remodeling and pulmonary fibrotic systemic markers[J]. Clin Transl Med, 2016, 5(1): 36. DOI: 10.1186/s40169-016-0117-2. [16] Shiizaki S, Naguro I, Ichijo H. Activation mechanisms of ASK1 in response to various stresses and its significance in intracellular signaling[J]. Adv Biol Regul, 2013, 53(1): 135-144. [17] Ichijo H , Nishida E, Irie K, et al. Induction of apoptosis by ASK1, a mammalian MAPKKK that activates SAPK/JNK and p38 signaling pathways[J]. Science, 1997, 278(5296): 90-94. [18] Soga M, Matsuzawa A, Ichijo H. Oxidative stress-induced diseases via the ASK1 signaling pathway[J]. Int J Cell Biol, 2012, 2012: 439587. DOI: 10.1155/2012/439587. [19] Nishida T, Hattori K, Watanabe K. The regulatory and signaling mechanisms of the ASK family[J]. Adv Biol Regul, 2017, 66: 2-22. DOI: 10.1016/j.jbior.2017.05.004. [20] Kylarova S, Kosek D, Petrvalska O, et al. Cysteine residues mediate high-affinity binding of thioredoxin to ASK1[J]. FEBS J, 2016, 283(20): 3821-3838. [21] Wen L, Wei Q. ASK1 inhibitor in chronic kidney disease therapy: from bench to bedside[J]. Kidney360, 2022, 3(7): 1128-1131. [22] Ogier J M, Nayagam B A, Lockhart P J. ASK1 inhibition: a therapeutic strategy with multi-system benefits[J] . J Mol Med (Berl), 2020, 98(3): 335-348. [23] Lucchini F C, Wueest S, Challa T D, et al. ASK1 inhibits browning of white adipose tissue in obesity[J]. Nat Commun, 2020, 11(1): 1642. DOI: 10.1038/s41467-020-15483-7. [24] Takeda K, Noguchi T, Naguro I, et al. Apoptosis signal regulating kinase 1 in stress and immune response[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2008, 48: 199-225. DOI: 10.1146/annurev. pharmtox.48.113006.094606. [25] Sheka A C, Adeyi O, Thompson J, et al. Nonalcoholic steatohepatitis: a review[J]. JAMA, 2020, 323(12): 1175-1183. [26] Loomba R, Lawitz E, Mantry P S, et al. The ASK1 inhibitor selonsertib in patients with nonalcoholic steatohepatitis: a randomized, phase 2 trial[J]. Hepatology, 2018, 67(2): 549-559. [27] Harrison S A, Wong V W, Okanoue T, et al. Selonsertib for patients with bridging fibrosis or compensated cirrhosis due to NASH: results from randomized phase III STELLAR trials[J]. J Hepatol, 2020, 73(1): 26-39. [28] Younossi Z M, Stepanova M, Noureddin M, et al. Improvements of f ibrosis and disease activity are associated with improvement of patient reported outcomes in patients with advanced fibrosis due to nonalcoholic steatohepatitis[J]. Hepatol Commun, 2021, 5(7): 1201-1211. [29] Younossi Z M, Stepanova M, Anstee Q M, et al. Reduced patient reported outcome scores associate with level of fibrosis in patients with nonalcoholic steatohepatitis[J]. Clin Gastroenterol Hepatol, 2019, 17(12): 2552-2560. [30] Jiangsu Haosen Pharmaceutical Group Co., Ltd. Apoptotic signal regulation kinase inhibitor, preparation method and application thereof: WO2018/157857A1[P/OL]. 2018-09-07[2024-03-04]. https:// patentscope2.wipo.int/search/zh/detail.jsf?docId=WO2018157857. [31] Jiangsu Haosen Pharmaceutical Group Co., Ltd. Amide derivative inhibitor and preparation method and application thereof: WO2018/157856A1[P/OL]. 2018-09-07[2024-03-04]. https:// patentscope2.wipo.int/search/zh/detail.jsf?docId=WO2018157856. [32] Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. Fused bicyclic compounds and uses thereof in medicine: WO2019/034096A1[P/OL]. 2019-02 21[2024-03-04]. https://patentscope2.wipo.int/search/zh/detail. jsf?docId=WO2019034096. [33] Tobiume K, Matsuzawa A, Takahashi T, et al. ASK1 is required for sustained activations of JNK/p38 MAP kinases and apoptosis[J]. EMBO Rep, 2001, 2(3): 222-228. [34] Tesch G H, Ma F Y, Nikolic-Paterson D J. ASK1: a new therapeutic target for kidney disease[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2016, 311(2): F373-F381. [35] Liles J T, Corkey B K, Notte G T, et al. ASK1 contributes to fibrosis and dysfunction in models of kidney disease[J]. J Clin Invest, 2018, 128(10): 4485-4500. [36] Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. Amide derivative and use thereof in medicine: WO2018/090869A1[P/OL]. 2018-05 24[2024-03-04]. https://patentscope2.wipo.int/search/zh/detail. jsf?docId=WO2018090869. [37] Hu X, Weng Z, Chu C T, et al. Peroxiredoxin-2 protects against 6-hydroxydopamine-induced dopaminergic neurodegeneration via attenuation of the apoptosis signal-regulating kinase (ASK1) signaling cascade[J]. J Neurosci, 2011, 31(1): 247-261. [38] Xin Z, Himmelbauer M K, Jones J H, et al. Discovery of CNS penetrant apoptosis signal-regulating kinase 1 (ASK1) inhibitors[J]. ACS Med Chem Lett, 2020, 11(4): 485-490. [39] Zhang Q S, Eaton G J, Diallo C, et al. Stress-Induced activation of apoptosis signal-regulating kinase 1 promotes osteoarthritis[J]. J Cell Physiol, 2016, 231(4): 944-953. [40] Fujisawa T, Takahashi M, Tsukamoto Y, et al. The ASK1-specific inhibitors K811 and K812 prolong survival in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis[J]. Hum Mol Genet, 2016, 25(2): 245-253. [41] Nygaard G, Di Paolo J A, Hammaker D, et al. Regulation and function of apoptosis signal-regulating kinase 1 in rheumatoid arthritis[J]. Biochem Pharmacol, 2018, 151: 282-290. DOI: 10.1016/ j.bcp.2018.01.041. [42] Swinnen D, Jorand-Lebrun C, Grippi-Vallotton T, et al. Preparation of triazolopyridine compounds and their use as ASK inhibitors: WO2009/027283A1[P/OL]. 2009-03-05[2024-03-04]. https:// patentscope2.wipo.int/search/zh/detail.jsf?docId=WO2009027283. [43] Hou S, Yang X, Yang Y, et al. Design, synthesis and biological evaluation of 1H-indazole derivatives as novel ASK1 inhibitors[J]. Eur J Med Chem, 2021, 220: 113482. DOI: 10.1016/ j.ejmech.2021.113482.  喜欢我们文章的朋友点个“在看”和“赞”吧，不然微信推送规则改变，有可能每天都会错过我们哦~ 免责声明 “汇聚南药”公众号所转载文章来源于其他公众号平台，主要目的在于分享行业相关知识，传递当前最新资讯。图片、文章版权均属于原作者所有，如有侵权，请在留言栏及时告知，我们会在24小时内删除相关信息。 信息来源：药学进展 往期推荐 本平台不对转载文章的观点负责，文章所包含内容的准确性、可靠性或完整性提供任何明示暗示的保证。

“ 点击蓝字 关注我们 邢峻豪 药物化学博士，副研究员。2016年毕业于中国药科大学药物科学研究院，2015年10 月至2016年11月赴美国密西根大学安娜堡分校进行访学。主要研究方向为全新小分子药物的发现及药物合成工艺研究。先后主持国家自然科学基金和江苏省自然科学基金等纵向课题多项，并作为主要成员参与重大新药创制项目1项、国家级及省级科研课题多项。近年来以第一作者或通信作者在Angew Chem Int Ed, ACS Catal, Eur J Med Chem 等学科权威期刊发表论文多篇。此外，完成盐酸替罗非班、阿格列汀、利格列汀及阿哌沙班的工艺研究，授权专利8项，成果转化1项。 凋亡信号调节激酶1抑制剂的研究进展 PPS  柏琛，王小宇，邢峻豪* （中国药科大学理学院，江苏 南京 211198） [摘要] 凋亡信号调节激酶1（ASK1）是细胞丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAP3K）家族成员之一，其调控的ASK1-c-Jun氨基末端激酶（JNK）-p38丝裂原活化蛋白激酶（p38）信号通路与多种疾病密切相关。在细胞应激的刺激下ASK1被激活，诱导其下游JNK和p38磷酸化，进而激活下游细胞因子，促进细胞增殖、分化、凋亡及炎症因子的产生，导致机体出现破坏性的炎症反应、细胞 死亡与纤维化。目前，ASK1抑制剂已在如肾脏、肝脏、中枢神经系统和关节等疾病中表现出治疗潜力。综述ASK1抑制剂的研究进展 及其在疾病治疗中的潜在应用，旨在为该类抑制剂的设计与开发提供参考。 细胞凋亡信号调节激酶1（apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1）已成为预防p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinases，p38）和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）介导的细胞死亡和疾病的重要靶点[1-4]。大量研究表明，p38和JNK是细胞应激反应的关键介质，与多种人类疾病密切相关[5-9]。然而p38及JNK等普遍表达的蛋白对细胞存活、维持稳态和调节代谢功能至关重要，因此，完全抑制p38或JNK的活性会导致严重问题[10-12]。此外，p38及JNK抑制剂均表现出严重的肝毒性等副作用，故直接靶向p38或JNK的治疗策略欠佳[13-15]。ASK1与p38和JNK类似，均在多种细胞中普遍表达，但ASK1主要在细胞应激下被激活，受氧化还原信号的严格控制[16]。因此，作为p38和JNK的上游调节因子，ASK1是较理想的可成药靶点，能够在p38和JNK介导的疾病中发挥显著的治疗作用。 1 细胞凋亡信号调节激酶1 ASK1 是人丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase kinases， MAP3K）家族成员之一，可激活人丝裂原活化蛋白激酶激酶4/7（mitogen-activated protein kinase kinase 4/7，MKK4/7）-JNK 通路和人丝裂原活化蛋白激酶激酶3/6（mitogen-activated protein kinase kinase 3/6，MKK3/6）-p38通路，然后磷酸化多种底物以促进炎症和细胞死亡（见图1）[17]。ASK1可响应各种应激源，包括活性氧（reactive oxygen species，ROS）、内质网（endoplasmic reticulum，ER）应激、热、渗透休克、受体介导的炎症信号[如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）或脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）]、钙离子超载和病原体感染等[18-19]。在正常条件下，ASK1通常被含硫醇的抗氧化蛋白结合和抑制，包括硫氧还蛋白（thioredoxin，Trx）、谷氧还蛋白（glutaredoxin，Grx）和过氧化物还原蛋白（peroxiredoxin，Prx）[20]。在细胞应激下，这些抗氧化蛋白发生氧化并与ASK1解离，导致激活环内ASK1同型二聚体，在Thr838位点发生反式自磷酸化。磷酸化的ASK1具有更高的催化活性并磷酸化MKK3、MKK4、MKK6和MKK7，进而磷酸化并激活p38和JNK，这些磷酸化的激酶通过核内转录因子诱导细胞凋亡、炎症和纤维化，从而导致组织损伤[21]。鉴于前述的广泛影响，多项研究表明，异常的ASK1信号与人类疾病密切相关[22-23]。此外，ASK1敲除小鼠在基础条件下未显示任何明显的表型[24]。该证据表明，ASK1抑制剂可能是一种可用于治疗多种疾病的安全且有效的药物，具有较大的临床应用价值。 2 细胞凋亡信号调节激酶1抑制剂与疾病 2.1 非酒精性脂肪肝病 目前已报道的ASK1抑制剂主要应用于非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）治疗。NASH是非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）最严重的类型，也是慢性肝衰竭的主要诱因[25]。2016年，吉利德科学公司公布了高选择性ASK1抑制剂化合物1的Ⅱ期临床试验结果，确定其对患有Ⅱ期或Ⅲ期肝纤维化NASH患者安全有效[26]。在该项试验中，接受化合物1治疗的受试者肝病进展显著减缓；治疗24周后，在给药剂量18 mg组中，30例NASH患者中有13例纤维化得到逆转，给药剂量6 mg组中，27例中有8例纤维化症状明显缓解。上述研究结果表明，化合物1治疗对NASH患者安全有效。随后，大规模Ⅲ期临床试验评估化合物1用于NASH诱导的代偿性肝硬化治疗，该试验原计划持续240周，但在48周后停止，中止的原因为未达到预期临床终点[27]。然而，评估化合物1、firsocostat（GS-0976，一种ACC抑制剂）、cilofexor（GS-9674，一种非甾体类FXR激动剂）单一及联合用药治疗NASH（NCT02781584）以及NASH引起的桥接性 纤维化或代偿性肝硬化（NCT03449446）等2项Ⅱ期临床试验显示，使用组合疗法进行为期12周的治疗是安全的，并能改善肝脏脂肪变性、肝脏生化指标和纤维化指标，疗效与单一疗法相似。上述研究结果表明，ASK1抑制剂仍具有治疗NASH的潜力[28-29]。 在化合物1的基础上，江苏豪森药业集团有限公司发现了一系列新型ASK1抑制剂，可用于治疗NASH[30]。其中，通过环化法获得的化合物2和消旋化合物3对ASK1表现出相同的体外生化抑制活性，其IC50均为3.9 nmol · L-1；然而它们的药代动力学参数在小鼠中显示出显著差异。化合物3是在化合物2的结构基础上将甲基引入异吲哚啉酮环中获得，但表现出更好的药代动力学性质。该结果表明，当脂溶性基团（如甲基）被引入ASK1抑制剂 的结构中时，化合物在体内的代谢一般会减慢，其生物半衰期也会相应延长。在高脂饲料和CCl4诱导的NASH小鼠的体内实验表明，化合物2具有比化合物1更好的疗效，提示通过环化策略开发新型ASK1抑制剂是可行的。 此外，江苏豪森和广东东阳光分别用适当的连 接子环化化合物1的环丙基和三氮唑基团，获得另一类新型ASK1抑制剂[31-32]。该研究首先制备了化合物4 ~ 6以分析其环大小对活性的影响，体外活性实验结果显示，这些化合物均在低纳摩尔水平下对ASK1表现出抑制活性，表明该位置环的大小对ASK1蛋白的抑制活性具有良好的耐受性。随后，该研究引入含有杂原子的官能团进入新环，结果表明，除三氮唑吡嗪骨架化合物8的抑制活性（IC50 = 47.8 nmol · L-1）大幅下降以外，氧杂环产物7和砜杂环产物9对ASK1的抑制活性基本保持不变，IC50 均低于10 nmol · L-1。然后，该研究向化合物 4 的吡咯环引入了不同性质的取代基以进行详细的构效关系研究，得到了化合物10 ~ 13，并发现除 化合物13以外，该类化合物均显示出较高的抑制活性，但这些脂溶性基团反而促进了其在体内的代谢，半衰期均比化合物4短。为了探究该类抑制剂与ASK1蛋白的作用机制，将化合物4和ASK1蛋白进行分子对接，结果显示，化合物4的羰基与 ASK1 的铰链区氨基酸残基Val757产生关键性的氢键作用，而三氮唑伸入疏水口袋和Lys709形成氢键，吡咯环在疏水口袋边缘（见图2）。该研究结果表明，虽然环的大小不会影响对ASK1的抑制活性，但当环上含有NH等极性较大的基团时，可能会影响三氮唑伸入疏水口袋而使抑制活性降低。在对高脂饲料和CCl4诱导的NASH小鼠的体内实验表明，该类化合物均可显著降低小鼠的谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平，且效果优于化合物1。综上可见，通过环化策略开发新型ASK1抑制剂具有可行性，且引入不同大小及性质的环能够在保留较高ASK1抑制活性的同时，改善药物分子的药代动力学性质。 2.2 慢性肾脏疾病 在慢性肾脏疾病（chronic kidney disease，CKD）患者中，ASK1-JNK-p38信号通路被激活，驱动肾小管上皮细胞、足细胞和系膜细胞的凋亡，引起肾脏炎症和纤维化[33]。目前已有大量研究表明，抑制ASK1活性能够通过减少细胞死亡、炎症和纤维化来维持肾功能[34]。为了开发出新型ASK1抑制剂，吉利德科学公司使用竞争性时间分辨荧光共振能量转移免疫测定法针对ASK1激酶结构域筛选了含约100 000种化合物的化合物库，筛选出的先导化合物吡啶酰胺衍生物14具有中等抑制活性（IC50 = 2.2 μmol · L-1）[35]。对化合物14与ASK1的结合模式分析表明，三氮唑N-甲基取代基周围有一个疏水口袋，可以填充更大的基团，而在吡啶环上引入亲水性芳香基团可以改善其理化性质。通过组合这些优选元素发现，化合物15具有较高的活性。随后，研究人员进一步优化了氢键受体的性质以提高选择性，在对该位置的芳基、杂芳基和杂环取代基进行广泛筛选后发现，将吡啶环替换为咪唑不仅保持了抑制活性，而且还提高了溶解度。随后，引入4-环丙基咪唑合成了化合物16，其生物活性比化合物14提高了750倍以上。分子对接结果显示，化合物16与Val757和Lys709形成关键性的氢键，三氮唑的N-环丙基填充了Ser821、Asp822、Leu810和Asn808等氨基酸残基形成的口袋，咪唑环延伸到铰链区，并与Tyr814形成氢键。体内外实验研究表明，化合物16是一种有效的选择性ASK1小分子抑制剂，在啮齿动物中口服有效且耐受性良好。另外，多个急性和慢性肾脏疾病的体内模型研究表明，ASK1是肾纤维化、细胞凋亡和炎症的关键介质；接受化合物16预防性或治疗性给药的啮齿动物，其肾小管间质纤维化和凋亡、肾小球硬化和蛋白尿等症状明显减缓，且肾功能得到改善。 基于吉利德科学公司的研究，广东东阳光公司开发了一系列酰胺类新型ASK1抑制剂（化合物17 ~ 23），用于慢性肾脏疾病的治疗[36]。值得注意的是，该研究所涉及化合物的酰胺结构位置与化合物16等其他抑制剂的结构位置不同，其中氨基和羰基的位置发生了交换，但仍保留了较高的抑制活性，化合物17的IC50为2.43 nmol · L-1，与化合物16的活性基本相同。提示，这可能是因为化合物16吡啶环上氮原子能够与酰胺键形成分子内氢键使整体构象趋近于平面，将化合物16的氨基和羰基互换位置并将苯环替换为吡啶环后，分子内的氢键得以保留因而不影响其抑制活性。化合物16和化合物17与ASK1的分子对接结果（见图3）也证明了这一点，并且其作用模式均与化合物1相似。将环丙基替换为异丙基得到的化合物18活性有显著提高，但将溶剂区吡啶氮原子更换位置后，活性会下降。另外，当溶剂区吡啶环上引入N-吗啉基、甲氧基、甲硫基等亲水性取代基时活性显著高于引入亲脂性的氟原子。体内实验结果表明，该系列化合物在口服给药后大鼠体内血药浓度及暴露量水平较高，清除率较低，口服生物利用度较好，在肝和肾中的浓度较高，具有良好的药代动力学性质；将其应用于单侧输尿管梗阻的肾纤维化大鼠模型中，可以显著降低肾纤维化水平。 2.3 神经退行性疾病 阿尔茨海默病（Alzheimer , s disease，AD）和帕金森综合征（Parkinson , s disease，PD）等神经退行性疾病发病率逐年提升，严重威胁人类健康。目前的研究表明，在氧化应激的条件下，神经毒性氧化物能够显著且持续地使ASK1磷酸化，激活ASK1-JNK-p38信号通路，造成神经元细胞死亡，引起相应疾病的发生[37]。因此，通过调节ASK1的 活性治疗人类神经系统疾病具有巨大的潜在价值。为了开发强效、高选择性和高脑渗透性的ASK1抑制剂，Felix研究小组采用基于结构的药物设计策略（structure-based drug design，SBDD），通过检测被人ASK1-V5全长质粒转染的高表达ASK1 的HEK-293T细胞系中的磷酸化水平，发现化合物24具有中等ASK1磷酸化抑制活性（细胞IC50 = 138 nmol · L-1），并且药物在大鼠脑间质液与血液中的游离药物浓度比Kp, uu达0.38，具有较好的中枢渗透性[38]。为了提高活性及选择性，研究人员首先将化合物24中的异丙基位置引入三氟甲基，旨在靶向极性氨基酸残基Asp807、Asn808和Ser821，得到化合物25。研究结果显示，化合物25具有更好的药效及药代动力学性质，但选择性并没有较大改善；通过分子对接分析（见图4）表明，手性三氟甲基更偏向溶剂区而远离疏水口袋，无法与极性氨基酸形成额外的作用。随后，研究人员将化合物25的溶剂区替换为极性表面积（polar surface area， PSA）更小的甲氧基吡啶基，并且让杂原子处于合适的位置与酰胺的NH形成分子内氢键，因为更小的PSA有利于提高化合物的脑渗透性，分子内的氢键有利于降低分子的极性并使分子构象趋近于平面而保持较高活性。该研究结果显示，化合物26活性（细胞IC50 = 25 nmol · L-1）、脑渗透性（Kp, uu = 0.46）等理化性质均较佳。此外，虽然化合物26激酶选择性仍低于化合物1，但在0.1 μmol · L-1下，其仅对468种激酶中的9种结合率超过90%。体内实验结果表明，化合物26通过抑制ASK1活性，可减少Tg4510转基因AD小鼠模型中异常升高的IL-1β、趋化因子KC/GRO及单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）等脑细胞因子以达到治疗疾病的效果。上述实验结果显示，用中枢神经系统渗透性ASK1抑制剂是治疗神经退行性疾病的潜在方案，可通过对溶剂结合区的结构修饰提升ASK1抑制剂的选择性及脑渗透性。 2.4 自身免疫引起的炎症性疾病 当机体受到热、渗透压、病原体感染等外界刺激时，ASK1-JNK-p38信号通路被激活，释放出白介素-6（interleukin-6，IL-6）、TNF-α 和 IL-1β 等促炎细胞因子，诱导细胞程序性死亡以清除体内多余或受损的细胞[39]。然而当免疫功能紊乱时，ASK1被持续激活，释放出的炎症因子对机体造成持久性损伤。因此，选择性抑制ASK1的活性有望治疗自身免疫引起的炎症性疾病[40-41]。Swinnen等[42]采用基于靶点的高通量筛选（high throughput screening，HTS）开发了三唑并吡啶类小分子ASK1抑制剂（化合物27 ~ 30），其先导化合物27显示出对ASK1 中等抑制活性，其IC50为3 000 nmol · L-1。分子对接结果（见图5）显示，化合物27的羰基与Val757形成氢键。为了提高其药效和药代动力学性质，研究人员合成了182种三唑并吡啶类衍生物。分子对接和活性测试结果表明，三唑并吡啶环伸入疏水口袋，因此，在7位碳原子上引入亲脂性的三氟甲基有助于活性的提高；在5位碳原子上引入单取代的含氮基团可以与疏水口袋边缘的Leu686形成额外的氢键作用从而大幅度提高活性及选择性，且氮原子上取代基为柔性基团时活性要优于刚性基团，刚性环越大活性越低；将苯环替换为吡啶环后，不仅可以使吡啶环氮原子与Tyr814形成额外的氢键作用，同时分子构象产生了较大的变化，三唑并吡啶环的1位氮原子及酰胺键的NH与Val757形成氢键网络从而大幅度提升活性。药代动力学和药效学研究表明，化合物28不仅具有较高的ASK1抑制活性（IC50 = 93 nmol · L-1）和优异的选择性，其代谢稳定性强、 细胞膜渗透性高且血浆蛋白结合率适宜。同时，体内实验表明，化合物28可以改善由自身免疫紊乱引起的变态反应性脑脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）和自身免疫性视神经炎（autoimmune optic neuropathy，AON），并可能有助于治疗包括多发性硬化症（multiple sclerosis， MS）在内的自身免疫引起的神经性炎症。 陈亚东课题组采用SBDD策略，开发了1H-吲唑衍生物作为有效的ASK1抑制剂[43]。为了使1H吲唑骨架靶向ASK1，研究人员向先导化合物31（IC50 = 532 nmol · L-1）引入化合物1的异丙基和4环丙基咪唑片段，合成了化合物32，其IC50达到 62.2 nmol · L-1。随后，研究人员进行了构效关系研究，合成了20多种衍生物，筛选出了候选化合物33，其在体外显示出优异的ASK1激酶抑制活性（IC50 = 29.9 nmol · L-1）。分子对接结果（见图6）表明，该类化合物与化合物1的作用模式类似，但化合物33 是通过1H-吲唑环的2位氮原子与Val757形成氢键，并且1位NH与Glu755形成额外的氢键作用，这为ASK1抑制剂的开发提供了新的思路。研究人员采用AP1-HEK293细胞系进行了机制及细胞活性验证，该细胞系含有一个萤火虫荧光素酶基因，当细胞受到佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）刺激时，ASK1-JNK信号通路被激活而使荧光素酶基因表达增加，使用ASK1抑制剂可抑制 ASK1 活性进而使其表达降低，化合物33对该细胞系中的ASK1具有良好的抑制作用。在TNF-α诱导的HT-29 肠上皮细胞模型中，化合物33对细胞的保护作用与化合物1相当，且在高达25 μmol · L-1的浓度下对正常的HT-29细胞无明显的细胞毒性。通过蛋白质印迹分析表明，化合物33能够通过抑制TNF-α诱导的HT-29细胞中ASK1-JNK-p38信号通路的磷酸化调控细胞凋亡相关蛋白的表达水平，可能是一种治疗免疫性肠炎（inflammatory bowel disease，IBD）的潜在化合物。 3 结语与展望 ASK1是一种广泛表达且进化上保守的诱导细胞死亡、纤维化和炎症的关键介质，抑制ASK1的活性有望为肾脏、肝脏、中枢神经系统、炎症等多系统疾病提供新的治疗策略。目前已开发出多种具有良好药效和高选择性的ASK1抑制剂。这些 ASK1 抑制剂大多数为小分子，且具有出色的药代动力学性质。然而，目前大多数ASK1抑制剂是基于化合物1作为先导化合物通过环化策略或生物电子等排原理开发的类似物，母核结构类型较为单一且作用机制类似。此外，目前报道的抑制剂构效关系研究尚不够深入，多数化合物的激酶选择性仍不够理想，ASK1在靶标特异性、配体结合力方面的结构基础仍需进一步探索。 除了采用SBDD及HTS开发新型ASK1抑制剂以外，已有分子胶、蛋白水解靶向嵌合体等多种异双功能分子被报道能够用于调控蛋白激酶活性，并且在细胞层面表现出显著的活性和较高的选择性，这些策略的应用将进一步拓展基于ASK1开发新药分子的研究思路。 参考文献： [1] Matsuzawa A. Physiological roles of ASK family members in innate immunity and their involvement in pathogenesis of immune diseases[J]. Adv Biol Regul, 2017, 66: 46-53. DOI: 10.1016/ j.jbior.2017.10.007. [2] Cai D T, Jin H, Xiong Q X, et al. ER stress and ASK1-JNK activation contribute to oridonin-induced apoptosis and growth inhibition in cultured human hepatoblastoma HuH-6 cells[J]. Mol Cell Biochem, 2013, 379(1/2): 161-169. [3] Yin S, Zhao S, Li J, et al. NUMA1 modulates apoptosis of esophageal squamous cell carcinoma cells through regulating ASK1-JNK signaling pathway[J]. Cell Mol Life Sci, 2023, 80(8): 211. DOI: 10.1007/s00018-023-04854-0. [4] Fan M, Xiao H, Song D, et al. A novel N-arylpyridone compound alleviates the inflammatory and fibrotic reaction of silicosis by inhibiting the ASK1-p38 pathway and regulating macrophage polarization[J]. Front Pharmacol, 2022, 13: 848435. DOI: 10.3389/fphar.2022.848435. [5] Machado T R, Machado T R, Pascutti P G. The p38 MAPK inhibitors and their role in inflammatory diseases[J]. ChemistrySelect, 2021, 6(23): 5729-5742. [6] Cicenas J, Zalyte E, Rimkus A, et al. JNK, p38, ERK, and SGK1 inhibitors in cancer[J] . Cancers (Basel), 2017, 10(1): 1. DOI: 10.3390/cancers10010001. [7] Wu Q, Wu W, Jacevic V, et al. Selective inhibitors for JNK signalling: a potential targeted therapy in cancer[J]. J Enzyme Inhib Med Chem, 2020, 35(1): 574-583. [8] Anselmo F, Tatomir A, Boodhoo D, et al. JNK and phosphorylated Bcl-2 predict multiple sclerosis clinical activity and glatiramer acetate therapeutic response[J]. Clin Immunol, 2020, 210: 108297. DOI: 10.1016/j.clim.2019.108297. [9] García-Flores N, Jiménez-Suárez J, Garnés-García C, et al. P38 MAPK and radiotherapy: foes or friends?[J] . Cancers (Basel), 2023, 15(3): 861. DOI: 10.3390/cancers15030861. [10] Hammouda M B, Ford A E, Liu Y, et al. The JNK signaling pathway in inflammatory skin disorders and cancer[J]. Cells, 2020, 9(4): 857. DOI: 10.3390/cells9040857. [11] García-Hernández L, García-Ortega M B, Ruiz-Alcalá G, et al. The p38 MAPK components and modulators as biomarkers and molecular targets in cancer[J]. Int J Mol Sci, 2021, 23(1): 370. DOI: 10.3390/ ijms23010370. [12] Craige S M, Chen K, Blanton R M, et al. JNK and cardiometabolic dysfunction[J]. Biosci Rep, 2019, 39(7): BSR20190267. DOI: 10.1042/bsr20190267. [13] Hammaker D, Firestein G S. "Go upstream, young man": lessons learned from the p38 saga[J]. Ann Rheum Dis, 2010, 69(Suppl 1): i77-i82. DOI: 10.1136/ard.2009.119479. [14] Sun B, Zhang H, Dong Y, et al. Evaluation of the combination mode and features of p38 MAPK inhibitors: construction of different pharmacophore models and molecular docking[J]. Mol Simulat, 2019, 45(12): 975-984. [15] van der Velden J L J, Ye Y, Nolin J D, et al. JNK inhibition reduces lung remodeling and pulmonary fibrotic systemic markers[J]. Clin Transl Med, 2016, 5(1): 36. DOI: 10.1186/s40169-016-0117-2. [16] Shiizaki S, Naguro I, Ichijo H. Activation mechanisms of ASK1 in response to various stresses and its significance in intracellular signaling[J]. Adv Biol Regul, 2013, 53(1): 135-144. [17] Ichijo H , Nishida E, Irie K, et al. Induction of apoptosis by ASK1, a mammalian MAPKKK that activates SAPK/JNK and p38 signaling pathways[J]. Science, 1997, 278(5296): 90-94. [18] Soga M, Matsuzawa A, Ichijo H. Oxidative stress-induced diseases via the ASK1 signaling pathway[J]. Int J Cell Biol, 2012, 2012: 439587. DOI: 10.1155/2012/439587. [19] Nishida T, Hattori K, Watanabe K. The regulatory and signaling mechanisms of the ASK family[J]. Adv Biol Regul, 2017, 66: 2-22. DOI: 10.1016/j.jbior.2017.05.004. [20] Kylarova S, Kosek D, Petrvalska O, et al. Cysteine residues mediate high-affinity binding of thioredoxin to ASK1[J]. FEBS J, 2016, 283(20): 3821-3838. [21] Wen L, Wei Q. ASK1 inhibitor in chronic kidney disease therapy: from bench to bedside[J]. Kidney360, 2022, 3(7): 1128-1131. [22] Ogier J M, Nayagam B A, Lockhart P J. ASK1 inhibition: a therapeutic strategy with multi-system benefits[J] . J Mol Med (Berl), 2020, 98(3): 335-348. [23] Lucchini F C, Wueest S, Challa T D, et al. ASK1 inhibits browning of white adipose tissue in obesity[J]. Nat Commun, 2020, 11(1): 1642. DOI: 10.1038/s41467-020-15483-7. [24] Takeda K, Noguchi T, Naguro I, et al. Apoptosis signal regulating kinase 1 in stress and immune response[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2008, 48: 199-225. DOI: 10.1146/annurev. pharmtox.48.113006.094606. [25] Sheka A C, Adeyi O, Thompson J, et al. Nonalcoholic steatohepatitis: a review[J]. JAMA, 2020, 323(12): 1175-1183. [26] Loomba R, Lawitz E, Mantry P S, et al. The ASK1 inhibitor selonsertib in patients with nonalcoholic steatohepatitis: a randomized, phase 2 trial[J]. Hepatology, 2018, 67(2): 549-559. [27] Harrison S A, Wong V W, Okanoue T, et al. Selonsertib for patients with bridging fibrosis or compensated cirrhosis due to NASH: results from randomized phase III STELLAR trials[J]. J Hepatol, 2020, 73(1): 26-39. [28] Younossi Z M, Stepanova M, Noureddin M, et al. Improvements of f ibrosis and disease activity are associated with improvement of patient reported outcomes in patients with advanced fibrosis due to nonalcoholic steatohepatitis[J]. Hepatol Commun, 2021, 5(7): 1201-1211. [29] Younossi Z M, Stepanova M, Anstee Q M, et al. Reduced patient reported outcome scores associate with level of fibrosis in patients with nonalcoholic steatohepatitis[J]. Clin Gastroenterol Hepatol, 2019, 17(12): 2552-2560. [30] Jiangsu Haosen Pharmaceutical Group Co., Ltd. Apoptotic signal regulation kinase inhibitor, preparation method and application thereof: WO2018/157857A1[P/OL]. 2018-09-07[2024-03-04]. https:// patentscope2.wipo.int/search/zh/detail.jsf?docId=WO2018157857. [31] Jiangsu Haosen Pharmaceutical Group Co., Ltd. Amide derivative inhibitor and preparation method and application thereof: WO2018/157856A1[P/OL]. 2018-09-07[2024-03-04]. https:// patentscope2.wipo.int/search/zh/detail.jsf?docId=WO2018157856. [32] Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. Fused bicyclic compounds and uses thereof in medicine: WO2019/034096A1[P/OL]. 2019-02 21[2024-03-04]. https://patentscope2.wipo.int/search/zh/detail. jsf?docId=WO2019034096. [33] Tobiume K, Matsuzawa A, Takahashi T, et al. ASK1 is required for sustained activations of JNK/p38 MAP kinases and apoptosis[J]. EMBO Rep, 2001, 2(3): 222-228. [34] Tesch G H, Ma F Y, Nikolic-Paterson D J. ASK1: a new therapeutic target for kidney disease[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2016, 311(2): F373-F381. [35] Liles J T, Corkey B K, Notte G T, et al. ASK1 contributes to fibrosis and dysfunction in models of kidney disease[J]. J Clin Invest, 2018, 128(10): 4485-4500. [36] Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. Amide derivative and use thereof in medicine: WO2018/090869A1[P/OL]. 2018-05 24[2024-03-04]. https://patentscope2.wipo.int/search/zh/detail. jsf?docId=WO2018090869. [37] Hu X, Weng Z, Chu C T, et al. Peroxiredoxin-2 protects against 6-hydroxydopamine-induced dopaminergic neurodegeneration via attenuation of the apoptosis signal-regulating kinase (ASK1) signaling cascade[J]. J Neurosci, 2011, 31(1): 247-261. [38] Xin Z, Himmelbauer M K, Jones J H, et al. Discovery of CNS penetrant apoptosis signal-regulating kinase 1 (ASK1) inhibitors[J]. ACS Med Chem Lett, 2020, 11(4): 485-490. [39] Zhang Q S, Eaton G J, Diallo C, et al. Stress-Induced activation of apoptosis signal-regulating kinase 1 promotes osteoarthritis[J]. J Cell Physiol, 2016, 231(4): 944-953. [40] Fujisawa T, Takahashi M, Tsukamoto Y, et al. The ASK1-specific inhibitors K811 and K812 prolong survival in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis[J]. Hum Mol Genet, 2016, 25(2): 245-253. [41] Nygaard G, Di Paolo J A, Hammaker D, et al. Regulation and function of apoptosis signal-regulating kinase 1 in rheumatoid arthritis[J]. Biochem Pharmacol, 2018, 151: 282-290. DOI: 10.1016/ j.bcp.2018.01.041. [42] Swinnen D, Jorand-Lebrun C, Grippi-Vallotton T, et al. Preparation of triazolopyridine compounds and their use as ASK inhibitors: WO2009/027283A1[P/OL]. 2009-03-05[2024-03-04]. https:// patentscope2.wipo.int/search/zh/detail.jsf?docId=WO2009027283. [43] Hou S, Yang X, Yang Y, et al. Design, synthesis and biological evaluation of 1H-indazole derivatives as novel ASK1 inhibitors[J]. Eur J Med Chem, 2021, 220: 113482. DOI: 10.1016/ j.ejmech.2021.113482. 美编排版：陈鑫茹 感谢您阅读《药学进展》微信平台原创好文，也欢迎各位读者转载、引用。本文选自《药学进展》2025年第 2 期。 《药学进展》杂志由国家教育部主管、中国药科大学和中国药学会共同主办，中国科技核心期刊（中国科技论文统计源期刊）。刊物以反映药学科研领域的新方法、新成果、新进展、新趋势为宗旨，以综述、评述、行业发展报告为特色，以药学学科进展、技术进展、新药研发各环节技术信息为重点，是一本专注于医药科技前沿与产业动态的专业媒体。 《药学进展》注重内容策划、加强组稿约稿、深度挖掘、分析药学信息资源、在药学学科进展、科研思路方法、靶点机制探讨、新药研发报告、临床用药分析、国际医药前沿等方面初具特色；特别是医药信息内容以科学前沿与国家战略需求相合，更加突出前瞻性、权威性、时效性、新颖性、系统性、实战性。根据最新统计数据，刊物篇均下载率连续三年蝉联我国医药期刊榜首，复合影响因子1.216，具有较高的影响力。 《药学进展》编委会由国家重大专项化学药总师陈凯先院士担任主编，编委由新药研发技术链政府监管部门、高校科研院所、制药企业、临床医院、CRO、金融资本及知识产权相关机构近两百位极具影响力的专家组成。 联系《药学进展》↓↓↓ 编辑部官网：pps.cpu.edu.cn； 邮箱：yxjz@163.com； 电话：025-83271227。 欢迎投稿、订阅！ 往期推荐 “兴药为民·2023生物医药创新融合发展大会”盛大启幕！院士专家齐聚杭城，绘就生物医药前沿赛道新蓝图“兴药强刊”青年学者论坛暨《药学进展》第二届青年编委会议成功召开“兴药为民·2023生物医药创新融合发展大会”路演专场圆满收官！校企合作新旅程已启航 我知道你在看哟

摘要:疫苗几个世纪以来一直是预防多种传染病的有效方法。另一方面，癌症疫苗（CVs）可以被定义为一种免疫疗法，它指导我们的免疫系统区分我们体内的癌细胞和健康细胞，并消除癌细胞。CVs的主要目标是帮助治疗某些类型的癌症或减少治疗后癌症的复发。例如，Sipuleucel-T用于治疗和管理晚期前列腺癌（PC）。然而，也有一些疫苗可以预防某些类型的癌症。例如，为即将进入青春期的女孩和某些年轻人接种人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗有助于预防宫颈癌和由HPV引起的其他五种重要类型的癌症。然而，大多数癌症的病因并不表明有传染性因子的参与，因此疫苗在预防它们方面的作用值得怀疑。尽管如此，全球目前正在进行多项临床试验，以找到适合的答案。“Lynch疫苗试验”就是其中之一，旨在确定疫苗是否可以有效地用于预防非病原体形式的癌症。此外，研究人员还在研究其他几个重要的策略。本章将讨论各种类型的CVs，它们假定的作用机制，与使用它们相关的药物不良反应，CVs的重要靶点，以及不同临床试验阶段的CVs。 1.引言 癌症疫苗（CV）的概念自20世纪50年代以来从一个假设演变成了一个真实性，它以其在对抗和管理包括手术、化疗、放疗和单克隆抗体（Abs）在内的多种癌症形式的现有方法上的日益巨大的潜力，吸引了癌症研究者的极大兴趣。这是因为，从概念上讲，它只需一次性或短时间内给予就能促进免疫力，就像目前针对细菌和病毒感染的疫苗接种计划一样，具有最小的破坏能力和在个体一生中加强癌症预防的能力。肿瘤学中免疫学的两个关键应用是免疫预防和免疫治疗。免疫预防使用免疫技术，主要是疫苗，来引发免疫反应，以防止宿主发展成癌症状况和肿瘤生长。免疫治疗涉及给予癌症患者的免疫程序，以努力根除已经存在的肿瘤细胞。免疫预防和免疫治疗的控制原则、实际应用和免疫学过程之间的对比已在许多癌症免疫预防研究中得到强调。疫苗是癌症预防策略之一。显然，用于对抗致癌病毒如乙型肝炎病毒和人类乳头瘤病毒（HPV）的疫苗在预防初始感染方面非常成功，因此显著降低了由这些病毒引起的癌症发展的机会。然而，大多数恶性肿瘤缺乏传染性起源，因此需要考虑替代目标作为预防性疫苗的可行抗原。由于大多数肿瘤抗原由自身分子组成，对它们产生强烈的免疫反应，人们认为它们违反了耐受自身细胞的规则，并增加了发展自身免疫的可能性。因此，开发CVs的大多数尝试都集中在生产针对转移性癌症的疫苗上，因为对于这类癌症，与目标抗原选择相关的风险已经得到了充分管理。已经一致证明，Abs是传统癌症免疫治疗的基石，而不是细胞毒性T细胞。这是因为Abs在介导用于预防癌症发生的疫苗的持久效果方面更为重要。图1.1描绘了CVs可能针对的不同分子靶点，以对抗不同形式的癌症。在当今世界，通过使用疫苗可以预防和治疗肿瘤状况。现在有三类CVs，包括预防性、治疗性和个性化疫苗。虽然疫苗针对癌细胞，但预防性疫苗可以保护患者免受致癌病毒或与癌症密切相关的病毒的侵害。尽管治疗性疫苗用于治疗患有不同形式癌症的持续状况的人，但包括HPV疫苗在内的预防性疫苗主要设计用于避免癌症类型的发生，并已发现在预防它们的传播方面也有效。FDA目前已在美国批准了三种治疗性疫苗和四种预防性疫苗的使用。 图 1.1 癌症疫苗主要针对的不同途径。 本章将详细描述针对多种癌症的不同类别疫苗，并重点关注这些疫苗的目标机制。此外，还将讨论最近批准的疫苗以及针对这些疫苗的各种临床前和临床试验。本章还将探索简要的机制方法。此外，本章将讨论与这些疫苗及其实施相关的不良反应（ADRs）和挑战。图1.1展示了设计癌症疫苗（CV）时可以考虑的各种途径。抗原呈递细胞（APC）在识别和呈递肿瘤抗原方面发挥着关键作用。随后，它们迁移到淋巴结，在那里激活原始T细胞，启动不同的信号通路。Fas配体的激活导致穿孔素和颗粒酶的释放，促进记忆和效应T细胞从淋巴结移动到肿瘤部位。这些细胞针对肿瘤抗原并消除肿瘤细胞。淋巴结中的原始T细胞释放白细胞介素-2、肿瘤坏死因子（TNF）和干扰素-γ，它们对肿瘤细胞产生影响。这导致肿瘤细胞的凋亡或坏死，从而释放肿瘤抗原。APC在区分和呈递细胞表面的肿瘤抗原方面发挥着关键作用。CVs的机制主要围绕肿瘤抗原的识别。在淋巴结中，原始T细胞在遇到APC时被重新激活。然后这些APC通过淋巴管迁移到外周淋巴结。 2.癌症疫苗类型 预防性、治疗性和个性化疫苗是抗癌疫苗可以被分类的三个类别。个性化疫苗由“目标”疫苗抗原组成，旨在实现特定结果。这种方法旨在增强免疫细胞反应，同时减少疫苗不遵从和不良反应的可能性，特别是在存在预先存在的严重疾病或其他状况的高风险个体中。治疗性疫苗用于治疗癌症患者，而预防性疫苗，如HPV疫苗，用于预防癌症的发生。 2.1.预防性癌症疫苗 抗癌疫苗的主要类别是预防性的，旨在阻止癌症在体内进一步发展。所有目前在临床试验中使用的经许可的预防性抗癌疫苗都集中在已知会导致癌症的致癌病毒上。2006年，HPV免疫疫苗之一的Gardasil最初获得了FDA的批准。建议用于9至26岁的女性，以预防最常见的女性癌症形式之一——宫颈癌的发生。这种疫苗还被提议有效地预防几种其他HPV相关疾病，如阴道、外阴、肛门和口腔癌症。Gardasil针对特定的HPV亚型（6、11、16和18），这些亚型约占全球宫颈癌发生的70%。与针对许多HPV介导癌症有效的Sipuleucel-T疫苗不同，HPV疫苗主要依赖于诱导免疫反应以预防HPV的初次感染。根据第三阶段临床研究的数据，接种了3剂HPV疫苗的女性在超过90%的HPV 16或18型引起的感染中受到保护。尽管疫苗不能提供对所有情况的完全保护，但宫颈筛查仍然是识别和诊断宫颈癌的重要手段。此外，由于HPV疫苗最近才在临床环境中提供，关于其长期效果和安全性的问题，以及男性是否也应该接种的争议尚未完全解决。美国疾病控制和预防中心（CDC）最近推荐将Gardasil加入免疫接种计划。另一种预防性疫苗是乙型肝炎病毒（HBV）注射，它提供针对乙型肝炎病毒引起的慢性感染的保护。这种病毒显著增加了肝细胞癌（HCC），一种常见的肝癌形式的风险。与HPV疫苗类似，HBV疫苗通过触发抗体反应来预防初始HBV感染。目前世界上许多国家都将HBV疫苗纳入其儿童或青少年疫苗接种计划。研究表明，HBV疫苗的3剂接种可以显著降低慢性HBV感染的发生率，特别是在风险较高的个体中。 2.2.治疗性癌症疫苗 我们对免疫反应及其在肿瘤学中的作用的理解迅速进步，为利用患者免疫系统的训练目标、攻击和消除癌细胞的治疗性疫苗创造了机会。这种创新的疫苗方法涉及激活和适当功能的T淋巴细胞和抗原呈递细胞（APCs），包括树突状细胞（DCs）。在细胞介导防御的背景下，CD4+ T淋巴细胞分泌细胞因子，刺激CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTLs），也称为CTLs，攻击癌细胞。免疫反应可以针对两种不同类型的肿瘤抗原：肿瘤特异性抗原（TSAs）和肿瘤相关抗原（TAAs）。TSAs是仅在肿瘤细胞上发现的抗原，而TAAs是在宿主的肿瘤细胞和正常细胞上广泛表达的抗原。与TAAs相比，TSAs的优势在于它们是针对特定肿瘤定制的，并且通常能引发更强的免疫反应。然而，TSAs极其罕见，它们在特定肿瘤中的识别通常是开发专门针对TSAs的抗癌疫苗的主要障碍。另一方面，TAAs出现的频率更高，尽管通常比TSAs引起的免疫反应要小。针对TAAs的抗癌疫苗可能会引起自身免疫反应。当GM-CSF作为辅助共刺激剂给药时，DCs通过PBMC的帮助吸收PAP，并将其转化为细胞表面的MHC主要组织相容性复合体。这使得DCs能被特定的CTLs识别。这些特定的CTLs可以繁殖，创建一个对PAP有抵抗力的CTLs库，在自我激活后。患者随后接受由这些CTLs制成的sipuleucel-T疫苗。每种疫苗都是针对患者的自体疫苗，提供了防止HLA形成不匹配的关键好处，从而避免了与组织移植相关的重大问题。尽管两组之间肿瘤生长的时间没有明显变化，但第三阶段随机对照试验（IMPACT）已成功证明，接受sipuleucel-T治疗的m-CRPC参与者的生存率高于安慰剂对照组。 2.3.个性化癌症疫苗 在疫苗方面，个性化指的是针对疫苗抗原的目标，以实现在增加免疫细胞反应和减少高风险患者不良事件（AEs）的可能性方面的最佳结果。在免疫目标的背景下，个性化旨在实现改善的结果。疫苗的个性化可以与个体水平相关，其中理解基因分型-x的存在以及单倍群-y可能会阻碍保护性免疫的发展或表明对严重不良反应的更高风险。研究免疫遗传多态性如何影响先天免疫系统、细胞介导反应和由先天系统介导的抗体反应对疫苗接种的多样性的科学被称为疫苗组学（图1.2）。如图1.2所示，对T细胞及其在HLA系统内识别致病性抗原（肽）的能力进行全面研究，激发了个性化疫苗的概念。这些个性化疫苗是通过利用患者自己的免疫细胞制成的，然后在实验室环境中暴露于癌细胞的内容。一旦准备就绪，疫苗通过注射给药以刺激更强大的免疫反应。一旦实现T细胞启动，个性化抗癌疫苗的生产就变得可行。在淋巴结中，癌细胞、死亡细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、IFN-gamma和IL-2在T细胞迁移过程中存在并释放。这种IFN-gamma和IL-2与癌细胞的结合导致它们的破坏。T细胞启动和迁移的过程在淋巴结中观察到。个性化疫苗通过捕获抗原靶向INF-gamma和TNF-alpha途径。 图 1.2 个性化抗癌疫苗的重要分子靶标。 人类基因组计划和全球Hap-Map的初始阶段已经成功完成，这促进了疫苗组学和个性化疫苗研究的进步。对生物制剂（如疫苗）的免疫反应可能因关键免疫反应基因的多态性而异的理解最近已经出现。因此，我们预计免疫和不良反应疫苗可以预测、测量并用于指导临床实践，导致更有效和针对性的疫苗开发过程。为了实现这一点，需要一个充满表型-基因型数据的验证数据库、负担得起且准确的测序技术，以及用于数据评估和解释的生物信息学和统计工具。个性化疫苗领域主要由对改善患者层面结果（如免疫原性、降低副作用风险和节省成本）的渴望驱动，尽管它依赖于实验室方法。对T细胞如何在人类白细胞抗原（HLA）系统中检测有害肽的理解对个性化治疗的概念产生了重大影响。图1.2提供了个性化CVs工作机制的简要概述。人类基因组由大约1000个人类白细胞抗原-A或B等位基因组成，导致等位基因变异，为人类白细胞抗原复合体的复杂性做出贡献，这是最多态性的基因组。HLA区域被认为对疫苗接种的免疫反应范围和对病原体的遗传易感性有重大影响。例如，当前的（非个性化的）MMR疫苗受到多种因素的限制，包括母体Abs的干扰、疫苗失败以及无法向免疫受损个体接种疫苗。正在进行广泛的研究以支持开发新疫苗以克服这些限制。一个潜在的解决方案是使用由蛋白质或肽组成的定制疫苗。事实上，来自世界各地的研究人员已经鉴定出13个免疫原性麻疹肽，这些肽可以用于开发第二代疫苗。这些肽被选为克服HLA多态性带来的挑战。此外，研究表明，麻疹肽在体外对个体进行给药时是免疫原性的。 3.癌症疫苗的作用机制 用于癌症的疫苗展示了激活免疫反应信号传导途径的抗肿瘤生成效应，包括针对干扰素相关信号传导途径、TLRs、NF-κB和NLRP3。 3.1.针对IFN相关信号传导途径 文献支持任何具有显著IFN介导免疫调节的细胞因子都具有抗肿瘤特性。干扰素（IFN）途径在人类免疫反应中扮演着关键角色。在疾病爆发后，身体启动了一系列复杂的自然和适应性免疫反应的调节机制，旨在对抗感染。产生干扰素（IFN），这种多效性细胞因子，是对病毒入侵的多种反应之一。IFN基因诱导增加了细胞对病毒感染的抵抗力，并可能影响细胞分裂。IFN被用于治疗多发性硬化症、多种癌症、乙型和丙型肝炎以及单纯疱疹感染等。在IFN研究中，我们提供了一系列产品，包括酪氨酸激酶-2（Tyk-2）和IFNR-1亚基、JAK1和IFNR2。JAK1和JAK2分别与IFN-R1和IFN-R2亚基相关。配体结合后，1型和2型受体激活导致受体亚基重组和二聚化，通过自磷酸化激活相关的JAKs，并进一步激活STAT蛋白。在被磷酸化后，激活的STAT组装成同二聚体并转移到细胞核，启动IFN刺激的基因转录。由STAT1、STAT2和IRF9组成的ISGF3复合体也可以由1型IFN形成。ISGF-3（ISG因子-3）复合体是另一个被1型IFN显著激活的转录复合体。ISGF3复合体结合ISREs，进一步刺激其启动子中包含ISREs的IFN刺激基因的转录。IFN-γ与IFN-γ受体结合，导致STAT1在Tyr-701位置发生酪氨酸磷酸化。这种Tyr701的磷酸化导致STAT1同二聚体的形成，然后转移到细胞核并结合GAS元件。还表明IFN信号控制MAPK途径。激活的JAKs磷酸化鸟嘌呤核苷酸交换因子Vav，导致下游的Rac1激活。Rac1进一步被MEKK1（MAP3K1）激活，该因子磷酸化MAP2K3和MAP2K6，最终导致p38MAPK（MAPK14）的磷酸化。此外，PI3K通过激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白，即m-TOR，刺激翻译过程。 3.2.针对TLR相关信号传导途径 这种模式识别受体（PRR）也与疫苗用于抗癌治疗的典型策略有关：TLR靶向。根据Mesa等人的研究，VSSP激活DCs上的4型Toll样受体（TLR），有效地引发T1细胞介导的免疫反应。在这项研究中，VSSP还在脂多糖（LPS）反应低下的小鼠中激活DCs，表明其他VSSP成分也可能促进免疫。此外，VSSP执行与LPS类似的功能，同时比MPL-A更安全，对人类的影响更好。因此，使用VSSP作为DC激活剂可能是实用的。VSSP增强免疫反应的能力表明，它可以作为疫苗中的添加剂。根据Torréns等人的研究，HPV 16型的E-7癌蛋白和VSSP疫苗已被证明可以保护小鼠免受肿瘤形成，诱导现有肿瘤的缩小，并激活CD8+ T淋巴细胞。ERK途径被认为是阳离子脂质DOTAP（1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷）作为增强剂并刺激DCs的机制。当用作疫苗佐剂时，与HPV-16 E7衍生肽结合的最高剂量的DOTAP阻止了TC-1肿瘤的发展。与S-DOTAP相比，R-DOTAP被认为是更有效的辅料，用于刺激CD8+ T细胞产生干扰素-γ（IFN-γ）以对抗癌症。肿瘤回归是（R）-DOTAP佐剂机制的最终结果，该机制针对TLR7和TLR9产生Myd88依赖的1型IFN。张等人还鉴定了一组类似于阳离子脂质的物质。他们发现，具有12碳尾的C-1脂质纳米颗粒（LNP）有效地将编码抗原的信使核糖核酸（mRNA）传递给DCs。C-1 LNP在传递信使RNA时被DCs上的TLR-4刺激，诱导免疫反应。 3.3.针对NF-κB（核因子κB）相关信号传导途径 上游IκB激酶IKK、抑制剂IκB和二聚体转录因子NF-κB/Rel构成了NF-κB信号传导途径。IκB被激活的IKK磷酸化，被IκB降解，随后NF-κB转移到细胞核以调节基因表达。这个信号系统与恶性肿瘤和炎症密切相关。此外，特定纳米形式的添加剂在癌症疫苗中的作用与这个信号传导途径有关。这个途径与激活CCR7、促进DC成熟和DC摄取LDH有关。LDH纳米材料，如纳米颗粒（NPs）或纳米片，用作CVs中的佐剂，显著阻碍肿瘤生长。Chattopadhyay等人设计的NPs用于将肿瘤溶解物传递给巨噬细胞。随后，TNF被释放，激活NF-κB信号传导途径，并在体外和体内产生抗肿瘤效应。这种佐剂在其他肿瘤模型中的应用可能在未来的研究中被探索。苏等人开发了一种使用超分子抗原表位共轭肽（称为ECPs）的共组装水凝胶疫苗，这些肽靶向CD8或CD4 T细胞受体（TCRs）。共组装肽水凝胶疫苗在E.G7-OVA肿瘤模型中显示出更强的抗癌影响，因为它有效地激活了DCs中的MyD88依赖的NF-κB信号传导途径。 3.4.治疗性疫苗的作用机制 由于与过继T细胞转移相比效率不高，癌症疫苗（CVs）的功效一直被忽视。然而，观察到肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）的治疗有效性受到移植T淋巴细胞的表位敏感性的影响，有时发现TILs数量增加。近期研究表明，TILs通常针对新抗原而非大多数针对非病毒恶性肿瘤的治疗性疫苗所针对的常见抗原。实际上，针对黑素细胞分化抗原的持续CTL克隆在诱导患者黑色素瘤显著消退方面是不足够的。针对免疫原性CD-4+ Th和CD-8+ CTL同源体反映新抗原的个性化免疫接种可能有很强的潜力改善症状，如SLP疫苗在实验动物中所证明的。通过创新方法快速评估癌症外显子序列，可以解决定制疫苗生产带来的新的物流和监管挑战。不显著重组癌症微环境就要求癌症疫苗的有效性是不合理的。有必要建立一个工作机制，使疫苗能够有效激活血液中的效应T细胞和记忆T细胞群体，并且这些细胞迁移到癌症区域并参与肿瘤抑制活动。因此，需要额外的干预措施。例如，针对具有类似沙利度胺和其他已知能减少免疫抑制性Treg和/或MDSC群体的常见化疗药物，而不影响效应和记忆T细胞数量。值得注意的是，这种消耗为免疫疗法创造了一个理想的环境，如同时进行的治疗性疫苗接种，以取得更好的结果。化疗免疫疗法增强肿瘤根除的另一种方式是通过顺铂减少癌性或肿瘤细胞的凋亡能力，这是由疫苗诱导的肿瘤内T细胞释放的。在治疗性免疫接种中加入检查点阻断药物是另一种可行的联合疗法选择，并在临床前模型中显示出有希望的结果。图1.3简要概述了治疗性CVs通过影响肿瘤微环境（TME）增强免疫力的机制。图1.3显示了疫苗给药的途径和免疫细胞的迁移，这可以通过皮下（S.C.）给药或分发到富含DC的淋巴结来实现。这些方法已被证明非常有效。除了电穿孔，肌肉内注射也已成功用于传递DNA疫苗。治疗性疫苗采用复杂的疫苗配方，将目标抗原传递给DCs并刺激它们的活性。这导致CD4+和CD8+ T细胞的激活。为了产生和维持CD8+记忆细胞，以及实现最强大和最持久的免疫反应，需要效应CD8+ T细胞的活性。载有抗原的DCs通过传入淋巴被运送到淋巴结，在那里它们激活淋巴细胞。经过启动和激活的T淋巴细胞通过血液、胸导管和传出淋巴等途径到达肿瘤组织。在黑色素瘤的背景下，像Tregs和MDSCs这样的免疫抑制细胞，以及肿瘤细胞产生的IDO、巨噬细胞和免疫抑制性趋化因子，阻碍了T细胞的运动和增长。克服这些敌对因素对于T细胞免疫接种的有效性至关重要。 图 1.3 通常展示的治疗性癌症疫苗的主要作用机制。 3.5.个性化新抗原肽疫苗 CD8+细胞毒性T细胞（Tc细胞）在抗肿瘤免疫中的功能已经得到了广泛的研究。然而，近期研究强调了CD4+ Th细胞的不足，这阻碍了CTL的反应，并强调了它们的重要作用。通过CD40-CD40L相互作用，CD4+ Th细胞可以激活DCs并增强对CTLs的抗原呈递，使其更有效。与它们通常通过细胞因子产生在免疫反应中的作用不同，CD4+ T细胞表现出细胞毒性特征，即使在没有MHC-I限制的CD8+ T细胞反应的情况下，也能直接消除肿瘤。有趣的是，已经有人提出CD4+ T细胞在小鼠中检测到大量免疫刺激性突变组，强调了在抗肿瘤免疫中纳入CD4+ T细胞反应的重要性，特别是在个性化新抗原疫苗的背景下。值得注意的是，近期关于新抗原疫苗的临床研究也观察到了显著的CD4+ T细胞反应，使用MHC-1结合预测方法。与合成长肽（SLPs）相比，短肽被发现能更快速地激活CD8+ T淋巴细胞，因为它们可以在疫苗接种后直接呈现在MHC-I分子上，绕过细胞摄取和内部处理阶段。然而，短肽与SLPs相比更高的信号转导效率只有在免疫接种后的早期阶段观察到，因为SLPs的穿透能力（在图1.4中解释）导致随着时间的推移这种趋势的逆转。这表明，在单个APC（抗原呈递细胞）上传递双重标记而不是两个独立的APC提供了一个更优的方法来发展抗肿瘤免疫。 如图1.4所示，经典的抗原呈递途径包括MHC类I分子，它们向CD8+淋巴细胞呈递内源性抗原，以及MHC类II分子，它们向CD4+ T细胞呈递外源性抗原。在这个过程中，从患者那里获得健康组织基因组、参考基因组和肿瘤基因组等基因组变体。从这些基因组衍生的短肽被用来刺激特异性识别抗原的CD8+ T细胞。这些肽在注射后直接与附近DCs表达的MHC类I分子结合，形成MHC类I-肽复合物。MHC分子装载来自癌细胞RNA转录的新抗原肽。新抗原肽与MHC类I分子结合，T细胞可以通过交叉呈递被激活，导致各种细胞和体液反应。这种个性化新抗原肽疫苗在抗癌免疫反应中发挥着关键作用。 图 1.4 个性化新抗原肽疫苗最常见的工作流程。 交叉呈递使CD8+ T细胞能够通过DCs激活，通过将外来抗原与MHC类I分子结合。T细胞可以通过交叉呈递以多种方式被刺激，这协调了不同的细胞和体液反应，促进了抗肿瘤免疫反应的发展。注射后，短肽产生直接与局部DCs表达的MHC-I分子结合的MHC类I肽复合物，从而刺激特异性识别抗原的CD8+ T淋巴细胞。虽然在成熟DCs表面观察到MHC类I-肽复合物，但它们表现出持续的波动。24小时后，大多数MHC类I-肽复合物在成熟DCs的细胞表面很少被检测到，而形成了MHC类II-肽复合物。为了及时清除异常组织细胞和病原体，MHC-I分子不断呈递来自细胞质的配体，包括新合成的错误折叠蛋白或病毒蛋白。因此，短肽疫苗有有限的抗原呈递窗口，这被认为是其显著功效的贡献因素。然而，SLP MHC-I分子已被证明可以持续至少3天的抗原呈递，并引发更强的抗肿瘤反应。进一步的研究表明，需要细胞内内吞和处理以释放MHC-I配体的抗原（如SLPs）可以在DCs内储存数天。这确保了抗原的持续供应，并允许大量的细胞外MHC类I-肽相互作用，从而延长了DCs的抗原桥接。这些储存器官被描述为类似溶酶体的细胞器。 4.癌症疫苗使用中报告的常见不良反应 开发任何形式的癌症治疗疫苗的障碍既有财务性质的，也有科学性质的。与CVs使用相关的一个主要缺点是不良反应的普遍性。肿瘤细胞适应变化微环境的能力是肿瘤细胞的一个关键特征。免疫系统必须克服这些肿瘤细胞才能在体内生存和扩散，这些通常是公认的抗癌免疫疗法方法。TME富含免疫系统抑制剂，如Tregs，可能阻碍对抗癌疫苗的免疫反应。 疫苗接种后观察到的不良反应，特别是与表1.1中概述的疫苗缺点有关。一个主要关注点是因肿瘤相关抗原（TAAs）而潜在发展自身免疫。例如，接受黑色素瘤疫苗的个体报告经历了白癜风，这是一种以皮肤色素丧失斑块为特征的疾病。这被认为是由于疫苗在靶向TAAs时缺乏特异性的副作用。另一个重要问题是包含用于增强疫苗免疫作用的辅料。佐剂对疫苗效果至关重要，但在它们期望的影响和潜在有害影响之间必须保持微妙的平衡。目前，某些抗癌疫苗佐剂已获批准用于医疗用途，包括称为铝盐的明矾，以及称为MPL的单磷酸脂A型，它是以油包水乳液形式准备的，称为MF-59。当MPL和明矾结合时，被称为AS04。明矾和油包水乳液都向宿主免疫系统传递疫苗抗原，同时控制其释放。然而，它们也可能激活先天免疫系统，导致慢性炎症，可能加剧细胞介导的或全身性免疫反应。MPL由Toll样受体4（TLR-4）产生，这是一种PRR，能够识别病原体相关分子模式（PAMPs）和LPSs。AS04已被授权用作Cervarix和Fendrix的添加剂，这两种HBV疫苗（一种HPV疫苗）。 5.癌症疫苗的重要抗原靶标 预防策略有几个层面。通常，一级预防专注于预防疾病的发生，可能涉及筛查健康个体。它还专注于预防继发性癌症的复发，如对侧乳腺癌，或早期发现和治疗非恶性的初始癌症。最后，三级预防涉及管理治疗后的患者，以防止疾病复发。根据疫苗接种的阶段，目标抗原会有所变化。因此，可以看到针对所有预防水平的癌症预防疫苗（CPV）的众多临床试验。表1.2列出了针对不同类型癌症疫苗的不同目标抗原在不同临床测试中的情况。 5.1.肿瘤相关抗原（TAAs） TAAs是一类在癌细胞中或多或少频繁产生或在组织分化中发挥作用的抗原形式，如Muc-1。通常在生殖细胞中表达的癌症-睾丸抗原（CTAs），包括胎儿细胞、卵巢、睾丸和合体滋养层细胞，也属于这一类。它们在其他健康组织中的表达极少。由于生殖细胞缺乏HLA-I分子，并在各种肿瘤形式中异位产生，免疫系统将这些抗原识别为外来物质。 5.2.癌症-睾丸抗原 疫苗最常针对的黑色素瘤蛋白家族之一是CTA。一种名为NY-ESO-one的肽段作为黑色素瘤的抗原。PRAME与其他恶性肿瘤一样，在卵巢、恶性黑色素瘤、骨髓增生异常综合征和各种骨肉瘤中高度表达。在非小细胞肺癌和转移性黑色素瘤患者中，重组PRAME蛋白与免疫刺激剂AS15联合使用，产生相关的抗体和CD-4+免疫反应。由于其在自发体液免疫反应中表现出的显著性，NY-ESO-one，一种在精子细胞和胎盘细胞中表达有限且在多种恶性肿瘤中重新表达的组分，被广泛用于各种癌症免疫治疗策略。几项对照试验已证明这种疫苗能产生特定的CD-4+和CD-8+反应。 5.3.肿瘤特异性抗原（TSAs）及相关新抗原 由于下一代测序技术，即NGS技术的发展，以及分子生物学的整体进步，个性化医疗的兴趣正在迅速上升。个性化新抗原疫苗方法的标准方法包括获得基因分型。下一步是通过为每个患者特别设计的计算机模型评估或预测新抗原，同时考虑他们的HLA单倍型。可以开发针对高度特异性于恶性肿瘤的新抗原或新表位的个性化疫苗。新抗原在早期癌前病变中出现的可能性支持了预防性疫苗的可能性，这些癌前病变可能发展成肿瘤，尽管它们在癌前病变中的出现数量比在恶性肿瘤中少。 6.临床试验不同阶段的癌症疫苗 与任何形式的癌症疫苗相关的主要挑战是其高昂的成本，使其对国家卫生服务来说无法负担。此外，临床试验仅显示了在生存率上的微小改善，与安慰剂相比平均延长了大约四个月。这种有限的好处可能归因于在人类试验中未被识别的预测因素。Provenge的制造商Dendreon被迫申请第11章破产，疫苗此后被valeant制药公司收购。STAND随机第2阶段试验在24个月内评估了各种反应，包括体液和细胞反应，证明了Provenge在刺激前列腺癌（PC）患者的强烈免疫反应方面的有效性。然而，目前关于治疗的整体有效性的数据不足，使得sipuleucel-T奥德赛成为一个正在进行的工作。表1.3提供了不同阶段临床试验中针对不同类型癌症的CVs的概述，其中大多数仍处于最初的招募阶段。 7.结论 建立预防性癌症疫苗（CVs）的道路充满了障碍。主要障碍包括癌细胞对免疫系统的抑制作用。然而，研究人员正试图利用几种佐剂来解决这一问题。此外，由于癌细胞是从个体自身的体细胞发展而来，它们常常被免疫细胞忽视。此外，某些形式的癌症治疗可能会削弱个体的免疫系统，限制疫苗的有效性。尽管存在这些挑战，一些研究者认为，用疫苗治疗和管理不同类型的癌症可能对小肿瘤或早期癌症更有效。尽管与CVs的概念和策略相关的众多缺点，当前研究表明，接种这种方法可能对癌症预防是可行的。在动物模型中的成功为这一领域的临床发展提供了一个有希望的模型。FDA最近批准了三种治疗性疫苗和四种预防性疫苗在美国使用。临床试验对于进一步理解癌症免疫疗法至关重要，无论是在治疗还是预防背景下。研究人员目前正在测试多种癌症的免疫接种，特别是基于NY-ESO-1的结肠癌（CC）免疫接种，以及MUC1、CEA和鸟苷酸环化酶C。医生可以为转移性前列腺癌（PC）患者接种sipuleucel-T疫苗。最近的进步促进了各种类型CVs的发展。本章讨论的许多策略似乎对未来的进展是可行的，并且可能从最近和改进的工程解决方案中获得额外的洞见，这些解决方案结合了不同的方法。例如，针对并增强宿主对预防性抗癌疫苗的适应性免疫系统反应对于成功实施有效的预防性癌症疫苗至关重要。因此，有显著的潜力和乐观态度认为，将开发出更多类型的此类疫苗，并在不久的将来广泛实施以预防各种形式的癌症。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。