RALA

1982年，RAS基因家族中的HRAS和KRAS被发现，成为首批人类癌症基因，其中KRAS后来被确定为最常发生突变的癌基因之一。然而，研发出针对RAS突变癌症的临床有效抑制剂却耗费了近40年时间。2013年，Shokat及其同事发现了KRAS上一个可成药口袋，这为2021年和2022年美国FDA分别批准首款共价结合的KRAS G12C抑制剂索托雷塞（sotorasib）和阿达格拉西布（adagrasib）铺平了道路。然而，这一里程碑并非标志着癌症研究“珠峰”攻坚战的成功收官，反而揭示了RAS药物研发中的新挑战。在这篇综述中，研究者重点阐述了在明确耐药机制以及制定联合治疗策略以提高患者对KRAS疗法反应方面所取得的进展。  经过近40年开发临床可用的KRAS抑制剂的努力，Kevan Shokat团队发现了首款靶向KRAS G12C的突变选择性抑制剂。这一突破重新燃起了将KRAS作为药物靶点的研究热情，最终促成了首款突变选择性KRAS抑制剂获得美国FDA的批准； 尽管患者最初对KRAS G12C抑制剂反应良好，但大多数患者仍出现了耐药性和疾病进展； 众多涉及KRAS抑制剂的联合疗法正在临床试验中，旨在克服治疗耐药性。此外，其他突变特异性抑制剂（如KRAS G12D抑制剂），以及泛KRAS抑制剂或RAS（ON）多选择性抑制剂也正在进入临床试验，并展现出有前景的结果； 随着RAS抑制剂数量的不断增加，携带KRAS突变的患者距离有效的靶向治疗越来越近。 RAS致癌基因作为“不可成药”癌症靶点的兴起 1982年，HRAS和KRAS作为首批人类癌症基因被发现，标志着癌症研究新时代的开端。从那时起，由HRAS、NRAS和KRAS组成的RAS基因家族，被确定为癌症中最重要的癌基因家族之一。在所有RAS基因中，KRAS是突变最为频繁的，约占所有RAS突变的80%。值得注意的是，RAS突变具有显著的组织特异性，最常见且致命的癌症类型，如结直肠癌（CRC）、胰腺导管腺癌（PDAC）和非小细胞肺癌（NSCLC），都与KRAS突变密切相关（分别为43%、85%和31%）（图1A）。相比之下，HRAS突变常见于皮肤癌（不包括黑色素瘤）（6%）、膀胱癌（5%）和头颈癌（7%），而NRAS突变在黑色素瘤（23%）、甲状腺癌（11%）和白血病（9%）中较为突出（图1B）。RAS蛋白是致癌信号通路的关键调节因子，包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3 - 激酶（PI3K）通路。RAS下游效应因子（Box 1）中频繁出现的致癌驱动突变进一步突显了这一点，这些效应因子包括癌蛋白，如BRAF（8%）、AKT1/2（4%）、MEK1/2（2%）和PIK3CA（13%），所有这些突变都会导致蛋白持续激活，从而促进肿瘤生长和存活。RAS蛋白及RAS下游效应因子在癌症驱动过程中的重要作用，促使人们积极寻找有效的RAS抑制剂。 图1 RAS信号通路： RAS蛋白属于小GTP酶家族，在细胞内充当分子开关，在无活性的结合GDP状态和有活性的结合GTP状态之间转换。RAS开关的激活状态由活性受体酪氨酸激酶（RTKs）调节。这些受体酪氨酸激酶募集鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs），其促进GDP交换为更丰富的GTP，从而开启RAS。为了关闭RAS，GTP酶激活蛋白（GAPs）与RAS结合，并加速GTP水解为GDP。RAS中的致癌突变导致RAS主要处于结合GTP的状态。 图I 在其活性的GTP结合状态下，RAS会将含有RAS结合结构域（RBD）的效应蛋白招募至质膜。这种由RAS介导的质膜定位提高了效应蛋白的局部浓度，从而使其激活。主要的效应蛋白包括RAF、PI3K、RAL、RASSF和TIAM，它们激活不同的下游通路，参与诸如增殖、分化、存活和内吞等过程（图I）。 早期，利用细胞培养和小鼠模型进行的实验研究证实，突变的RAS是癌症发生和发展的关键驱动因素，进一步验证了它作为理想癌症靶点的地位。然而，RAS蛋白的三级结构显示，其表面缺乏深的疏水口袋，这限制了设计高效且选择性的小分子抑制剂的可能性。此外，RAS对GTP具有极高的皮摩尔亲和力，同时细胞内GTP浓度较高（约500 μM），与激酶相比，针对RAS的靶向难度显著增加，因为激酶与ATP的结合亲和力为微摩尔级别，且细胞内ATP浓度处于毫摩尔范围。这导致了长期以来人们认为RAS是“不可成药”的观点。因此，早期针对RAS的策略主要是间接的。第一个且最具前景的方法是开发法尼基转移酶抑制剂（FTIs），以破坏RAS在质膜的定位，而这对于RAS在信号转导中发挥功能至关重要。由于RAS异构体存在意想不到的差异，FTIs在临床试验（NCT00100750、NCT00005989和NCT00005648）中遭遇惨败，其中KRAS和NRAS能够通过替代的异戊二烯化逃避FTIs的作用，而HRAS则不能。这次失败堪称KRAS研究历程中最黑暗的时刻之一。随后，研究工作将重点转向靶向KRAS效应信号通路，特别是RAF - MEK - ERK MAPK通路，这促使针对该级联反应每个层面开发出多种抑制剂。然而，MAPK通路抑制剂在KRAS驱动的癌症中疗效有限，这主要归因于意想不到的动态反馈机制以及对正常组织的显著毒性。 在这篇综述中，研究者总结了从首款KRAS G12C抑制剂的开发到FDA批准靶向KRAS治疗的开创性历程，近40年来，RAS突变首次被确定为人类致癌基因。研究者探讨了KRAS抑制剂目前在临床应用中的影响及进展，阐述了治疗耐药性这一长期存在的挑战，并回顾了正在进行的旨在提高对KRAS抑制剂的敏感性或克服耐药性的联合疗法的临床评估情况。 KRAS G12C抑制剂的开发 最初一些研究结果开始推翻RAS是不可成药蛋白这一观点，其中涉及到Kobe 0065和SML - 8731的发现。Kobe 0065抑制HRAS与效应蛋白中RAS结合域的结合，而据报道SML - 8731可与KRAS G12C的核苷酸结合域相结合。然而，这些小分子都未能进入临床评估阶段。 2013年，Shokat、Wells及其同事报告了具有开创性的研究成果，最终为成功铺平了道路。他们筛选出一种能与突变型KRAS G12C的甘氨酸 - 12 - 半胱氨酸（G12C）置换中的半胱氨酸共价结合的抑制剂。通过使用一个含有半胱氨酸反应性化合物（即所谓的“弹头”）的小分子文库，他们确定了几个有前景的化合物，进而开发出了化合物12。开创性化合物12的研发是KRAS药物设计中的一个关键节点。结构分析表明，该化合物与开关II区域内一个此前未被识别的口袋（命名为S - IIP）相结合。尽管化合物12的效力较低，但它对KRAS G12C突变癌细胞表现出了选择性抑制作用。这些研究结果不仅证明了原本被认为不可成药的KRAS是可以成药的，还突出了这种成药作用可以以突变选择性的方式实现，从而降低对携带野生型（WT）KRAS的健康组织的毒性。 对化合物12进行更多化学修饰后，研发出了ARS - 853，它在体外展现出了更强的细胞活性。随后的进一步优化促使了ARS - 1620的诞生，该药物在体内具有更强的活性和口服生物利用度。ARS - 1620在源自KRAS G12C突变细胞系（CDX）和患者来源（PDX）的异种移植小鼠模型中显示出强大的抗肿瘤活性。化合物12及后续研发的化合物有一个惊人特性，即它们对KRAS G12C处于非活性（关闭）、结合GDP的形式具有选择性。当时，该领域的普遍观点是所有RAS突变体情况相同，都只是固定在结合GTP的状态，因此，预计对针对关闭状态的选择性抑制剂不敏感。然而，研究确定KRAS G12C突变体动态地进行着GDP - GTP循环，所以其存在状态会对关闭状态选择性抑制剂产生反应。 与此同时，几家制药公司启动了他们针对KRAS G12C的研发项目，并设计出在化学结构上与化合物12相似的小分子，这些小分子能够与S - IIP结合并对结合GDP的KRAS G12C进行共价修饰。索托雷塞（Sotorasib，AMG510）是首个进入临床评估的G12C靶向抑制剂。2018年，代号为CodeBreaK 100（NCT03600883）的首个临床试验开始研究索托雷塞在接受过标准护理化疗或免疫治疗后病情进展的晚期KRAS G12C突变实体瘤患者中的临床安全性。试验中未观察到剂量限制性毒性，且确认的客观缓解率（ORR）达32.2% 。88.1%的患者病情得到控制（DC），中位无进展生存期（PFS）为6.3个月。在CRC患者中，7.1%的患者确认有部分缓解（PR），73.8%的患者获得DC，PFS为4.0个月。患者中无完全缓解情况，NSCLC患者中有8.5%、结直肠癌患者中有23.8%出现疾病进展（PD）。基于这些积极结果，CodeBreaK 100进入了2期试验。在此阶段，80.6%的NSCLC患者获得DC，PFS为6.8个月，中位总生存期（OS）为12.5个月。基于CodeBreaK 100的良好研究结果，索托雷塞于2021年5月获得美国FDA加速批准，用于治疗局部晚期或转移性KRAS G12C突变的NSCLC。涉及KRAS G12C抑制剂的主要临床试验结果总结于表1。 表1 为进一步评估索托雷塞的疗效，3期临床试验CodeBreaK 200（NCT04303780）将索托雷塞与多西他赛用于NSCLC患者进行对比。多西他赛作为二线标准治疗方案，临床疗效一般且毒性较大。接受索托雷塞治疗的患者PFS仅比使用多西他赛的患者长1.1个月，分别为5.6个月和4.5个月。令人失望的是，索托雷塞在总生存期方面并未显示出显著改善，分别为10.6个月和11.3个月，这导致美国FDA在2024年拒绝给予其完全批准，但加速批准仍然有效。试验设计欠佳被认为是做出这一决定的原因之一。 第二款KRAS G12C选择性共价抑制剂阿达格拉西布（adagrasib，MRTX849）也于2018年开启临床评估（KRYSTAL - 1试验），该试验针对的是既往接受过化疗及抗PD - 1/PD - L1治疗、携带KRAS G12C突变的晚期和转移性实体瘤患者（NCT03785249）。阿达格拉西布在体内具有良好的生物利用度，并且在KRAS G12C CDX和PDX肿瘤模型中显示出有效的肿瘤抑制作用。在1/2期评估中，阿达格拉西布在NSCLC治疗方面展现出积极成果，ORR达42.9%，DC为86%，PFS为6.5个月，OS为12.6个月。基于这些结果，美国FDA也于2022年12月加速批准阿达格拉西布用于治疗NSCLC。 与NSCLC相比，索托雷塞和阿达格拉西布单药治疗在CRC中的ORR显著更低（见表1）。这种KRAS G12C突变型CRC反应较差的差异，让人联想到早期BRAF突变型结直肠癌与黑色素瘤对BRAF抑制剂治疗反应不同的情况，结直肠癌的反应同样较差。EGFR激活被认为是结直肠癌反应较差的一个原因，而联合使用EGFR抑制剂和BRAF抑制剂可克服这一问题。这促使了EGFR - BRAF抑制剂联合疗法获批用于治疗结直肠癌。因此，CodeBreaK 300试验（NCT05198934）启动，该试验在KRAS G12C突变的晚期结直肠癌治疗中，将索托雷塞与EGFR抑制剂帕尼单抗联合使用。与接受标准治疗（曲氟尿苷 - 替匹嘧啶或瑞戈非尼）的患者组PFS 2.2个月相比，索托雷塞与帕尼单抗联合使用使PFS提高到了5.6个月。CodeBreaK 300试验特别突出了KRAS G12C抑制剂联合疗法的优势。阿达格拉西布与西妥昔单抗联合使用时，也观察到了类似的ORR提升（30.2%）。基于这些研究结果，美国FDA于2024年6月加速批准了这种联合疗法用于治疗KRAS G12C突变的结直肠癌。 二代KRAS G12C抑制剂 通常来说，某一新型药物类别中最初获批的药物并非同类中最优，因此，众多第二代KRAS G12C抑制剂正在接受临床评估（表2和图2）。其中，divarasib作为一种颇具潜力的KRAS G12C抑制剂，近期已进入临床试验阶段（NCT04449874）。研究表明，与索托雷塞（sotorasib）或阿达格拉西布（adagrasib）相比，使用divarasib治疗的患者取得了更好的疗效。具体而言，使用divarasib治疗的患者ORR为53.4%，而索托雷塞或阿达格拉西布治疗的患者ORR为28.1% - 43%。此外，在NSCLC患者中，使用divarasib治疗的患者PFS延长至13.1个月，与索托雷塞或阿达格拉西布治疗相比，延长了6个月。 （向上滑动阅览） 表2 图2 D3S - 001是另一种新一代结合GDP的KRAS G12C抑制剂，与第一代KRAS G12C抑制剂相比，它能更快地与靶点结合。因此，即使在存在EGF等生长因子的情况下，D3S - 001也能有效减少结合GTP的KRAS。D3S - 001在体外已显示出增强的抑制效果，目前正在进行1/2期临床试验（NCT05410145）。 尽管大多数第二代抑制剂在作用机制上与最初的针对非活性状态（OFF）的选择性化合物12相似，但也有两种截然不同的共价G12C选择性抑制剂进入了临床评估阶段。首先，BBO - 8520是一种共价抑制剂，对结合GDP和结合GTP的KRAS G12C均具有选择性活性。与它在活性状态（ON - state）的活性相符，临床前研究发现，BBO - 8520对促进GTP - KRAS G12C形成的信号活动不太敏感。BBO - 8520最近已进入针对转移性KRAS G12C突变肿瘤的临床评估阶段（NCT06343402）。其次，RMC - 6291是一种KRAS G12C（ON）抑制剂，与靶向S - IIP的抑制剂相比，其作用模式非常独特。RMC - 6291无法直接与KRAS G12C结合，而是首先与亲免蛋白亲环素A（CYPA）形成二元复合物。然后，这个RMC - 6291 - CYPA复合物再与GTP - KRAS G12C形成三元复合物（RMC - 6291与KRASG12C共价结合），从而阻碍KRAS与效应蛋白的结合及激活。RMC - 6291正在进行单药1期临床试验（NCT05462717），以及与泛RAS抑制剂RMC - 6236或细胞毒性药物联合使用（NCT06128551和NCT06162221），用于治疗KRAS G12C突变的实体瘤。目前正在接受临床评估的其他KRAS G12C抑制剂候选药物包括JDQ443（NCT04699188）、BEBT - 607（NCT06117371）和GH35（NCT05010694）。 RAS抑制剂领域正在迅速发展，许多新的抑制剂正在开发中（图2），导致治疗空间越来越拥挤。因此，JDQ443的进一步开发最近被宣布停止。 KRAS G12D选择性抑制剂 靶向KRAS G12C已展现出巨大潜力，尤其是在NSCLC方面，该癌症约占所有KRAS G12C病例的75%。然而，非NSCLC相关的KRAS G12C仅占所有KRAS突变的约5%。因此，只有一小部分非NSCLC相关的KRAS G12C患者能从KRAS G12C抑制剂中获益。由于其他KRAS突变的高发性，开发其他突变选择性抑制剂以及泛KRAS和泛RAS抑制剂的工作正在进行，其中一些新型RAS抑制剂正在临床试验中接受评估（表2）。特别地，KRAS G12D已成为新抑制剂开发中的一个关键关注领域，因为这种突变约占所有KRAS突变的28%，并且是CRC和PDAC中最常见的突变。多种KRAS G12D抑制剂，包括JAB - 22000、UA022和BPI - 501836，正在临床前研究阶段。不过，通过基于结构的药物设计发现的MRTX1133，开创了非共价KRAS G12D抑制剂领域。 与美国FDA批准的KRAS G12C抑制剂类似，MRTX1133识别处于GDP结合状态的KRAS G12D。此外，MRTX1133也能够结合GTP结合状态的KRAS，尽管亲和力较低，并且它对KRAS G12D的选择性比对野生型KRAS高700倍。在临床前研究中，MRTX1133在KRAS G12D突变的胰腺细胞系衍生肿瘤（CDX）和患者来源肿瘤异种移植（PDX）小鼠模型中展现出强大的活性。另外，在使用MRTX1133治疗后，在胰腺导管腺癌细胞系和PDX模型中都观察到从基底样表型向经典表型的时间性转变，这使得肿瘤细胞对化疗更为敏感。MRTX1133是首个于2023年进入临床评估的KRASG12D选择性抑制剂，一项1/2期研究正在评估MRTX1133在患有晚期实体瘤的KRAS G12D突变患者中的疗效（NCT05737706）。与KRAS G12C抑制剂类似，MRTX1133属于正在临床评估中的一类不断扩充的小分子KRAS G12D抑制剂。其他正在接受临床评估的候选药物包括GFH375/VS - 7375（NCT06500676）、HRS - 4642（NCT05533463）、INCB161734（NCT06179160）、LY3962673（NCT06586515）、TSN1611（NCT06385925）、QLC1101（NCT06403735）以及QTX3046（NCT06428500）。截至目前，仅报道了HRS - 4642在18例实体瘤患者中的临床反应。6例患者出现靶病灶缩小，且毒性为三级或更低。 使用基于CYPA的三元复合物策略，RMC - 9805是另一种KRAS G12D共价抑制剂。不过，与其他KRAS G12D抑制剂不同的是，它对KRAS（ON）具有选择性。在9个PDAC PDX和CDX模型中的7个以及9个NSCLC PDX模型中的6个中，RMC-9805治疗后获得了客观缓解。RMC - 9805的1期临床评估显示，ORR为30%，DC为80%，有短时间的胃肠道相关毒性和皮疹（NCT06040541）。 除了直接作用的小分子KRAS G12D抑制剂外，还有两种替代方法正在临床试验中接受检验：蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）和基于RNAi的可生物降解植入物。近年来，PROTACs在肿瘤学研究中引发了广泛关注，因为它们具有降解靶蛋白的潜力，从而消除潜在的支架功能。总体而言，有多种基于PROTAC的降解剂正在接受评估，用于治疗前列腺癌和乳腺癌。最近，一种名为ACBI3的KRAS PROTAC被证明可靶向所有主要的致癌KRAS等位基因，分别在结直肠癌和卵巢平滑肌肉瘤异种移植模型中有效降解KRAS G12D和KRAS G12V。与此同时，靶向KRAS G12D的PROTAC——ASP3082，已进入1期临床试验，可单药使用，也可与西妥昔单抗或化疗联合使用（NCT05382559）。早期结果表明，在胰腺导管腺癌、结直肠癌和非小细胞肺癌的治疗中，其安全性可接受。此外，基于RNAi的可生物降解植入物siG12D - LODER正在一项2期临床试验中接受研究，该试验将其与化疗联合用于治疗局部晚期胰腺癌（NCT01676259）。该研究的早期结果显示，对KRAS进行局部下调具有良好的耐受性和安全性。 泛KRAS抑制剂 在癌症中，RAS基因除了G12C和G12D之外，还存在一系列其他突变（图1）。因此，人们正在开发新的抑制剂，以针对广泛的RAS突变类型。工具化合物BI - 2865（BI - 2493的结构类似物）和BI - 2852的设计思路是去除对半胱氨酸具有特异性的共价“弹头”（靶向G12C突变），并进行基于结构的修饰。这些非共价结合GDP的泛KRAS抑制剂对一系列KRAS突变体以及野生型KRAS均具有活性。由于这些抑制剂选择性识别KRAS的非活性（关闭）状态，其广泛的活性表明，大多数KRAS突变体，如G12C，会在结合GDP和结合GTP的状态之间动态循环。然而，这些抑制剂对GTP - GDP循环活性受损的KRAS突变体，如G12R和大多数Q61突变体，在体外没有活性。尽管如此，这些抑制剂对KRAS突变癌细胞系的生长有显著抑制作用，并且对携带各种KRAS突变（包括G12C、G12D和G12V）的患者来源肿瘤异种移植（PDX）瘤的生长也有明显抑制。 几种泛KRAS抑制剂正在进行临床评估。其中，BI 3706674是一种高效且可口服的小分子药物，目前正处于1期临床评估阶段，用于治疗转移性KRAS - WT扩增的胃、食管和胃食管结合部腺癌（NCT06056024）。其他处于临床1期的泛KRAS抑制剂包括PF - 07934040（NCT06447662）、LY4066434（NCT06607185）和QTX3034（NCT06227377）（表2）。 泛RAS抑制剂 对KRAS突变选择性抑制剂产生耐药性的一种机制是RTK活性上调，这会激活野生型KRAS，并导致涉及其他RAS成员的信号反馈回路。使用泛RAS抑制剂可能会抵消这种重新激活，同时还能针对更广泛的RAS突变。最初，泛RAS抑制剂的概念遭到了强烈反对，因为Kras很早就被确定为对小鼠胚胎发育至关重要的基因。因此，最初人们认为泛RAS抑制剂会因对正常组织产生毒性而带来有害的副作用。然而，这些担忧并未如预期般出现。目前报道的泛RAS抑制剂包括GFH547、RSC - 1255、YL - 17231、RMC - 7977和RMC - 6236，其中有几种正在进行临床试验（表2和图2）。研究最为广泛且可能进展最为领先的是基于CYPA的三元复合物RAS（ON）多选择性抑制剂RMC - 7977（工具化合物）和RMC - 6236（临床候选药物）。RMC - 7977靶向结合GTP状态下的突变型RAS和野生型RAS，并在依赖RAS的小鼠癌症模型（包括胰腺导管腺癌、结直肠癌和非小细胞肺癌）中显示出强大的抗肿瘤活性。RMC - 7977诱导肿瘤选择性凋亡，而这些小鼠的皮肤和结肠仅出现少量凋亡细胞。 RMC - 7977的相关类似物RMC - 6236正在临床试验中接受评估，包括单药治疗（NCT05379985）、与化疗或免疫疗法联合使用（NCT06162221），以及与KRAS G12C选择性抑制剂RMC - 6291联合使用（NCT06128551）。与RMC - 7977类似，在临床前模型中，接受RMC - 6236治疗的动物对所有测试剂量均耐受，并且在PDAC和NSCLC模型中均诱导了显著的肿瘤消退。在这两种癌症模型中，均未达到中位无肿瘤进展期。相比之下，CRC模型的反应程度较低，一半的临床前模型出现疾病进展，并且在60天后达到中位无肿瘤消退期。这项研究结果表明，结直肠癌肿瘤可能需要联合治疗，正如KRAS G12C抑制剂与EGFR抗体联合用于结直肠癌治疗已取得成功那样。尽管如此，已有127例KRAS G12X及其他RAS突变的胰腺导管腺癌患者接受RMC - 6236单药1/2期治疗的结果报告。在二线治疗的患者中，观察到的ORR和DC分别为29%和91%。令人印象深刻的是，有两名患者出现完全缓解，一名是由KRAS G12D驱动的胰腺导管腺癌患者，另一名是由KRAS G12V驱动的非小细胞肺癌患者。这两名患者在分别接受5个月和8个月的治疗后，均无疾病迹象。在87%的患者中观察到的主要副作用是皮疹，其中6%为3级或更高级别。35%的患者因治疗相关不良事件进行了剂量调整。然而，没有任何事件导致治疗中断iv。为支持这些结果，RASolute 302 3期临床试验的招募工作正在进行中（NCT06625320）。接受RMC - 6236二线或三线治疗的胰腺导管腺癌患者相对较低的PFS（分别为8.1个月和4.2个月）表明，与KRAS突变选择性抑制剂类似，泛RAS抑制剂也容易迅速产生耐药性。  多重耐药机制的挑战 随着大量RAS抑制剂在临床试验中接受检验，很明显，耐药性的产生将是其长期疗效面临的一个重大挑战。值得注意的是，在使用KRAS G12C抑制剂治疗的个体患者中已经观察到多种耐药机制，其中约50%可能归因于基因变异。尤其值得注意的是，在单个患者体内已经发现了多种驱动耐药的突变。这些耐药机制可以分为原发性、获得性和适应性耐药。 原发性耐药是患者对治疗无反应的根本原因，涉及使肿瘤对KRAS抑制剂不敏感的机制。这种耐药形式在所有患者中的发生率为9% - 24%。尽管我们对导致对KRAS G12C抑制剂原发性耐药的机制了解有限，但这对于患者分层至关重要。在一项针对424名接受索托雷塞或阿达格拉西布治疗的NSCLC患者的临床基因组学研究中，KEAP1、SMARCA4和CDKN2A的同时发生突变与疾病早期进展和较差的临床结果独立相关。值得注意的是，与KRAS G12C/KEAP1 WT/STK11 MUT或WT亚组相比，KRAS G12C/KEAP1 MUT/ STK11 MUT或WT亚组的PFS显著缩短（2.8个月vs 5.3个月），总生存期（OS）也是如此（6.3个月vs 10.7个月）。对18项研究中1224名接受阿达格拉西布或索托雷塞治疗患者的荟萃分析也确定KEAP1突变是治疗反应不佳的一个标志物。KEAP1是E3泛素连接酶复合物的一个组成部分，该复合物促进NRF2的蛋白酶体依赖性降解。KEAP1缺失会激活NRF2，从而导致对促进抗氧化保护反应的基因的调控。KEAP1缺失也已被确定为非小细胞肺癌对EGFR抑制剂产生耐药的一个驱动因素。 相比之下，获得性耐药出现在大多数最初对KRAS G12C抑制剂有反应的患者中，但他们在约4 - 6个月后会产生耐药性。这种耐药性可能是由于获得了新的突变，这些突变会削弱抑制剂与KRAS的结合，进而影响整体疗效（图3）。在KRYSTAL - 1试验中，最初病情稳定至少12周的患者中有45%对阿达格拉西布产生了耐药性。对循环肿瘤DNA的序列分析确定了新获得的KRAS突变，其中KRAS R68S、KRAS H95D/G/N/R和KRAS Y96C/D/H/N是最常观察到的耐药突变。这些突变位于KRAS的开关II结合口袋内，阻碍了抑制剂的结合。此外，在突变或野生型等位基因中还发现了频率较低的二次激活KRAS突变，包括G12A/D/R/S/V、G13D和Q61H/L。这些新获得的激活型KRAS突变对KRAS G12C特异性抑制剂不敏感，因此是恢复致癌性KRAS活性的一种潜在额外途径。 图3 同样，在CRC和NSCLC中，KRAS G12C扩增均被确定为KRAS G12C抑制剂治疗的重要耐药驱动因素。KRAS G12C扩增会导致KRAS蛋白数量增加，由于细胞内GTP与GDP的比例为10:1，这些蛋白最初结合的是GTP。鉴于内在的GTP酶活性较低，结合GTP的KRAS稳态量升高，从而降低了KRAS G12C（失活态）抑制剂的疗效。 除了KRAS G12C位点的突变或扩增，同源RAS亚型也能导致对KRAS G12C抑制剂的获得性耐药。发生KRAS G12C突变时，MAPK信号通路的主要活性由突变的KRAS驱动，NRAS和HRAS的贡献较小。然而，患者数据表明，在使用KRAS G12C抑制剂后，HRAS或NRAS的突变，如NRAS Q61K/L/R和HRAS G13V，能够恢复MAPK和PI3K - AKT通路的活性。通过RAS - GAP神经纤维瘤蛋白1（NF1）的功能丧失性突变也能达到相同效果，这在患者中已有报道。NF1缺失会导致GTP酶活性受损，从而激活野生型RAS，在KRAS被抑制后促使下游效应信号通路重新激活。 除了RAS蛋白，下游效应分子也可能出现驱动耐药的基因突变。常见的例子包括BRAF V600E突变、MAP2K1突变（如MAP2K1 K57N/T）或MAP2K1的激活型框内缺失。这些变异会导致MAPK通路独立于KRAS、NRAS或HRAS重新激活，从而促使对KRAS G12C抑制剂产生耐药性。同样，在患者中观察到MYC扩增，MYC是细胞外信号调节激酶（ERK）信号的主要下游效应分子，它可抵消KRAS G12C抑制剂的抑制作用。也观察到PI3K - AKT通路的突变，如肿瘤抑制基因PTEN的功能丧失性突变，或PIK3CA的功能获得性突变（如PIK3CA H1047R），导致PI3K信号过度激活。除了RAS - RAF - MEK或PI3K - AKT通路中的突变可恢复KRAS效应信号外，细胞周期调节因子的突变也进一步导致对KRAS G12C抑制剂的耐药性。在约20%的KRAS突变的非小细胞肺癌患者中发现了CDKN2A的功能丧失性突变，这会导致RB1肿瘤抑制基因失活。 鉴于RTKs是RAS的主要激活因子，因此在RTKs（如EGFR和MET）中出现突变或扩增作为KRAS G12C抑制剂的耐药机制屡见不鲜，这并不奇怪。MET通过依赖SOS的方式激活野生型RAS，从而驱动RAS信号传导。然而，MET的扩增还能够独立于KRAS激活PI3K - AKT通路，以及其他促生存通路，包括JAK - STAT3通路。通过siRNA使MET基因沉默以削弱MET功能，或使用MET抑制剂克唑替尼进行治疗，这两种方式在体外实验及动物实验中均恢复了（肿瘤细胞）对索托雷塞治疗的敏感性。 其他可能导致对KRAS G12C抑制剂产生耐药性的突变已被发现，包括RET RTK的激活突变以及致癌融合蛋白，如EML4 - ALK、CCDC6 - RET和NRF1 - BRAF。然而，这些突变作为KRAS G12C抑制剂耐药驱动因素尚未得到验证。 除了众多基因机制外，适应性非基因机制也被认为是导致KRAS G12C靶向治疗耐药的重要因素（图3）。适应性耐药是指肿瘤细胞通过反馈机制或蛋白质水平的翻译后失调来规避治疗的能力。一种常见的适应性策略是通过激活上游信号重新激活MAPK通路。野生型NRAS和HRAS可作为一种补偿机制，在KRAS G12C活性丧失时被激活。这种补偿性激活通常通过RTK的过表达或磷酸酶的下调来实现。例如，EGFR过表达会导致结合GTP的KRAS G12C水平升高，从而减少可被抑制的蛋白数量。然而，更多的EGFR也会激活野生型RAS蛋白，如HRAS和NRAS，进而驱动RAF - MEK - ERK级联反应的激活。同样，FGFR1过表达会导致ERK持续激活，使细胞能够克服对KRAS G12C的抑制。 上皮 - 间充质转化（EMT）这一现象常与多种癌症类型的治疗耐药相关，它能够促使对KRAS G12C抑制剂产生耐药性。尽管存在KRAS G12C抑制剂，间充质样细胞仍能促进PI3K活性，从而克服抑制剂的抑制作用。此外，间充质细胞表现出FGFR或AXL的激活，以此促进耐药性，并作用于HIPPO通路。该通路与EMT相关，其下游激活因子YAP是EMT的驱动因素。对KRAS G12C突变的非小细胞肺癌细胞进行全基因组CRISPR/Cas9筛选发现，YAP1/TAZ - TEAD激活是阿达格拉西布耐药发展过程中的一个重要驱动因素。这些结果突显了HIPPO通路对EMT以及对KRAS抑制剂耐药性的潜在影响。鉴于TEAD抑制剂VT3989正在针对实体瘤开展临床试验（NCT04665206），科研人员在临床前对抑制TEAD1 能否提升非小细胞肺癌细胞对阿达格拉西布的敏感性进行了测试，结果证明该方法能够提高阿达格拉西布的疗效。 不仅EMT，在无已知基因突变的NSCLC中，肺腺癌向鳞状细胞癌表型转变（AST）也与KRAS G12C抑制剂耐药相关。对基因工程肺癌小鼠模型的实验分析发现，编码LKB1丝氨酸/苏氨酸激酶的STK11肿瘤抑制基因功能丧失，会引发AST并导致对G12C抑制剂的耐药。值得注意的是，15% - 30%的肺腺癌存在STK11与KRAS的共突变。 鉴于前面所描述的机制，很明显，使用KRAS抑制剂的单一药物治疗常常会产生耐药性。从过去的经验中得到的一个关键教训是，联合疗法对于改善患者的治疗结果至关重要。这些策略有助于延缓或克服耐药性，从而提高治疗的整体疗效和持久性。主要的挑战在于预先为个体患者确定最有希望的联合治疗方法。 联合治疗以增强KRAS G12C抑制剂的疗效 RAS通路相关信号： 由于对KRAS G12C抑制剂的原发性和获得性耐药普遍存在，针对潜在增敏剂和药物组合的研究正在迅速展开（图4）。在针对KRAS G12C抑制剂研究最为广泛的联合疗法中，涉及EGFR抗体的疗法备受关注，尤其是在CRC治疗方面。这一策略的灵感源自早期对RAF抑制剂的研究，当时该抑制剂因反馈诱导的RTK信号（特别是EGFR信号）上调而初始疗效不佳。通过对EGFR和RAF，或者EGFR和RAS进行垂直抑制，能够更有力地抑制致癌信号，增强抑制剂的抗肿瘤效果。临床前研究表明，EGFR抑制剂西妥昔单抗可使KRAS G12C突变的结直肠癌CDX和PDX模型对KRAS G12C抑制剂敏感，从而导致肿瘤缩小。 图4 多项临床试验对KRAS G12C抑制剂与EGFR抗体西妥昔单抗和帕尼单抗联合使用的疗效进行了研究（表2）。在1b期KRYSTAL - 1研究中，评估了阿达格拉西布与西妥昔单抗联合用于CRC、NSCLC和PDAC的效果。在CRC患者中，ORR从单独使用阿达格拉西布时的18.6% 提升至联合用药时的46.4%。在KRAS G12C抑制剂中加入EGFR抗体，可同时降低突变型和野生型结合GTP的RAS水平。2024年6月，美国FDA加速批准了这种特定的联合疗法用于治疗携带KRAS G12C突变的结直肠癌患者。有趣的是，正如最近对两名患者的描述，帕尼单抗与索托雷塞联合使用不仅对携带KRAS G12C突变的结直肠癌患者有效，对携带NRAS G12C突变的结直肠癌患者同样有效。两名患者在长达12周的治疗中，病情均达到疾病稳定或部分缓解，唯一的副作用是EGFR抑制剂引起的皮疹。Rubinson等人还证明，索托雷塞可抑制所有RAS G12C亚型，其对NRAS G12C的抑制效力比对KRAS G12C或HRAS G12C高五倍。然而，FDA批准的另一种KRAS G12C抑制剂阿达格拉西布并不具备索托雷塞的这种特性，阿达格拉西布可抑制KRAS G12C，但无法抑制HRAS G12C或NRAS G12C。这种特异性与抑制剂和KRAS残基H95之间的必要相互作用有关，而H95在HRAS或NRAS中并不保守。这也解释了为什么在使用阿达格拉西布后复发的患者中发现了H95突变，而使用索托雷塞的患者中未出现这种情况。 KRAS G12C抑制剂单药治疗常常会导致多个由ERK驱动的负反馈回路失效，进而引起ERK重新激活。将MEK抑制剂与KRAS G12C抑制剂联合使用，是一种有望对抗MAPK信号通路重新激活的方法。遗憾的是，KRAS G12C抑制剂与MEK抑制剂联合使用，不足以克服EGFR的重新激活。为解决这一问题，在CodeBreaK 101试验中测试了MEK抑制剂、EGFR抑制剂与KRAS G12C抑制剂三者联用的垂直联合疗法。索托雷塞与MEK抑制剂曲美替尼以及EGFR抗体帕尼单抗联合使用，在非小细胞肺癌患者中的PR为20%，在结直肠癌患者中为9%，DC分别为87%和82%。 虽然EGFR是与KRAS G12C抑制剂联合使用时研究最为广泛的RTK靶点，但其他RTK，包括VEGF、MET或AXL，也作为联合靶点进行了研究。MET扩增会导致对EGFR抗体以及KRAS G12C - EGFR抗体联合疗法产生耐药性。因此，抑制或敲低MET并联合KRAS G12C抑制剂，可使细胞重新敏感，并促使小鼠体内肿瘤缩小。另一种被证明抑制后可使细胞对KRAS G12C抑制剂敏感的RTK是AXL。在最早发现KRAS G12C抑制剂ARS1620增敏剂的CRISPR筛选之一中，AXL被鉴定为PDAC细胞中的增敏剂。此外，研究发现YAP - AXL轴可促使非小细胞肺癌细胞对阿达格拉西布产生耐受，抑制AXL可使这些细胞对KRAS G12C抑制剂更敏感。 鉴于多种RTKs在耐药性产生过程中的驱动作用，与其使用针对特定RTKs的复杂抑制剂组合，一种更有效的方法可能是针对RTK信号传导与RAS激活之间的一个共同节点。鸟嘌呤核苷酸交换因子SOS1在介导RTK激活RAS的过程中至关重要。因此，抑制SOS1提供了一种潜在的泛 - RTK - RAS治疗策略。SOS1抑制剂BI - 3406与阿达格拉西布联合使用，即使在由MRAS和SHOC2驱动的阿达格拉西布耐药模型中，也能抑制肿瘤生长。同样地，SOS1:KRAS抑制剂BI 1701963与KRAS G12C抑制剂BI 1823911联合使用，使非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系移植模型（CDX）中的肿瘤消退，并于2021年进入临床试验（NCT04973163）。此外，一种基于SOS1抑制剂BI - 3406的SOS1蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）与索托雷塞联合使用，可协同减少小鼠肺部肿瘤体积。这种方法通过KRAS G12C抑制剂来抑制致癌的KRAS，同时额外的SOS1降解可阻止基于RTK的野生型KRAS、NRAS和HRAS的激活，从而防止它们补偿KRAS G12C功能的丧失。 另一种将RTKs与RAS解偶联的方法是靶向SHP2磷酸酶。SHP2在RTKs的下游发挥作用，通过调节SOS1的活性来促进RAS激活。因此，SHP2抑制剂可以充当泛- RTK抑制剂，阻止RTK信号诱导的RAS激活。这会导致KRAS在结合GDP的状态下积累，使得KRAS G12C（失活态）抑制剂能够作用于更高比例的KRAS G12C。SHP2和MAPK抑制剂的组合已经显示出协同效应。此外，各种体外研究已经证明，在使用KRAS G12C抑制剂治疗时，SHP2抑制剂能够有效且持续地抑制RAS通路。因此，多种SHP2抑制剂正在与KRAS G12C抑制剂联合进行临床评估。在2023年IASLC世界肺癌大会上公布了KontRASt - 01试验（NCT04699188）的初步结果，该试验将KRAS G12C抑制剂JDQ443与SHP2抑制剂TNO155联合使用。对于预先使用过KRAS G12C抑制剂的患者，记录的DC为67%，ORR为33%，缓解持续时间超过6个月。虽然SHP2抑制剂在临床前模型中显示出强大的抗肿瘤效果，但在临床环境中会遇到耐受性问题，因此需要优化给药方案以尽量减少不良事件。 为了克服由激活的野生型HRAS、NRAS和KRAS驱动的反馈回路，多种RAS抑制剂提供了另一种阻断RTK诱导的RAS - MAPK信号传导的选择。这些抑制剂的早期1期临床试验报告称，在胰腺癌（PDAC）和非小细胞肺癌（NSCLC）患者中出现了部分缓解（PR）。因此，正在进行的临床试验正在探索多种RAS抑制剂RMC - 6236与KRAS G12C抑制剂RMC - 6291联合使用的效果（NCT06128551）。 另一种防止RTK反馈回路激活野生型HRAS的方法，又回到了前文所述的FTIs的应用上。最近一项研究表明，在NSCLC、PDAC和CRC中，索托雷塞与FTI替吡法尼联合使用具有益处。虽然致癌性KRAS G12C信号传导被索托雷塞抑制，但其他RAS亚型可以补偿这种抑制作用。而FTIs可削弱HRAS信号传导，从而提高KRAS G12C抑制剂的疗效。在此，这种联合用药可能还得益于FTIs对所有法尼基化蛋白的广泛作用，而非仅作用于HRAS。FTIs靶向的最知名的法尼基化蛋白之一是小GTP酶RHEB，它参与mTOR信号传导，这表明PIK3CA/mTOR信号传导也与治疗反应有关。 由于KRAS - MAPK信号是细胞周期从G1期向S期转变的关键驱动因素，针对细胞周期控制蛋白进行靶向治疗是一种增强KRAS抑制效果、解决细胞周期诱导的耐药性的额外有效策略。因此，抑制细胞周期调节因子，特别是那些驱动G1 - S期转换的调节因子，是一种很有前景的联合靶向策略。细胞周期蛋白依赖性激酶4和6（CDK4/6）在促进G1 - S期转换过程中发挥着主要作用，对它们的抑制会使细胞周期停滞在G0/G1期。CDK4/6抑制剂帕博西尼（palbociclib）在细胞系和小鼠模型中增强了KRAS G12C抑制剂的疗效。目前，有五项正在进行的临床试验是将已获批临床应用的CDK4/6抑制剂与KRAS G12C抑制剂联合使用。 另一种被发现可增强对KRAS G12C抑制效果的细胞周期激酶是极光激酶A（AURKA）。将AURKA抑制或敲除与抑制KRAS G12C相结合，能有效降低KRAS的重新激活，并对癌细胞发挥抗增殖作用。此外，AURKA抑制剂可促进由KRAS G12C抑制剂诱导的细胞静止，使大量细胞停留在G0期。一项临床试验（NCT05374538）也曾对AURKA抑制剂与索托雷塞的联合使用展开研究，不过该试验因申办方的决定而终止。 值得注意的是，虽然RAS - MAPK通路抑制剂或细胞周期抑制剂会诱导细胞周期停滞在G0期，但在KRAS G12C扩增的耐药细胞中，撤除KRAS G12C抑制剂也能引发这一现象。在这种情况下，撤药会引发信号冲击，导致癌基因诱导的细胞衰老。癌细胞的这种衰老表型展现出一种新的弱点，可利用衰老细胞裂解药物进行研究。 免疫相关的联合疗法： 免疫疗法是一个快速发展的研究领域，众多临床试验正在探究抗PD - 1/PD - L1免疫检查点疗法在癌症治疗中的益处。通过抑制PD - 1或PD - L1可促进T细胞活性，进而介导肿瘤细胞死亡。在过去几年中，多种靶向PD - 1/PD - L1的药物，如帕博利珠单抗和纳武利尤单抗，已获得美国FDA批准，用于治疗NSCLC及其他类型的癌症。这种治疗方法已拓展为联合疗法，即在非小细胞肺癌和结直肠癌治疗中，将免疫疗法与KRAS G12C抑制剂相结合。对携带KRAS G12C突变且具有免疫活性的小鼠CRC CDX进行的临床前评估发现，单独使用索托雷塞可使肿瘤短期消退，但随后肿瘤会再次生长。然而，当与抗PD - L1治疗联合使用时，可观察到肿瘤完全消退，且在治疗结束后持续超过2个月。目前，有24项临床试验正在将抗PD - 1/PD - L1疗法与KRAS G12C抑制剂联合使用，其中进展最为前沿的是KRYSTAL - 7试验，这是一项2/3期试验，将阿达格拉西布与抗PD - 1单克隆抗体帕博利珠单抗联合使用（NCT04613596）。截至目前，该试验尚未公布结果。 鉴于致癌性RAS信号可稳定PD - L1的mRNA，进而调控PD - L1的表达，联合使用针对这两个靶点的抑制剂似乎前景可期。为进一步提升这种联合治疗的效果，多项体外研究强调，将KRAS G12C抑制剂不仅与抗PD - 1药物联用，还与SHP2抑制剂联用，能带来更多益处。这种三联疗法被认为可诱导抗肿瘤免疫反应，并重塑肿瘤微环境，增强KRAS G12C抑制剂的效果，尤其是在PDAC的治疗中。目前，有一项临床试验正聚焦于这些体外研究结果，将JDQ443、TNO155和替雷利珠单抗联合使用（NCT04699188）。截至目前，该试验尚未公布结果。 利用免疫系统对携带KRAS突变肿瘤的其他治疗方法，涉及与KRAS G12C抑制剂共价结合的KRAS G12C蛋白片段衍生的新抗原。这些新抗原一旦通过MHC I复合物呈现在癌细胞表面，双特异性T细胞衔接器就能介导新抗原与T细胞之间的相互作用。这种相互作用会触发细胞毒性T细胞反应，从而导致癌细胞被选择性破坏。该方法的优势在于，所有仍携带KRAS G12C突变且受KRAS G12C抑制剂抑制的癌细胞，都会成为细胞毒性T细胞的靶标，即便这些细胞已通过下游突变或MYC扩增等机制产生了耐药性。 化疗相关的联合疗法： 鉴于化疗仍是癌症治疗的标准方案，因此有17项临床试验正在评估化疗与KRAS G12C抑制剂联合使用的效果也就不足为奇了。临床前研究为这些试验提供了支持，结果表明，在KRAS G12C突变的NSCLC CDX小鼠模型中，与单药治疗相比，索托雷塞与标准治疗药物卡铂联合使用，能显著更大程度地抑制肿瘤生。同样，在KRAS G12D突变的PDAC小鼠模型中，单独使用MRTX1133或标准治疗药物吉西他滨，仅能在2周内抑制肿瘤转移生长，而两者联合使用则可使肿瘤长期消退。目前尚不清楚，观察到的这些效果是由于KRAS G12C抑制剂与化疗药物之间的协同作用，还是由于化疗针对的是快速增殖的细胞（包括对KRAS G12C抑制剂耐药的细胞），这仍是一个有待解决的问题。 结语和未来展望 随着两款KRAS G12C选择性抑制剂获批成功，以及众多针对其他KRAS突变的抑制剂涌现，“KRAS不可成药”这一观点如今可以被摒弃了。虽然临床评估中的大多数抑制剂的机制与两种已批准的突变选择性OFF变构抑制剂相似，但也有一些抑制剂的机制不同，从而增加了有效选择的多样性。传统观点认为，突变选择性抑制剂会优于对野生型和突变型KRAS蛋白均有活性的抑制剂，且不受正常组织毒性的限制，然而，泛RAS抑制剂RMC - 6236出人意料的临床疗效正在挑战这一观点。 展望未来，KRAS抑制剂持续发展面临的最大挑战是克服耐药性，因为耐药性限制了治疗反应的深度和持续时间。如今，人们普遍认为，KRAS抑制剂的长期疗效无法通过单药治疗实现，而需借助联合治疗。尽管我们对耐药机制的了解仍然有限，但新出现的证据表明，这些机制将是多样且复杂的，在患有相同癌症类型的不同患者体内以及同一患者体内都可能存在差异。因此，确定有效的联合治疗方案仍是一项艰巨的挑战。需要进一步开展研究，尤其是在患者分层、联合治疗方法、药理学以及耐药性发展的理解等领域，以确保不仅能提高这些患者的生活质量，还能延长他们的生存期。 历经近四十年的挫折，临床有效的KRAS G12C选择性抑制剂研发成功，这在癌症药物研发领域标志着一个重要的里程碑。这一成果开启了基础与转化RAS研究激动人心的崭新时代。以往的抗RAS研究因我们对RAS功能的理解不全面而受到限制，而未来的研究必将揭示RAS还有诸多奥秘有待解开。有一点是肯定的，未来为RAS突变癌症患者带来了充满希望的治疗选择。 未解决的问题 虽然 KRAS G12C 抑制剂在临床环境中显示出了一定的暂时疗效，但约 50% 的患者对这些疗法没有反应。导致这种原发性耐药的潜在机制是什么？是否有潜在的药物组合可以克服这种耐药性并提高这些患者的治疗效果？ 能否识别原发性耐药的驱动因素，并将其用作预测患者反应的潜在生物标志物呢？此外，是否有特定的生物标志物可以用来预测继发性耐药的出现呢？ 除了原发性耐药，获得性耐药的产生对KRAS G12C抑制剂来说是一个重大挑战，许多潜在机制尚未被完全理解。还有哪些耐药机制会导致患者不再适合继续使用KRAS G12C疗法呢？ 鉴于大量临床试验正在探索KRAS G12C抑制剂与其他疗法的联合使用，哪些联合方式有可能带来最显著的治疗益处呢？这些联合疗法会延长患者的无进展生存期吗？ RAS（激活态）多选择性抑制剂正展现出很有希望的初步临床结果，但耐药性的出现仍然是一个关键挑战。一个关键问题是，在KRAS G12C抑制剂中观察到的耐药机制是否会在多选择性RAS（激活态）疗法中成为主要的耐药驱动因素，还是会有新的机制成为耐药驱动因素。此外，与KRAS G12C抑制剂一起使用的联合策略是否可以直接应用于多选择性RAS（激活态）疗法，或者是否可以确定更有效的联合方法？ 鉴于 RAS 是一种小 GTP 酶，从 KRAS G12C 和 RAS（激活态）多选择性抑制剂中获得的认识能否应用于其他小 GTP 酶，如 RHO 或 RAB 呢？此外，针对这些 GTP 酶使用此类抑制剂时，是否能够带来额外的临床益处呢？ 参考文献： Isermann T, Sers C, Der CJ, Papke B. KRAS inhibitors: resistance drivers and combinatorial strategies. Trends Cancer. Published online December 27, 2024. doi:10.1016/j.trecan.2024.11.009 本文仅供医学专业人士参考，不代表本平台观点。

“ 点击蓝字 关注我们 张龙贵 四川大学与德国慕尼黑大学联合培养药剂学博士，深圳厚存纳米药业有限公司创始人，德国华人华侨科技工商协会生物医药专业委员会副主任，光明留学生联谊会理事，四川大学生物医学工程学院生物医学工程专业学位研究生产业导师，深圳理工大学曙光书院荣誉辅导师。 从事纳米药物递送技术研究 14 年，擅长靶向纳米粒载体的设计和开发，发表 SCI 论文 8 篇，专注用于RNA 药物开发的可降解靶向递送材料、纳米制剂方法及新剂型的设计和转化。于 2018 年创建深圳厚存纳米药业有限公司，带领公司研发团队研究 mRNA 药物纳米递送技术，主导研发的肝靶向 LLLRNA® 、Genefrei®系列试剂盒、肺靶向 Lunguide® 、淋巴结靶向 DCguide® 、脾靶向 SPguide® 、Tguide® 、多肽 BMPNP® 等纳米递送技术已获得 26 项专利授权。公司专利技术可用于预防型疫苗、治疗型疫苗、CART 疗法、siRNA 疗法、蛋白替代疗法及基因编辑等药物开发。所带领的公司团队先后荣获光创赛行业赛二等奖、总决赛三等奖、最具投资价值奖 , 深创赛行业总决赛优秀奖、国赛总决赛优秀奖，2021 年申请深圳市创新创业计划-创业资助项目，并获得 100 万项目资助。公司分别在2021 年和 2022 年被收录于《中国疫苗白皮书》和《RNA 疗法行业白皮书》中，2022 年入选“科创中国”生物医药领域“先导技术”榜单，深圳光明区首批授牌认定的合成生物企业，2023 年入选国家级科技型中小企业、深圳市创新型中小企业。 核酸药物递送的多肽载体研究进展 PPS  李楚欣 1，宋文婷 1，张跃豹 1，魏民志 2*，张龙贵 1** （1. 深圳厚存纳米药业有限公司，广东 深圳 518107；2. 上海兆维科技发展有限公司，上海 200233） [摘要] 核酸药物可在体内实现基因敲除、基因沉默及诱导蛋白质表达等功能，在人类疾病预防和治疗中发挥重要作用。常见的核酸药物包括反义寡核苷酸（ASO）、小干扰 RNA（siRNA）、微小 RNA（miRNA）和信使 RNA（mRNA），它们在外界及生理条件下不稳定，因此需要安全高效的递送载体。多肽具有低免疫原性、生物可降解、良好的入胞效率和多功能性等优点，有利于提高核酸药物的生物利用度并改善体内靶向分布。综述用于核酸药物递送的多肽载体相关研究进展，探讨多肽-核酸纳米药物在不同剂型和疾病中的适用性，旨在为提高核酸治疗药物的多样性和有效性研究提供参考。 基于信使核糖核酸（mRNA）、小干扰核糖核酸（siRNA）等核糖核酸（RNA）的基因治疗制剂，能在转录、翻译水平调控目标基因和蛋白的表达或沉默，有望解决一些潜在治疗靶点的不可成药问题，在流行性疾病预防、重大难治疾病（如癌症、神经性疾病）治疗等方面展现出较大的治疗潜力和开发价值 [1]。此外，由严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒感染（coronavirus disease 2019，COVID-19）的流行在全球范围内的影响极大，人们对流行性疾病的关注日益增加。mRNA 疫苗具有高效、安全、可快速制备的特点，能够针对不同的流行性疾病进行快速、大规模生产，有效预防和降低流行性病毒的传播与感染。然而，体内递送核酸药物面临着复杂多样的生理屏障，包括循环屏障、细胞外基质屏障、细胞膜屏障和内体屏障等 [2-3]。为克服这些生理屏障并提高核酸药物的生物利用度，需要设计多功能的递送系统。 脂质纳米粒（lipid nanoparticle，LNP）是当前临床及临床前研究中常用的基因治疗递送载体。目前已有两款使用 LNP 作为递送载体的 mRNA 疫苗产品获得美国食品和药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）的批准用于预防 COVID-19，分别是 Pfizer 公司和 BioNTech 公司合作研发的Comirnaty®以及Moderna公司研发的Spikevax® 。然而，研究发现注射核酸LNP可能引起人体的不良反应 [4-5] 。开发低免疫原性、天然、安全和高效的新型核酸递送载体 [6]，有望降低核酸制剂的免疫原性，减少副作用，提高核酸药物在体内的生物利用度。  多肽是一种天然的非病毒基因转染载体，具有低免疫原性、较好的生物相容性、特殊的二级结构及靶向性等优点。研发人员可针对不同的生理屏障和递送需求来设计多样化、多功能的多肽载体 [7]。在研究及生产中，多肽载体负载核酸药物主要有 2种策略，即共价偶联和非共价络合。其中，非共价络合方式更简便，无需复杂的化学修饰合成技术，借助中性条件下带正电荷的碱性氨基酸（如赖氨酸、精氨酸、组氨酸）与磷酸基团之间的静电相互作用实现高效压缩核酸药物。在多肽中引入特定的氨基酸并合理设计序列，可以调整多肽载体的两亲性，促使多肽与核酸药物的复合体系自组装形成纳米粒。此外，多肽分子中的疏水侧链基团与细胞膜脂质双分子层具有强亲和力，研究发现某些多肽可以克服细胞膜屏障，增强多肽-核酸药物纳米粒与细胞膜的相互作用，改善核酸药物的细胞内化及转染效果。一些具有 pH 响应性的多肽在进入细胞内酸性亚细胞器（如内体、溶酶体）时可以发生二级构象变化 [8]，如翻转形成 α-螺旋结构。这种 α-螺旋结构借助氨基酸疏水侧链基团与脂质的亲和力，能穿刺插入内体膜结构中，促使内体膜结构不稳定甚至解体，进而携带核酸药物逃离酸性内体，实现向细胞质递送及高效转染。已有研究探讨了多肽载体的作用机制 [9]，本文主要介绍用于递送核酸药物的多肽载体材料的新近研究进展，探索多肽-核酸纳米粒在不同给药剂型和疾病治疗中的适用性，旨在为新型多肽载体的临床转化提供参考。 1 经典载体细胞穿膜肽 细胞穿膜肽（cell penetrating peptides，CPPs）是一类与细胞膜具有强亲和力，能跨越穿透细胞膜屏障实现向细胞内转运递送药物的短肽，例如寡聚精氨酸、CADY 肽（GLWRALWRLLRSLWRLLWRAS-NH2）和源自人免疫缺陷病毒的 TAT 肽（YGRKKRRQRRR）等 [7]。CPPs 具有良好的内化入胞效率，已有研究围绕 CPPs 入胞机制进行了深入探索 [9]。作为经典的递送载体，CPPs 可用于改善不同药物的分布与递送，如小分子、质粒、寡核苷酸、蛋白质、纳米颗粒、脂质体等，且常用于递送寡肽 / 蛋白质及核酸类药物 [10]。CPPs 在核酸递送载体设计中具有使用简易、灵活、适用于不同修饰方式等优点，可通过静电作用和氢键作用与核酸药物直接络合；也可通过化学偶联的方法直接将 CPPs 与核酸药物结合，或将 CPPs 修饰在其他递送系统的表面以增强其细胞内化、转染效果。Peng 等 [11] 研究发现，多价穿膜肽（multiple CPP）可增强核酸纳米粒的细胞内吞水平及 siRNA 转染效率。该研究将富含精氨酸的ARP 多肽（KRRKRRRRRK）通过席夫碱反应以摩尔比 2 : 1 大量地接枝在聚合物表面制备得到多价穿膜肽聚合物纳米粒；细胞毒性实验发现，ARP 多肽修饰的聚合物纳米粒对肿瘤细胞的半抑制浓度明显低于未修饰的聚合物纳米粒，其抑癌作用的提升可能得益于正电 CPPs 与负电细胞膜的亲和力，显示出 CPPs 靶向肿瘤细胞递送的潜力；借助正电 CPPs络合负电性的核酸，进一步筛选出 ARP 修饰的 P（LAEMA23-st-FPMA3）聚合物纳米粒（P3-P），可载带能够特异性沉默宫颈癌细胞的表皮生长因子受体（EGFR）的 siRNA，P3-P 纳米粒的脱靶效率和细胞毒性明显低于市售载体 LipofectamineTM 3000，具有较好的安全性及靶向性优势。  磷酰二胺吗啉代寡核苷酸（phosphorodiamidate morpholino oligomers，PMOs）是一种经 FDA 批准用于迪谢内肌营养不良的反义寡核苷酸治疗制剂。将 CPPs 如寡聚精氨酸（GR6）修饰在 PMOs 上可制得多肽偶联式磷酰二胺吗啉代寡核苷酸（peptideconjugated PMOs，PPMOs） 制剂， 其能有效改善体内组织靶向递送、细胞内化及入核效果 [12]。Gan 等 [13] 对给药 30 天后小鼠多个组织器官中外显子跳跃水平和肌营养不良蛋白表达的分析检测发现，单次注射 PPMOs 即可引起持续、有效的治疗效果，并通过握力等测试证明了 PPMOs 可显著改善小鼠肌肉性能。研究人员进一步对比相同条件下PPMOs 与 PMOs 的效果发现，每月一次的给药频率下 PPMOs 比单次注射 PPMOs 显示出更持久的治疗效果；在每月一次的给药频率下，无 CPPs 修饰的 PMOs 组中，多只小鼠肌肉性能改善情况不佳且在心脏组织中效果不明显。此外，已有Ⅱ期临床试验（NCT04004065）正在验证 PPMOs 的安全性和药物代谢动力学特征。临床前及临床试验结果揭示了 CPPs 偶联修饰策略具有提高寡核苷酸药物生物利用度、降低给药频率以及拓展应用到其他核酸药物递送体系的潜力。 Bang 等 [14] 设计了一种具有肿瘤细胞靶向作 用 的 核 酸 递 送 融 合 肽 载 体， 通 过 寡 聚 甘 氨酸 短 肽， 将 正 电 性 聚 精 氨 酸 R11多肽与乳腺癌细胞靶向肽 SP82 结合制备得到 RS 融合多肽（RRRRRRRRRRRGGGGQLEFYTGLAKLI）， 以期提高传统 CPPs 多肽载体的靶向特异性。将 RS融合多肽与抑制肿瘤细胞生长的 siRNA 复合后，可自组装得到水合粒径为 200 ~ 300 nm 的颗粒。在纳米粒稳定性实验中发现，RS 融合多肽相比亲本多肽 R11 展现出更好的抗酶解和维持 siRNA 稳定的性能，在与血清孵育 24、72 h 后仍能有效保留负载的 siRNA，载荷效率分别达到 90% 和 60% 以上。通过细胞内吞实验对比发现，RS 融合多肽载体相比市售载体 LipofectamineTM 2000，具有相近的乳腺癌细胞靶向内化效率，且展现出对乳腺癌细胞更佳的抑制作用。值得注意的是，在体外模拟实验中，RS-siRNA 纳米粒被巨噬细胞摄取的水平显著低于 LipofectamineTM 2000，具有降低非特异性摄取清除并提高核酸药物在体内生物利用度的潜力。通过活体观察及切片染色验证发现，RS-siRNA 纳米粒在活体中具有低免疫原性及良好的生物相容性。研究人员进一步对比 RS 融合多肽和另一种能特异性靶向乳腺癌细胞的融合肽 RT（RRRRRRRRRRRGGGGAKRGARSTA）发现，RS融合多肽络合、压缩、稳定 siRNA 的能力更强，且对乳腺癌细胞转染、抑制效果更好。该项研究通过融合肽策略，一方面提高了经典CPPs载体的靶向性，降低非特异性免疫清除；另一方面通过引入合适的靶向肽，有利于进一步提高 CPPs 的核酸络合及胞内递送效果，为多肽载体设计及优化提供重要的理论参考。 2 多肽载体的多功能化设计 除直接利用经典 CPPs 增强核酸递送外，多项研究基于仿生设计 [15] 和电脑计算优化 [16] 等策略对多肽分子进行了优化和验证，衍生出丰富多样的多肽序列设计和功能化研究，为丰富核酸药物递送体系提供重要参考。 2.1 支化多肽载体  除了可用于静电络合压缩核酸药物外，赖氨酸分子支链上的氨基官能团被广泛用于设计合成支化、树枝状多肽分子 [17]。支化多肽作为基因递送载体，一方面可提供双臂至多臂可修饰位点，有利于实现多功能化；另一方面，支化多肽可设计成 Y 型、树枝型等非线性结构，有利于增大多肽载体与核酸药物和细胞膜的作用面积，从而提高核酸载荷量及入胞效率。Yuan 等 [18] 设计了一系列基于赖氨酸的支链两亲性多肽（BAPs），旨在通过实验对比筛选出其中最佳的多肽序列用于递送质粒 DNA（plasmid DNA，pDNA）和 mRNA。通过比较基于 K4、K6、 K8 的短分支 BAPs-pDNA 复合物的尺寸、电势、核酸负载率等，确定 K6 是三者中性能最佳的寡聚赖氨酸。研究人员进一步优化 BAPs 支链上不同氨基酸的含量和排序发现，通过集中排布正电氨基酸，合理分割亲水和疏水侧链基团排布以及延长疏水分支长度等设计策略，可以有效提高 BAPs 的两亲性。其中，BAP-V7 多肽 [ 序列为 bis(FFLFFHHH)-K-K6，见图 1] 可以与 pDNA 形成更稳定的复合物，在体外肝素置换实验中显示出相比其他对照多肽更强的核酸负载稳定性。通过体外细胞实验证明，BAP-V7 支化多肽载体的生物相容性及转染效果相比市售基因转染载体支化聚乙烯亚胺更佳，且可用于递送其他类型的核酸药物如 mRNA，显示出较好的通用性。 2.2 膜亲和性多肽载体  多肽载体与细胞膜的亲和作用主要来源于氢键、静电力、疏水效应等。在多肽序列设计中引入正电性碱性氨基酸或侧链官能团等易形成氢键的氨基酸，可以有效提高载体与细胞膜的亲和性 [11, 14]。研究人员发现，色氨酸与细胞膜的脂质、胆固醇分子具有亲和性，在 CPPs 的入胞过程中起重要作用 [19]。此外，引入色氨酸可增强多肽疏水性，促进多肽/核酸复合体自组装并提高其稳定性 [20]。Samec 等 [21] 基于天冬氨酸-异亮氨酸-缬氨酸（DIV）重复序列及寡聚 D 型精氨酸，设计了一系列两亲性多肽 DIV3(X)，能与 siRNA 自组装成尺寸为80 ~100 nm 的颗粒。体外模拟实验发现，在高浓度胎牛血清及核糖核酸酶（RNase）孵育条件下，DIV3W 多 肽 [WEADIVADIVWDIVADIVAGGG-(d) RRRRRRRRR] 载荷的 siRNA 仍保持较高完整性，证明该递送体系具有良好的稳定性及核酸药物保护功能。进一步对比发现，含色氨酸的 DIV3W 肽在卵巢癌细胞中的入胞能力及基因沉默效率显著高于DIV3H 多 肽 [WEADIVADIVHDIVADIVAGGG-(d) RRRRRRRRR]。研究者推测 DIV3W 多肽载体的递送转染效果得益于色氨酸的膜亲和性，一方面提高入胞递送效率，另一方面有利于与溶酶体膜结合从而释放核酸药物，为多肽载体细胞膜亲和性相关研究工作提供一定的参考。 2.3 自交联多肽载体  在序列设计中引入半胱氨酸可赋予多肽载体一些特别的功能。一方面，半胱氨酸的侧链基团可以形成二硫键。含半胱氨酸的多肽载体，可以在分子内交联形成环肽结构，也可以在多肽载体分子间交联形成网络结构从而更好地包封药物减少泄露，还可以与其他成分（如核酸药物）交联形成分子间二硫键从而制备更稳定的纳米复合物。此外，二硫键具有可逆性，有利于实现细胞内多肽-核酸纳米粒的药物释放，促进核酸药物与作用位点结合并发挥生物效应 [22]。Mandal 等 [23] 通过在以色氨酸和精氨酸为主的不同多肽序列中引入半胱氨酸，制备了一系列自交联多肽。其中，环状多肽 C4[ 序列为Cyclo(CR5W5C)] 和杂化肽 H4[W4-Cyclo(CR5C)-W4]显示出优异的稳定性、核酸保护能力，良好的生物相容性及较高的入胞效率 [22]。利用环肽二硫键在细胞内的还原环境下可以裂解的性质，促进载荷siRNA 进入细胞质并释放，沉默靶标基因及抑制蛋白表达效率高达 70% ~ 75%；展现了多肽载体递送核酸药物的高效、安全的特点。  基于半胱氨酸的自交联多肽载体在工业核酸治疗制剂生产中也具有重要应用。例如，德国的生物科技公司 CureVac 就在其公开的专利（如CN108026537B、CN102573919B、CN107648604A和 CN103025876A）中涉及了多种含半胱氨酸的多肽载体并用于制备交联多肽纳米粒，旨在提高核酸药物颗粒的稳定性和体内递送、释放、转染的效果。  2.4 内体逃逸多肽载体  在内体酸性环境下，质子化的组氨酸可引发内体膨胀甚至破裂，因此，在多肽序列中引入组氨酸有利于促进核酸药物的内体逃逸 [24-26]。Mixson 课题组设计了基于通式 X2-K-K(X)-K(X)-CONH2 且支链 X 富含组氨酸的树枝状多肽，并发现其侧链序列稍作改变即可获得不同性能的多肽用以递送核酸药物 [27-28]。研究发现，H2K4b 多肽（序列为 X2-K-K(X)-K(X)-CONH2，其中 X = KHKHHKHHKH-HKHHKHHKHK）适用于递送相对分子质量较大的质粒 [27]，而 H3K4b 多肽 [ 序列为X2-K-K(X)-K(X)-CONH2，其中 X=KHHHKHHHKHHHKHHHK] 则是 siRNA 的良好载体。在此基础上，He 等 [28] 在树枝状多肽 H3K4b 侧链上引入单个组氨酸，得到 H3K(+H)4b 多肽 [ 序列为 X2-K-K(X)-K(X)- CONH2，其中 X = KHHHKHHHKHHHHKHHHK] 并用于递送 mRNA。与 H3K4b 相比，H3K(+H)4b 具有更强的 mRNA 压缩能力和更高的稳定性。另外，细胞实验显示，H3K(+H)4b 多肽载体递送 mRNA 的转染效率是 H3K4b 载体的 10 倍，且无明显的细胞毒性作用。将 H3K(+H)4b 中的 L 型赖氨酸替换成稳定性更高、对蛋白酶降解具有抗性的 D 型赖氨酸制备得到 H3k(+H)4b 多肽。以 H3k(+H)4b 多肽作为载体，可进一步提高 mRNA 的体外转染效果，揭示了载体的抗酶解稳定性对核酸递送转染的重要影响。 2.5 抵抗酶降解的多肽载体  多肽-核酸药物递送系统需要克服体内复杂多样的活性酶带来的降解问题以提高递送效率 [29-31]。逆反肽（retro-inverso peptide）与亲本多肽具有完全相反的氨基酸序列；在性能上，逆反肽比其亲本肽具有更强的蛋白酶耐受性，不易被水解，因此具有更好的稳定性 [32]。Vaissière 等 [33] 基于细胞穿膜肽 CADY 设计了新的多肽载体 CADY-K（GLWRALWRLLRSLWRLLWK）， 并在此基础上采用逆反转策略（retro-inverso）制备了逆反肽RICK（kwllrwlsrllrwlarwlg）。此外，不同于由 L 型氨基酸组成的亲本对照肽 CADY-K，RICK 多肽由不易被蛋白酶降解的 D 型氨基酸组成。实验发现，RICK 多肽与亲本 CADY-K 多肽拥有相近的 siRNA络合能力，逆反转设计并不影响多肽负载核酸的能力。然而在蛋白酶孵育实验中，CADY-K/siRNA 纳米粒被酶迅速降解导致 siRNA 泄露失活，而 RICK/siRNA 纳米粒展现出显著增强的稳定性，可保护负载的 siRNA 并实现高效细胞递送及转染。目前逆反转设计及引入 D 型氨基酸在多肽载体的理论研究和实际生产应用中均较少报道，但可为新型多肽载体设计提供了另一种研究思路。  尽管多肽作为核酸递送载体显示出多功能及良好生物相容性等优点，其体内应用仍面临稳定性差、易降解等问题，还需更多研究和新策略以增强多肽抗酶解能力，从而提高多肽递送系统在体内的稳定性及核酸药物的生物利用度。 3 多肽载体的给药途径 近年来，多肽载体不同给药途径的开发受到广泛关注。研究人员通过实验设计，筛选、优化了多肽-核酸制剂处方，结合不同的制备技术，成功地将多肽-核酸纳米粒制备成灵活适用于不同给药途径的制剂，显示出多肽载体广泛的应用潜力。  3.1 经皮递送  经皮给药在用药依从性、维持稳定血药浓度等方面具有诸多优势。目前促进经皮递送基因治疗制剂的方法包括电穿孔、超声、离子电渗、微针递送以及添加化学增强剂等 [34]。相较于其他方法，化学增强剂具有创伤小、操作简易、普及性广的特点。多肽材料有望被开发成为温和高效的化学增强剂以促进核酸药物的经皮递送，在皮肤疾病和美容医疗领域具有一定的应用前景 [35]。Chen 等 [36] 将细胞穿膜肽 SPACE（AC-TGSTQHQ-CG，又称 Disulfide Bridge 2-10）添加入 siRNA- 脂质体制剂处方，可促进 siRNA 渗透皮肤及递送转染。该制剂处方中，研究人员同时以 3 种方式掺入 SPACE 多肽，对比其他以单一形式引入 SPACE 多肽的处方，能够更好地促进 siRNA 多肽脂质体颗粒渗透皮肤和表皮。该研究一方面展现了多肽载体用于经皮递送的优势，另一方面为构建多肽-脂质-核酸复合纳米粒提供参考。 3.2 肺部递送  肺部吸入给药方式可以避开肝脏部位的首过 效 应（first-pass effect）， 药 物 直 接 进 入 血液循环，具有起效迅速、生物利用度高等特点。将核酸药物制成吸入制剂有利于实现简便、快速、有效的肺部核酸递送，对于防治呼吸系统疾病如流行性病毒感染等具有重大意义。目前研究已开发出一些适用于肺部给药的多肽核酸递送及吸入式处方 [37-39]。Munir 等 [37] 通过喷雾干燥技术（spray drying） 将 RALA 阳离子两亲性多肽（WEARLARALARALARHLARALARALRACEA）与质粒 pDNA 复合制成稳定、高效、可吸入的基因治疗粉剂，并通过正交实验设计，研究对比不同配方和工艺参数对多肽-核酸纳米粒尺寸、电势、包封率、稳定性、工艺产量等多方面质量指标的影响。该项研究通过喷雾干燥技术成功制备理化性能及生物功能稳定的 RALA-pDNA 粉剂，并报道了其中的配方和工艺参数优化筛选方案，展现了多肽载体的剂型多样性，为制备多肽纳米粒干粉提供实验参考和设计思路。  肺部组织的生理屏障包括负电荷黏蛋白的静电吸附作用、黏液构成的网状结构等，这需要递送系统拥有中性或电负性以降低与黏液的相互作用，或短暂性地破坏黏液网状结构以实现有效的药物渗透递送同时保证生物安全性。Kumari等 [38] 以阳离子细胞穿膜肽CRHC-2（CRRRRRHHHHHHHRRRRC）及两亲性多肽M9 （CRRLRHLRHHYRRRWHRFRC）作为载体，分别与质粒 DNA、siRNA 复合得到纳米核，并进一步在纳米核表面包裹甘露醇修饰的硫酸软骨素 A，旨在促进纳米粒穿透网状黏液层屏障（见图 2）。通过体外模拟黏液层穿透实验证实修饰包封后的多肽-核酸纳米粒在 4 h 内可快速穿透黏液层实现核酸转运，而简单混合核酸药物和甘露醇修饰的硫酸软骨素 A 并不能穿透黏液层。该项研究提供了一种增强多肽载体向肺部递送核酸药物的修饰策略，以期拓展多肽载体在肺部疾病中的应用。 3.3 口服递送  口服递送核酸药物要面对复杂的胃肠道环境，需要递送载体携带核酸药物能克服强酸性、多种活性酶降解等难题。Ibaraki 等 [40] 将多功能肽CH2R4H2C（序列为 CHHRRRRHHC）修饰的甲氧基聚乙二醇-聚己内酯聚合物（mPEG-PCL-CH2R4H2C）与 siRNA 复合得到多肽聚合物胶束用于口服治疗结肠炎。在体外模拟的胃酸环境（pH = 1.2）中，该多肽聚合物颗粒载荷的 siRNA 约有 90% 仍保持较好完整性，证明其良好的核酸压缩保护能力。在体内分布实验中，mPEG-PCL-CH2R4H2C 纳米粒在口服后 3 h 内即可快速富集停留于肠道，而在小鼠胃部无明显富集；无载体的自由药物在肠道富集效果相对较差，证明该多肽聚合物载体具有靶向肠道递送药物的潜力。此外，在小鼠结肠炎模型中，mPEG-PCL-CH2R4H2C-siRNA 纳米制剂显示出与阳性对照药物 5-氨基水杨酸相近的治疗效果，证明其治疗结肠炎的潜力，同时展现了多肽载体口服递送的可能性，也为口服核酸药物研究提供一定的参考。  3.4 鼻腔给药  研究发现，CPPs 可作为化学增强剂提高经鼻腔向大脑运输药物的效率。Samaridou 等 [41] 设计了一种基于多肽和聚合物的核酸递送纳米载体，旨在通过鼻腔给药手段促进 RNA 药物向大脑递送，并检验其在神经系统疾病治疗中的潜在用途。研究人员将修饰了十二烷酸的正电荷 CPPs 寡聚精氨酸（R8- C12）与 RNA 复合得到正电性的纳米核 NCPs，并进一步在纳米核表面分别修饰负电性的聚乙二醇聚谷氨酸嵌段聚合物（PEG-PGA）、透明质酸（HA）制备得到大小约为 100 nm 的均一复合物 ENCPs，室温条件下可保存长达 4 周。通过添加冻干保护剂可制成复溶稳定的干粉剂，ENCPs 显示出较好的储存稳定性及剂型多样性。同时，研究人员发现，聚合物表面修饰策略可以增强 ENCPs 的制剂稳定性和转染效率。通过鼻内给药的方式给小鼠注入载荷治疗药物 miR-132 的纳米粒，实时荧光定量多聚核苷酸链式反应检测证实 PEG-PGA 修饰的 ENCPs 能有效增加小鼠大脑海马体内的 mRNA 表达水平，展现出 ENCPs 鼻腔给药的适用性及脑部靶向递送潜力。此外，Samaridou 等 [41] 还进一步通过微流控技术优 化聚合物多肽-核酸纳米粒的配比、制备方法以及理化性质，为放大生产多肽-核酸纳米制剂提供一定的参考。 4 结语与展望 随着人们对疾病防治中核酸药物关注度和重视度的提升，对安全高效的核酸药物递送载体需求也日益增长。多肽载体因其天然、安全、多功能化等特点，在核酸药物递送领域展现出巨大的应用潜力。上文介绍了近年来用于递送核酸的多肽载体相关研究报道。一方面为多肽载体研发提供多方面的参考，包括序列功能化设计、表面修饰策略、工艺配方参数优化等；另一方面展现了多肽载体在序列设计、功能优化方面的多样性和可行性，在不同疾病和给药方式中的灵活应用潜力。然而，目前多肽载体在实际临床生产应用中仍处于起步阶段，未来开发设计及临床转化将面临诸多挑战。目前已报道的研究也揭示了未来多肽载体研发存在的问题及攻坚方向：1）目前多肽载体相比市售载体（如Lipofectamine ™ 2000）展现出一定的竞争优势，然而相关实验对比和数据报道仍较少，亟需深入、全面对比验证新型多肽载体与经典载体在理化性质、生物学功能等方面的区别和优势，以期加快推进多肽载体生产转化及临床应用。2）目前对多肽载体递送核酸药物的效果评估实验方案有多样化、全面深入化的趋势和需求。Feng 等 [26] 报道的多肽载体在3 种不同细胞中均有不低于 80% 的转染效率，显示出广泛普适性的同时也会引起人们对多肽载体特异性及脱靶问题的疑虑。基于单一细胞株的评估实验不能满足全面评估多肽-核酸纳米药物生化性质的需求，需要未来的研究工作进一步在多细胞实验、小动物活体实验水平进行深入的验证和分析。3）在临床转化前，需要对多肽-核酸纳米粒稳定性和安全性进行全面深入的研究。目前研究报道通过血清 / 核酸酶/蛋白酶孵育、肝素置换实验等手段模拟生理条件，验证多肽载体的尺寸稳定性及核酸分子的完整性。在安全性方面，许多研究报道了多肽载体在细胞实验水平具有低毒性和良好的安全性，显著优于市售载体。少数研究工作评估了多肽载体在小鼠活体内的免疫刺激反应，显示出无明显的促炎作用和体内应用潜力。然而，体外实验可能与体内真实情况有较大差距，未来相关研究应着力于进一步评估核酸药物与多肽载体复合物在体内的代谢分布、作用机制和效果。4）现有报道揭示了多肽载体的放大生产和剂型多样性，制剂配方、制备工艺参数等相关报道仍较少。本文综述近期用于核酸递送的多肽载体相关研究进展，以期引起更多医药工作者、研发生产者对多肽载体的关注研究和生产投入，开发出更多样、高效的核酸治疗制剂，为相关重大疾病的预防和治疗提供参考。 参考文献： [1] Gupta A, Andresen J L, Manan R S, et al. 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摘要:罕见病因其数量庞大和总体患病率而对社会发展造成重大影响。它们的异质性、多样性和特性为临床管理和治疗带来了巨大的挑战。在这篇综述中，我们讨论了基因治疗在罕见病临床应用方面的最新进展，重点关注了多种病毒和非病毒策略。我们将讨论腺相关病毒（AAV）载体的使用，特别是在Luxturna中，该药物已获准用于治疗视网膜上皮中的RPE65缺陷。Imlygic，一种单纯疱疹病毒载体，已获准用于治疗难治性转移性黑色素瘤，将是针对罕见癌症开发的溶瘤病毒载体的一个例子。Yescarta和Kymriah将展示逆转录病毒和慢病毒载体在自体体外生产嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）中的应用，这些细胞已获准用于治疗难治性白血病和淋巴瘤。类似的逆转录病毒和慢病毒技术可以应用于自体造血干细胞，如Strimvelis和Zynteglo，分别是腺苷脱氨酸-重症联合免疫缺陷（ADA-SCID）和β-地中海贫血的获准治疗方法。我们将通过Onpattro和Tegsedi，这两种针对家族性转甲状腺素（TTR）淀粉样变性的RNA干扰药物，以及Spinraza，一种用于脊髓性肌肉萎缩症（SMA）的剪接切换治疗，来突出反义寡核苷酸技术。通过Zolgensma，一种AAV血清型9载体，和Spinraza，我们可以对AAV和寡核苷酸疗法在SMA中的有效性进行初步比较。通过这些市场上的基因疗法和基因细胞疗法的例子，我们将讨论这些新技术在以前难以治疗的罕见病中的不断扩展的应用。 1.引言 这篇综述概述了目前用于治疗罕见病（RDs）的基因治疗策略。深入分析或全面概述RD领域超出了我们讨论的范围，但其他综述可供参考。尽管对RDs的定义各不相同，但决定性因素是低发病率，通常<0.05%。目前有近10,000种RDs，累积影响全球超过5%的人口，约4亿人，因此对全球健康造成了沉重的负担。它们的表型谱系极其多样化，从轻微的，例如遗传性巨舌症，到严重的，例如亨廷顿病舞蹈症或腺苷脱氨酸—重症联合免疫缺陷（ADA-SCID）。大约80%的RDs涉及遗传变异，并且通常对于每种疾病，存在多个不同的致病突变，这对疾病管理有着重要的影响。RDs还包括一些传染病，如巴贝西虫病，一种蜱传感染。RDs的医疗成本很高；它们可能是慢性的，通常具有毁灭性的后果，并且缺乏有效的治疗方法，通常转化为广泛而昂贵的症状管理，包括住院治疗。未确诊的RDs加剧了问题。没有确定潜在原因，管理患者症状是低效和无效的，恶化了结果并增加了医疗资源消耗。在发达国家，RDs占患者人口5%–7%的总直接医疗支出的约10%。疾病治疗的研究与开发无论患者数量如何都是昂贵和漫长的。对于有数百万患者基础的常见病，它们提供价值，并且可以由患者自己直接或间接资助。对于患者基础通常从几千到几十万，但可能低至一个患者的RDs来说，情况并非如此。RDs的治疗开发可能在商业上不可行，但RDs带来的痛苦和高昂的医疗成本，使得政府介入是值得的。例如，孤儿药指定状态在激励制药公司和促进创新方面发挥了重要作用。作为一组，RDs的性质在很大程度上排除了小分子治疗药物；异常或缺失基因的功能不易被其他分子替代。例如，伊马替尼用于治疗急性淋巴细胞性白血病（ALL）是例外。生物治疗药物如蛋白质补充可以提供解决方案，但往往无法完全恢复稳态平衡，只提供部分症状缓解。此外，一种生物制剂的开发从先前制剂的工作受益有限，它们的适用性并不普遍。血友病A，只影响一种蛋白质，并且可以用重组因子VIII有效治疗。对于47XXY（偶尔也是48XXYY）克林费尔特综合症，一种先天性X和Y染色体复制，这严重影响了全局基因表达模式。它的纠正超出了当前技术能力，只留下症状管理作为唯一的选择。相比之下，基于核酸的疗法非常适合治疗RDs，因为（i）核酸有效载荷是可互换的，因此平台和传递开发可以惠及许多不同的疾病领域；以及（ii）内部稳态平衡更有效地恢复，无论是永久性的还是暂时性的，这取决于使用的技术，以提供更大的保护，防止疾病造成的损害。简而言之，基因治疗承诺更有效的治疗方法和更高效的治疗发现过程。在这里，我们讨论了RDs的基因治疗的当前临床开发和实践。我们几乎只关注那些已经获得监管批准并正在用于受影响人群的治疗，将它们与传统治疗进行对比，并展示了它们的平台更广泛的适用性。 最初设想通过纠正有缺陷的基因来缓解或治愈疾病，基因治疗已经发展到包括几种治疗干预（图1）。遗传缺陷可以通过消除、减少或增加一个或多个蛋白质的表达，或通过创造具有改变功能的新型蛋白质（功能获得）来引起疾病。这些缺陷的规模从点突变到多核苷酸缺失或插入、基因拷贝数变异和核型变化差异很大。当前技术将基因治疗限制在单个基因缺陷上，但最近的进展有潜力纠正更大规模的异常。为了便于我们研究这个主题，我们将成功的基因治疗临床应用的讨论分为以下几类： 体内直接修改体细胞DNA。 在重新植入之前修改分化体细胞中的DNA。 在重新植入之前修改干细胞中的DNA。 使用核酸技术操纵转录后RNA处理和翻译。 图1 基因疗法领域的扩展。最初，基因疗法被设想为组织内细胞遗传信息的原位修改。该领域已经发展超越了这一点，涵盖了更多核酸技术方面，特别是寡核苷酸技术，该技术旨在修改基因表达，而不必改变细胞的遗传信息。在体外修改患者的细胞，然后在重新植入之前进行，已被证明是一种成功的临床策略。尽管最近的技术进步现在已经使得线粒体和生殖细胞或胚胎细胞基因疗法成为可能，但由于安全和伦理问题，这些方法尚未被使用。 2.体内体细胞DNA的直接修改 2.1.体细胞和有丝分裂后组织中的基因补充：Luxturna AAV基因补充治疗LCA2 基因功能性拷贝的缺失是高度分化组织（例如肺或眼睛）功能失调的常见原因，这导致RDs。这些情况适合于将功能性基因拷贝直接添加到目标组织的细胞中。这就是基因补充：将含有感兴趣基因的DNA传递到细胞核中，并确保其表达和持久性（见图2）。病毒可以被设计成强大的基因补充平台。基本前提是创建一个定制的病毒基因组，将感兴趣的基因替换病毒基因，并人工将其包装成病毒颗粒。这些病毒颗粒可以转导细胞并传递目标基因，但不能复制或引起疾病。作为例子，我们将看看病毒载体技术在遗传性视网膜病变中的最近成功临床应用。 图2 常见的基因补充策略。(A) 一个感兴趣的基因（GoI）可以被整合到染色体断裂中，这可能会破坏一个现有的基因，因为插入点可能是随机的。包括整合性病毒载体（RV，逆转录病毒载体；LV，慢病毒载体）和转座子的例子。(B) 新遗传物质作为染色体外元素的持续存在。腺相关病毒（AAV）、腺病毒（Ad）和缺乏整合能力的慢病毒载体（IDLVs）是常见的例子。没有基质附着区域和指导复制的序列，染色体外元素会通过细胞分裂而被稀释掉。(C) 同源依赖修复（HDR）涉及宿主序列的有针对性的替换。这是最安全的方法，但也是最难利用的。 视网膜色素上皮特异性65-kDa蛋白（RPE65）是视觉周期中11-顺式视黄醛再生的关键酶（见图3）。没有RPE65，11-顺式视黄醛就会耗尽，使光感受器无法工作，而代谢途径中的其他中间体积累到可能的有毒水平。RPE65突变导致一系列遗传性视网膜病变，这些病变导致出生时或非常早期儿童期就失明。最常见的表型是Leber先天性黑蒙和视网膜色素变性，但根据RPE65遗传缺陷，也可能有其他更罕见的表型。目前，除了基因疗法之外，无法实现患者眼中的RPE65功能的替代，并且是吸引基因疗法的目标（见图3）。密集的研究和开发努力最终导致了Voretigene neparvovec的开发，这是一种腺相关病毒（AAV）RPE65基因替代平台。2017年，它被美国食品药品监督管理局（FDA）批准，商品名为Luxturna，用于治疗2型Leber先天性黑蒙（LCA2）。 图3 杆细胞中的视觉循环。视觉信号是由视蛋白蛋白在11-顺式视黄醛（RAL）的帮助下产生的，它吸收光，变为全反式视黄醛，并在此过程中激活视蛋白。全反式视黄醛不再对光敏感，需要转换回11-顺式RAL。这种转换不是由杆细胞本身进行的，而是由支持性的视网膜色素上皮（RPE）完成的。全反式RAL从视蛋白中释放出来，由于它能够穿透细胞膜，它在特殊的载体蛋白（视盘间视黄醇结合蛋白，IRBP）的帮助下被运输到RPE，在RPE中一系列专门的酶催化这一转换。11-顺式视黄醛产物被运输回杆细胞。RPE酶的代谢缺陷阻碍了11-顺式视黄醛的转换，并导致各种中间体如视黄醇（ROL）酯的积累，这些中间体可能达到有毒水平。通过血液从外部供应11-顺式视黄醛和清除中间体并不足以维持视力。 腺相关病毒是一种非致病性共生细小病毒，其生物学特性使其适合作为基因疗法平台（见图4）。它不能自发地退出潜伏阶段并开始其溶解周期，除非被另一种病毒感染。自然AAV基因组能够在染色体19上的特定位点进行优先位点特异性整合，但也可以作为细胞核中的染色体外元素（作为染色体外元素）长期维持。人类有12种不同的自然AAV变体（称为血清型），每种都有独特的衣壳类型，控制它们的嗜性，即它可以感染的细胞类型。这些变体共同赋予AAV非常广泛的嗜性，可以通过使用非人类和基因工程变体进一步扩展。 图4 腺相关病毒（AAV）的生命周期。AAV通过受体介导的内吞作用进入细胞，然后破坏内体，逃到细胞质中。衣壳解体，同时将病毒基因组传递给核孔，促进核进入。在细胞核内，AAV基因组是单链的，利用反向末端重复序列（ITRs）变成双链。如果没有伴随的辅助病毒，AAV会进入休眠状态，倾向于以一种需要AAVS1基因组序列的位点特异性方式整合到19号染色体上的MBS85位点。辅助病毒的再次感染重新激活了AAV，允许它复制其基因组并表达其溶解阶段蛋白。辅助病毒使细胞裂解有助于AAV逃离细胞。 通过用称为反向末端重复序列（ITRs）的病毒序列包围一个能够产生感兴趣转录本的转基因表达盒来创建AAV载体。ITRs允许病毒结构蛋白将转基因盒包装成病毒颗粒。这些工程化病毒颗粒通常通过在细胞中表达ITR-转基因盒来生产，这些细胞也被用来表达病毒结构基因，来自表达载体而不是病毒骨架。提供结构基因的转录，只有ITR-转基因作为基因组，允许包装ITR-转基因，而不包括病毒颗粒中的任何结构基因，因此在过程中产生活病毒的风险要低得多。通过移除结构基因，AAV载体可以转导以传递转基因，但不能复制并创造新的病毒颗粒。通常，在包装过程中不提供AAV基因组位点特异性整合所需的基因，并且载体中不存在。因此，AAV载体缺乏位点特异性整合的能力，依赖于染色体外维持，大大减少了它们的潜在遗传毒性。染色体外维持的缺点是在复制细胞中病毒基因组的快速丢失，限制了AAV用于体细胞有丝分裂后细胞的效用。AAV载体的一个重要限制是包装能力。AAV包装的大小限制大约为5kbp，这是病毒载体系统可以提供的低端（即慢病毒载体可以携带8kb插入物，高容量腺病毒载体可以包括37kb）。考虑到需要包括的所有元素（例如启动子、增强子、调控域），这是一个重要的限制。这种大小限制对于使用自互补策略的第二代AAV载体尤其突出，但我们将与5.3节中的自互补AAV载体的例子一起讨论。AAV载体系统的一个关键优势是血清型转换，以改变载体嗜性。血清型转换涉及使用最有效的AAV变体的衣壳来转导目标细胞群体包装载体。 直到最近，LCA2既无法治愈也无法治疗。Luxturna的批准为LCA2以及其他许多以前无法治愈的视网膜病变带来了新的希望。Luxturna是一种基于AAV2的重组、非整合载体，旨在传递RPE65基因（见图5）。在临床试验中，Luxturna通过玻璃体下注射到双眼，间隔6-18天。接受Luxturna治疗的患者在治疗后1年显示出视力的显著和持久改善。视野和感知光线的能力也有了显著提高。值得注意的是，早期1期和2期试验的患者保留了这种改善3年或更长时间。这样的变化可以对受影响人的生活质量产生巨大影响，使他们从近乎失明到部分视力。 图5 Luxturna载体设计和治疗方案。Luxturna是通过将RPE65的表达盒包装进AAV2衣壳中生产的。从转染相关质粒的细胞中收集RPE65载体病毒，进行纯化，然后将高滴度的载体制剂直接注射到视网膜下空间。载体将向外扩散，并将基因插入视网膜色素上皮的大区域，创建一个新的11-顺式视黄醛来源。11-顺式视黄醛循环的跨细胞特性允许效果更广泛地传播到整个视网膜。该盒设计包含具有所有三个外显子和两个内含子的基因组RPE65序列。通过将鸡β-肌动蛋白启动子与巨细胞病毒（CMV）增强子连接，创建人工启动子/增强子对，并使用人工聚腺苷酸序列，确保了高效高水平的表达。该盒由AAV2 ITR序列所环绕。 Luxturna的成功为先天性视网膜病变和其他遗传性眼病验证了一种全新的治疗途径。实际上，RPE65突变只占遗传性视网膜病变的一小部分。Luxturna激发了针对眼睛的基因治疗产品的临床开发的爆炸性增长。结果应该在2020年代中后期开始显现。 2.2.固体肿瘤的基因治疗：Imlygic和HSV基因补充治疗黑色素瘤 癌症是一种遗传病，其极端的异质性使其成为RD领域的一个虚拟微观世界。总的来说，癌症很常见，但由于有这么多不同类型的癌症，个别类型可能是罕见的。高度可变的发病机制和对常规治疗的抵抗力意味着个性化医疗非常具有挑战性，但也是一项关键的优先事项。基因治疗提供了一个有吸引力的建议：利用特定癌症内的特定缺陷，创建选择性对那种癌症有毒的工程病毒载体。然后，该技术可以很容易地重新用于针对其他癌症类型。 黑色素瘤是英国第五种最常见的癌症，发病率约为每10万人25例。50它非常具有侵略性，原位黑色素瘤迅速发展为转移性疾病，此时存活率急剧下降。50Talimogene laherparepvec（Imlygic）是一种许可的单纯疱疹病毒-1（HSV1）基因治疗黑色素瘤的治疗方法。单纯疱疹病毒的生命周期见图6。单纯疱疹病毒依赖于关键的毒力因子，这些因子扰乱干扰素I途径和抗原呈递以逃避免疫并引起疾病（见图6）。 图6 单纯疱疹病毒的生命周期。单纯疱疹病毒通过其包膜与细胞膜的受体介导融合进入细胞。病毒基因组被注入到细胞核中，在那里它循环化以便于同时进行复制（通过滚环机制）和病毒基因转录。线性病毒基因组副本被运送到细胞质中，并与新合成的衣壳蛋白相互作用。完整的病毒颗粒在内质网（ER）内的囊泡中被内化，由插入到ER膜中的病毒包膜蛋白引导。带包膜的病毒在ER内被运输到内体，最终通过胞吐作用释放出来。 两种病毒蛋白在阻断宿主对病毒的反应中很重要。ICP47阻止病毒颗粒肽被装载到MHC I类分子上，阻碍细胞毒性T细胞的识别。ICP34.5阻止蛋白激酶R（PKR），破坏了干扰素途径对病毒的反应。 在癌症中，特别是黑色素瘤中，相同的过程通常存在缺陷。Imlygic缺乏这些毒力因子，削弱了它感染正常细胞的能力，但使癌细胞极易受到攻击（见图7）。两个额外的修改增强了Imlygic的抗癌效力：病毒在复制期间表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），并且无法进行溶原性，立即激活致命的溶解周期（见图7）。 图7 Talimogene laherparepvec（Imlygic）的总体设计。单纯疱疹病毒基因组有两个长反向重复序列（末端和内部，TRL和IRL）和两个短反向重复序列（IRS和TRS）。它还有一个长独特片段（UL）和短独特片段（US）。在Imlygic中，裂解周期基因的启动子被改变以立即激活，阻止溶原状态，ICP34.5被GM-CSF替换，ICP47被删除。Imlygic只能在癌细胞中有效复制，癌细胞中的干扰素途径和抗原呈递受损。复制裂解癌细胞并产生GM-CSF，增强对肿瘤的免疫破坏。 Imlygic在针对III-IV期黑色素瘤的临床试验中表现良好，这些黑色素瘤对手术无效。它增加了实现持久疾病缓解的患者比例，在60个月时将无病生存率提高了50%。尽管Imlygic对晚期IV期黑色素瘤无效，但它将IIIB/B和IIIB-IVM1的总体生存率提高了一倍以上。值得注意的是，几乎所有实现完全缓解的患者在接受5年随访时仍然无病。此外，发现Imlygic与检查点抑制剂显示出显著的协同作用。 3.在重新植入前对分化的体细胞DNA进行修改 3.1.体外基因疗法的优势和挑战 体外基因疗法是在体外对细胞进行遗传修饰，然后进行移植。这些细胞可能是分化的体细胞或干细胞/祖细胞。这种体外方法的主要优点包括选择性地针对感兴趣的细胞群体，避免免疫防御，以及在基因修饰细胞重新植入之前实施质量控制系统。在本节中，我们将重点关注保留足够复制能力以允许提取、体外修改和重新植入的分化体细胞。 3.2.体外基因疗法的逆转录病毒载体：嵌合抗原受体（CAR）T细胞 逆转录病毒是包膜的单链RNA病毒，其生命周期涉及将它们的RNA基因组转换为双链DNA，并稳定地整合到宿主基因组中。它们的RNA含量的外壳被来自宿主细胞质膜的脂质双层包围，包含包膜蛋白，一种跨膜宿主细胞入侵因子。γ-逆转录病毒66和慢病毒最常用作病毒载体。图8显示了逆转录病毒/慢病毒生命周期的简要总结。逆转录病毒使用称为长末端重复序列(LTRs)的特殊序列来指导它们的基因组包装到病毒颗粒中。LTRs包含促进病毒生命周期中几个步骤的信号，并作为强大的启动子。逆转录病毒载体是通过提供病毒结构蛋白的转录来制造的，从而直接将转基因插入宿主基因组。尽管整合是普遍的，但并不随机，已有整合模式的报道。例如，HIV偏好活跃的转录单元，但在基因上整合的频率相似。尽管整合的普遍性可能存在问题，但它也确保了有效载荷将被插入活跃的染色质区域。慢病毒与其他逆转录病毒相比提供了额外的优势。它们可以跨越完整的核膜转位它们的基因组，并且不需要等待细胞分裂才能访问宿主基因组进行整合。慢病毒载体因此可以转导静止细胞。 图8 逆转录病毒生命周期。逆转录病毒和慢病毒通过其包膜与细胞膜的受体介导融合进入细胞。在细胞质中，病毒衣壳解体，基因组RNA（gRNA）通过逆转录酶（RT）转化为双链（dsDNA）基因组。dsDNA基因组要么通过病毒蛋白通过核孔运输（慢病毒），要么在细胞分裂时进入细胞核（γ-逆转录病毒）。在细胞核中，发生循环化和染色体外持久性或直接整合到宿主染色体中。整合的dsDNA产生病毒转录本和gRNA基因组。病毒颗粒在细胞质中组装。插入到质膜中的包膜蛋白引导组装的核衣壳从细胞中出芽并获取病毒膜包膜。 急性淋巴细胞性白血病(ALL)是一种影响儿童的淋巴细胞祖细胞的恶性肿瘤。它与关键癌基因（如PAX5和TCF3）的一系列染色体易位相关，在某些情况下，还有功能的增益突变，如BCR-ABL1（费城易位）和ETV6-RUNX1重排。ALL的发病率估计为每百万10-20例。与许多其他遗传性癌症不同，ALL在生命中早期发展，使其成为最常见的儿童癌症之一。B细胞前体恶性肿瘤占ALL的大部分。 化疗的进步和对ALL中突变破坏的信号网络的理解，已经导致了相对有效的化疗方案的发展，但不幸的是，当患者在治疗后复发或更糟糕的是，最初的反应很差时，预后通常很差。 非霍奇金淋巴瘤(NHL)是影响头颈部淋巴组织的更常见的淋巴组织来源的癌症之一。它包括一个高度异质的恶性肿瘤群体，在欧盟的发病率大约为每10,000人中有1人。弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)占NHL发病率的四分之一到三分之一，且极具侵略性。已经鉴定出NHL的家族形式。像ALL一样，通常有有效的治疗选择可供NHL使用，但难治性DLBCL的预后非常差。 开发针对CD19的人工T细胞受体(TCRs)，这是大多数B细胞淋巴瘤中强烈表达的B细胞前体的表面标记物，是一项革命性的进展（见图9）。这些嵌合受体是通过将TCR的信号装置与来自共刺激分子的部分以及针对目标蛋白的结合位点（在这种情况下是CD19）连接在一起而构建的。抗CD19 CARs将T细胞人为地靶向到B细胞。CAR信号步骤与实际TCR信号不同，根据使用的共刺激分子的类型而变化，形成的免疫突触是非典型的。尽管如此，产生的信号足以模拟T细胞受体信号，使修饰的T细胞能够攻击和摧毁表达CD19的目标，同时绕过人类白细胞抗原(HLA)限制。 图9 嵌合抗原受体（CAR）设计。人工T细胞受体（TCR）以模块化方式制造，由以下部分组成：TCR的CD3ζ信号域、跨膜和铰链区域，以及需要用于TCR信号传导的受体（如CD8、CD28和4-1BB（CD137））的共刺激域，以及针对目标蛋白的单链可变片段（scFv）。这创建了一个受体，能够在scFv目标结合时产生完整的TCR信号。CAR被认为是通过二聚化或多聚化激活的，允许一个CAR分子的信号域与另一个CAR分子的共刺激域交叉相互作用。这推动了CAR的激活，创建了一个CD3信号，并激活了其他辅助受体，特别是IL2受体。 自体CD19-CAR T细胞在治疗难治性NHL和ALL方面表现出了高效性。最早两个为此目的批准的产品是tisagenlecleucel（Kymriah）和axicabtagene ciloleucel（Yescarta）。Kymriah是使用4-1BB共刺激域以及CD8alpha跨膜和铰链区域的CD19-CAR工程T细胞制剂。从自体血液分离的CD3阳性细胞（CD4和CD8 T细胞）通过慢病毒载体转导，携带由Elongation Factor-1启动子驱动的CD19-CAR转基因。经过筛选和扩增后，CAR-T细胞被重新输回经过淋巴细胞耗竭治疗的患者体内。Yescarta的制备方式类似，但它使用CD28跨膜/铰链区域和共刺激域代替CD8alpha/4-1BB。该载体是逆转录病毒，由小鼠干细胞病毒（MSCV）启动子驱动。Kymriah被许可用于治疗难治性ALL和NHL/DLBCL，而Yescarta仅被许可用于难治性NHL/DLBCL。它们都有助于推动超过50%的显著缓解率，而传统治疗在很大程度上是无效的。它们还可能有严重的副作用。细胞因子释放综合征是一种可能危及生命的并发症，能够通过IEC（免疫效应细胞）相关神经系统综合征或ICANS损害包括神经系统在内的几个主要器官。第二种独特的并发症是可预测的β细胞消融和血免疫球蛋白水平的崩溃。这可能会使患者易于感染，必须进行管理以降低风险。 CAR-T技术在血液癌症中的成功引领了对可能应用于实体瘤的大量研究，这是一个更具挑战性的环境。现在，癌症的基因疗法应用约占正在开发中的基因疗法治疗的一半。 4.在重新植入前对干细胞DNA进行修改 一种替代的体外方法针对的是干细胞/祖细胞，这些细胞是器官自然维持的基础。这种策略特别适合于血液遗传缺陷的纠正，它建立在骨髓移植的临床经验之上。为了说明这种方法的有效性，我们将看看两种临床批准的治疗，针对影响血细胞的遗传疾病，Strimvelis用于ADA-SCID和Zynteglo用于β-地中海贫血。 4.1.重症联合免疫缺陷：Strimvelis HSC基因疗法 重症联合免疫缺陷是一组遗传性疾病，导致T淋巴细胞功能完全或几乎完全受损，与其他免疫细胞类型的原发性或继发性功能障碍相结合。SCID谱系非常罕见，大约每60,000例活产中有1例。T淋巴细胞的复杂性解释了SCID的广泛遗传异质性。目前已知有16个致病基因和20多种独立的缺陷。最常见的突变在X连锁IL2受体组分中（SCID-X1）。 腺苷脱氨酸-重症联合免疫缺陷是另一种常见形式，也是最具破坏性的。腺苷脱氨酸酶对于调节嘌呤核苷酸平衡的嘌呤救捞途径至关重要。ADA活性在防止腺嘌呤核苷酸积累方面很重要。缺乏ADA会导致dNTP池的显著失衡，损害DNA聚合酶的功能。在快速或持续增殖的细胞中，结果是基因毒性休克和凋亡，淋巴细胞分化途径对ADA缺乏特别敏感。ADA缺乏还影响cAMP合成，破坏一般细胞信号传导，并在大多数其他组织中引起更广泛的病理学，包括大脑。 腺苷脱氨酸-重症联合免疫缺陷可以通过同种异体造血干细胞（HSC）移植和聚乙二醇化ADA（PEGADA）治疗。PEG-ADA具有长的血浆半衰期，可以帮助降低细胞内腺嘌呤积累，通过保持细胞外水平低并促进转运体介导的外流，缓解一些最严重的症状。骨髓移植受到HLA匹配供体的可用性和同种异体供体移植物抗宿主病（GVHD）的风险的限制。 欧洲药品管理局（EMA）已在欧盟（EU）许可ADA-SCID的基因治疗选择。Strimvelis是一份工程化的自体HSC制剂，用于表达功能性ADA。从受影响的人中分离出CD34阳性HSC细胞，并使用可溶性介质鸡尾酒扩增：FLT3L、KITL/SCF、THPO、IL3和IL6（FKT36）。在这种增殖状态下，细胞通过使用小鼠摩尔莫尼白血病病毒载体转导功能性ADA副本，其4070A包膜基因，针对Pit-2并介导HSC的有效转导。转导后的HSC池在非清髓性条件下调后重新输回，使用抗增殖剂如白消安抑制内源性HSC的增殖。 Strimvelis在临床试验中表现非常出色。对18名接受Strimvelis治疗的人的随访显示，他们全部存活（随访2-13年，中位数7年），并且他们足够健康，能够恢复正常的社会交往。几名患者能够返回学校。在可评估的患者中，ADA表达达到或超过正常水平的10%，并在所有髓系和淋巴系细胞中保持稳定，免疫功能成功重建，可以观察到对抗原挑战的反应。感染率显著降低，接受者在大多数情况下能够解决感染。几乎所有情况下都可以停止PEG-ADA治疗。无干预存活率保持在80%以上。这些结果与自体HSC移植相匹配，并且与其他所有治疗方法相比非常有利。 成功的T细胞群体重建并不能消除ADA-SCID的全部健康影响，因为它不能替代非造血系细胞中的ADA功能，但它有效地提供了（通过在红细胞中表达）现成的血浆ADA池，可以发挥与PEG-ADA相同的功能。同时，它消除了供体匹配HSC移植的供应问题以及与同种异体移植相关的风险（例如GvHD）。 4.2.使用Zynteglo HSCs的β-地中海贫血基因疗法 β-地中海贫血是最常见的遗传性贫血之一。它是常染色体隐性遗传，分布高度可变。在疟疾目前流行或近期流行的地区，其患病率接近1/1000活产儿，但在其他地方非常罕见。全球患病率接近1:100,000活产儿。 疾病表型取决于HBB（成人β-珠蛋白）基因中确切的遗传缺陷，这是血红蛋白的一个亚基。纯合子继承一个不产生功能性蛋白的等位基因会导致β-地中海贫血重度和严重的危及生命的贫血。纯合子继承一个功能部分丧失的突变会导致β-地中海贫血中间型和较轻的疾病。 β-地中海贫血具有贫血的所有典型特征，包括疲劳、虚弱和心悸。重度疾病还会导致肌肉萎缩、骨骼和软骨畸形、骨质疏松症和脾肿大。定期输血可以解决这些症状中的大部分，但它们通常也会导致铁过载，从而导致心脏、肝脏和内分泌并发症。 最近，一种体外基因疗法方法，Zynteglo被许可用于治疗重度、输血依赖性、β-地中海贫血。患者接受G-CSF和CXCR4/SDF-1拮抗剂治疗，这导致从骨髓大量增殖和动员HSCs进入血液。 从血液中收集CD34阳性HSCs并在实验室中用包含突变HBB（T87Q）的BB305慢病毒载体进行转导。BB305慢病毒载体具有自灭活设计，去除了LTR的转录活性。它包括整个HBB编码序列及其原生控制元素：β-珠蛋白启动子，其3′增强子和来自上游位点控制区的选定片段，促进高水平表达。T87Q变体赋予增强的抗镰状细胞活性，可以通过色谱法区分，作为生物标记物。患者在输注校正的HSCs之前用抑制骨髓增生的药物进行调理。 像Strimvelis一样，Zynteglo在临床试验中非常成功。大多数患者的血红蛋白水平长期改善，能够停止输血。大多数患者超过一年评估，血红蛋白水平接近正常化，无需输血。 5.通过操纵转录后RNA处理和翻译的基因疗法 基因表达水平可以在转录后使用能够干扰剪接、翻译或RNA降解的合成核酸分子进行调节，而不需要直接改变细胞的遗传物质（见图10）。由功能增益突变引起的疾病特别适合这种干预方法。 图10 真核细胞中基因表达的转录后控制。第一个控制点是在剪接过程中。真核细胞的剪接是由一系列剪接位点元素和因子控制的，同一个基因可以产生多个产物。细胞表达的剪接因子决定了剪接变体的平衡。成熟的RNA进一步通过降解来调节。一个特殊的蛋白质复合体识别双链RNA，然后将其作为模板来降解匹配的mRNA分子。这种机制（RNA干扰）允许细胞通过产生特殊的RNA分子（微小RNA或miRNA）来微调基因表达。剪接和RNA干扰可以通过人工寡核苷酸来控制。最后一个控制点是与核糖体结合和翻译启动。 通过RNA干扰控制细胞内的RNA水平，使用内源性（例如miRNA）或外源性（例如siRNA）双链RNA模板，针对特定的mRNA序列进行降解。人工合成的RNA分子（短发夹RNA，是人工miRNA模拟物）可以用来利用这个系统，选择性地针对mRNA分子进行降解（见图11）。 图11 寡核苷酸对基因表达的控制。(A) siRNA是由两个互补的20-21个核苷酸链组成的双链RNA分子，设计用于在退火后在3'端留下1-2个核苷酸的悬垂。Dicer蛋白复合体处理siRNA，并根据它们的物理性质结合一条链并降解另一条。任何能与选定链配对的mRNA序列都会被降解。人工siRNA分子被设计来强制选择非编码链。(B) 另一种设计是gapmer反义寡核苷酸（gASOs），由一个DNA核心和人工核苷酸组成。人工核苷酸对核酸酶具有抵抗力，并且对RNA具有高亲和力。当gapmer ASO与其靶RNA退火时，DNA核心形成一个DNA/RNA异源双链，从而招募RNaseH并标记目标RNA进行降解。gASOs对核酸酶的抵抗力允许其在细胞质中持久存在并产生持久的反应。 反义寡核苷酸（ASO）是设计用来与细胞内特定RNA目标配对的短核酸序列。通常，ASOs由具有增加稳定性的修饰核苷酸组成，经常包括人工核苷酸类似物，如吗啉和锁定/桥接核酸。ASOs可以以多种方式操纵mRNA的转录后命运，但这里我们将主要关注RNase H靶向（见图11）。剪接切换寡核苷酸（SSO）旨在与pre-mRNA序列中的剪接位点或剪接增强子/抑制子配对，并指导目标基因的替代剪接。RNA ASOs设计用来与5′或3′非翻译区（UTR）内的序列配对，可以抑制或增强mRNA翻译。 在这里，我们将讨论一些关键的RNA干扰和基于SSO的治疗示例，这些治疗最近已经通过临床试验，现在被用于治疗罕见病。特别是，我们将看看家族性转甲状腺素淀粉样变性（FTA）和脊髓性肌肉萎缩症（SMA）。 5.1.家族性转甲状腺素淀粉样变性：Onpattro RNAi和Tegsedi ASO 家族性转甲状腺素淀粉样变性是一种罕见的遗传性疾病，涉及转甲状腺素（TTR）基因，导致蛋白质错误折叠。错误折叠的蛋白质形成淀粉样物质，沉积并损害组织。这是一个缓慢渐进的过程，因此症状通常在成年后开始。确切的发病年龄是可变的，并且与疾病的进展有关。外周神经系统特别容易受损，因此神经病变是早期症状之一，但随着疾病的进展，眼睛、肾脏、心脏和中枢神经系统通常也会受到影响。FTA最终是致命的，平均在症状出现后10年内，发病年龄越小，疾病越具侵袭性。早期心脏受累的患者的预后极差。很少有患者能存活超过5年。 从遗传学上讲，FTA突变是常染色体显性遗传，但进展和外显率取决于确切的遗传缺陷。大多数患者是杂合子。FTA的全球患病率大约是1/10,000，尽管在某些种族群体或人群中观察到聚集，如葡萄牙、瑞典、日本和西非的某些地区。 目前治疗FTA的金标准是肝脏移植，因为肝脏是TTR的主要来源。肝脏移植可以阻止多发性神经病的发展，减慢但不能完全防止眼睛、心脏和肾脏的进行性退化。 在过去几年中，FDA批准了两种基于寡核苷酸的治疗药物用于FTA：Patisiran（Onpattro）和Inotersen（Tegsedi）。Onpattro是一种稳定的核酸脂质颗粒（SNALP）配方，含有针对TTR的短干扰RNA（siRNA—见图11）。Onpattro是新一代siRNA，使用DNA悬垂（dTdT）而不是RNA（UU），增加RNA抵抗力，效果更持久。此外，Onpattro在正义链上的大部分U和C残基被甲基化，以促进siRNA的正确链被纳入RISC（RNA诱导的沉默复合物）组装。Onpattro旨在靶向TTR转录本的3′非翻译区（UTR），并将抑制突变型和野生型形式的表达。这是可取的，因为一旦形成错误折叠的聚集体，它们可以诱导甚至野生型蛋白的错误折叠和沉积。Onpattro SNALP的配方由胆固醇和磷脂的1:1混合物组成。磷脂具有强烈的正电荷（阳离子与中性的比例为4:1），以促进与siRNA的复合物形成。使用的阳离子磷脂中有5%附有PEG2000（聚乙二醇2000MW）聚合物，形成鞘层，大大延长了SNALP的血浆半衰期。血浆中的脂质纳米颗粒通常被ApoE修饰，尽管有PEG鞘层，并且只在具有筛状内皮的组织中有效渗出；因此，它们自然靶向肝脏。在ApoE导向的内化后，SNALP与带负电荷的内体膜之间的正电荷相互作用，介导内体逃逸，将siRNA传递到细胞质中。SNALP的长半衰期和RISC组装的持久性，允许效果持续数天。 Onpattro在抑制TTR表达方面非常有效。在临床试验中，发现表达在5天内减少超过70%，并至少在20天内保持在这个水平以下。每3周输注一次Patisiran，持续18个月，几乎所有实现持续TTR抑制的患者都停止了疾病的进展。在疾病的多发性神经病和心肌病方面也观察到了小但显著的改善。对Onpattro的不良反应主要与脂质体配方的输注有关。严重的不良反应很少见。 Tegsedi是一种依赖RNaseH的GAPmer ASO配方（见图11），也针对TTR 3′UTR。内部DNA核心具有磷酸硫酯键，使其具有很强的抗降解能力，但也可能导致毒性。为了掩盖磷酸硫酯的毒性，中心核心两侧各有一个由五个2'-O-甲氧基乙基核苷酸残基组成的区域，这些残基也具有抗降解性。整个20-mer寡核苷酸与TTR 3′UTR中的目标序列互补，并且足够稳定，可以通过肌肉注射盐水制剂的方式输送，而不需要脂质体配方。ASO进入循环系统，并被各种组织中的细胞积极吸收，肝脏是主要场所。在临床试验中，患者在第一周接受了三次Inotersen注射，然后每周注射一段时间，持续64周。在第一周末，血浆TTR水平降低了约70%，并在整个64周期间保持在这个水平。像Onpattro一样，Tegsedi在整个治疗期间有效地停止了疾病的进展，尽管不同患者群体之间存在差异。 控制基因表达水平在关闭功能增益突变体方面至关重要。像其他基于核酸的疗法一样，一旦输送方法被优化，它可以被重新用于任何有效载荷。例如，研究脂质体siRNA输送为BioNTech和Moderna的SARS-CoV2 mRNA疫苗铺平了道路。 5.2.脊髓性肌肉萎缩症：Spinraza剪接切换寡核苷酸 脊髓性肌肉萎缩症是儿童遗传死亡的最常见原因，大约每10000例活产中有1例。它是由运动神经元存活1（SMN1）基因的失功能突变引起的。它是常染色体隐性的，表型的严重程度与高度相关的，但只有部分功能的SMN2基因的拷贝数和表达水平成反比。SMA是一种系统性疾病，由于SMN在全身表达，但下运动神经元对SMN功能的丧失特别敏感。 SMN2与SMN1有几个核苷酸的差异。关键是它以不同的方式进行剪接，通常有85%-90%的转录本通常跳过外显子7。截断的蛋白质异构体不稳定，迅速降解。SMN2在开发SMA的基于寡核苷酸的治疗中被证明是关键。Nusinersen（Spinraza）是一种SSO，旨在防止SMN2基因产物中外显子7的切除，从而增加全长、稳定的SMN蛋白的产生。20-mer SSO寡核苷酸由2'-O-甲氧基乙基（2MOE）核苷酸组成，这些核苷酸抵抗降解，更有效地配对，增强内含子剪接沉默子-N1（ISS-N1）的抑制。这种寡核苷酸直接通过腰穿注射到脊髓中。最初，给予少量频繁的注射以快速建立稳态，然后是更不频繁的维持剂量。在最近的临床试验中，调理方案是每两周三次剂量，然后是每4个月一次的维持方案。Spinraza在婴儿期发病的SMA（类型I）中证明非常有效，在生存和运动里程碑的实现方面取得了显著的改善，一些婴儿发展了在这种疾病的自然史中从未见过的技能。不良事件的发生率很高，但大多与这个脆弱的患者群体中复杂的脊髓注射程序有关。 Onpattro、Tegsedi和Spinraza等例子代表了寡核苷酸治疗领域的重要的里程碑，它们展示了在没有稳定遗传修饰的情况下，对基因表达进行持续、有效、直接控制的可能性。 5.3.寡核苷酸与病毒载体基因疗法的比较：Spinraza与Zolgensma Spinraza存在一个病毒载体基因疗法的替代品，这提供了一个独特的机会，可以直接比较这两种方法的有效性。Zolgensma（Onasemnogene Abeparvovec）是一种基于AAV的基因补充治疗，旨在通过单剂量直接和永久地恢复SMN1表达。Zolgensma表达盒的设计类似于Luxturna（见图5），使用混合的CMV-鸡β-肌动蛋白启动子来驱动SMN1 cDNA的表达。为了增强表达，设计中包含了一个人工内含子（来自SV40）和密码子优化。AVXS-101（Zolgensma的载体）的序列是专有的，确切的优化不在公共领域，但是通过使用类似的AAV9平台，已经证明了这种方法的有效性。采用了自互补设计（见图12），其中一个侧翼ITR是一个特别设计的变体，用于合成基因组二聚体，而不是单体。这种设计的优点在于它可以加速转基因表达，无需DNA合成，这可能是单链AAV载体的限速步骤。 图12 自互补AAV载体的生成。可以通过使用突变的ITR（蓝色，右图）来产生表达动力学更快的AAV变体，以破坏末端解决。因此，两条链未能分离，而是通过突变的ITR连接在一起。完整的病毒基因组仍然由正常的ITRs所环绕，因此它可以被复制和包装。一旦在宿主细胞中释放，两条链可以重新结合形成标记为(*)的结构。这种结构不依赖于第二链合成在细胞内稳定它并启动转基因表达。 Zolgensma在临床试验中表现非常好，显示出高反应率和显著的症状缓解。在SPR1NT 3期试验中，所有14名参与者都达到了无需辅助坐立的主要终点，其中11名和10名分别能够站立和行走。23名未接受治疗的SMA患者中没有一个达到这些发育里程碑。令人印象深刻的是，相当数量的儿童（根据终点不同，40%-80%）在规定的发育时间内达到了里程碑。运动评估显示，所有儿童在给药后迅速改善，并达到了正常分数的至少80%。通常，SMA儿童平均只达到正常分数的40%，并且随着年龄的增长，他们的分数会下降，而不是提高。所有儿童在研究期间都避免了机械通气的需要，13名儿童不需要辅助喂养。其他研究也证实了这些收益是持久的。这些结果与Spinraza相比是有利的。 实际上，Bitetti等人研究了之前接受Spinraza治疗的儿童，发现Zolgensma帮助儿童取得了进一步的收益，对Spinraza反应较差的儿童受益最大。这种改善反应的一个重要因素可能是Zolgensma提供的全身治疗，而Spinraza是通过鞘内注射给药，预期的直接有益效果应限于CNS。 尽管目前证据表明，与Spinraza相比，Zolgensma具有更高的疗效和反应率，但使用AAV9已经出现了安全问题。观察到两种常见的严重不良事件，肝毒性和血小板减少症。尽管这些不良效应在临床试验中是自限性的，但随后对临床数据的荟萃分析证实，大多数患者显示出肝损伤的证据，尽管这对类固醇治疗反应良好。2021年，Thomsen等人报告了两名接受Zolgensma治疗但因与治疗无关的原因死亡的婴儿的SMN1表达。在中枢神经系统容易观察到SMN1表达，但也在几个外周器官中，特别是在肝脏中，表达比CNS高出2-3个数量级。尽管AAV9载体肝毒性的原因尚不完全清楚，但对类固醇治疗的反应表明，它可能与对载体的免疫反应有关。遗憾的是，最近接受Zolgensma治疗的两名患者死于急性肝衰竭。两起死亡都发生在治疗后几周，就在皮质类固醇逐渐减少后。针对其他适应症的AAV载体的临床试验也出现了类似的严重不良事件，包括高载体剂量时的死亡。虽然Zolgensma迄今为止已经用于2300多人，但这些发现再次强调了需要更好地理解和控制病毒载体嗜性和相关的免疫反应，以开发更安全的治疗。 正如从Luxturna学到的教训预计将大大减少靶向视网膜病变所需的工作量一样，Zolgensma也将有助于开发其他针对中枢神经系统的基因疗法，从而为基因疗法治疗RDs的适用性提供进一步的证据。此外，随着这些方法被纳入主流临床实践，开发和生产成本的降低，我们可以预期治疗成本将从目前高价格标签显著降低。 6.结论和未来展望 在这篇综述中，我们通过一些成功临床应用的具体例子来展示基因疗法能够实现什么，以及它如何已经在帮助解决治疗罕见病的挑战。自从基因疗法首次被提出作为一种可能的治疗途径以来，大约已经过去了50年，这表明将一个新概念实施到临床实践中可能会多么复杂。一些获得许可的疗法符合最初的模式（基因补充以挽救遗传缺陷），但许多并非如此，因为它们涉及最近发现和适应的机制途径，如双链RNA干扰、剪接调节和外显子跳跃。在所有同种异体骨髓移植的累积经验基础上，用体外基因疗法治疗SCID取得了显著的初步成功，展示了现有临床实践对于实施新技术的重要性。将基因疗法应用于某些类型的SCID为开发针对其他免疫缺陷的临床基因疗法铺平了道路，并且还针对血液系统的其他疾病，如β-地中海贫血，从而展示了治疗策略如何能够相对快速地适应同一组织的不同类型的疾病。此外，血液细胞体外修饰技术的进步也带来了意想不到的成功，如CAR-T细胞。AAV9载体的类似扩展正在进行中，它们可以通过血管内输送穿过血脑屏障治疗CNS的遗传性疾病，正如首次用Zolgensma治疗SMA时所证明的那样。对于那些有兴趣追踪全球市场上的基因（和细胞）疗法的人来说，国际干细胞研究会维护了一个最新的地图。但请注意，这个资源不包括寡核苷酸疗法，因为它们在技术上不被FDA或EMA的先进治疗药物认为是基因疗法。 基因疗法技术在疫苗领域的应用，在抗击COVID-19方面取得了巨大的成功，基于mRNA和腺病毒的配方在创纪录的时间内被开发出来，并用于免疫世界上很大一部分人口。这些平台现在正在被探索用于疫苗学和罕见病治疗的其他应用，前景非常看好。 我们的讨论集中在基因疗法的一些临床成功上。因此，我们没有深入讨论尚未完全临床实施的其他基因疗法方法的最新进展。然而，为了结束我们的综述，我们简要引用了一些可能推动该领域前进的最新进展。这些包括合成病毒学、脂质纳米颗粒和膜活性肽作为关键的研究发展领域。同样，为了改变嗜性，AAV衣壳工程已经投入了大量资源，并且开始为体内靶向治疗提供优化的AAV血清型。然而，要结束这篇综述，很明显基因组编辑技术无疑是未来最有前途的治疗策略。 基于短合成RNA的CRISPR/Cas酶的可访问工程，极大地促进了通过包括indel介导的敲除、同源依赖修复、先导编辑、碱基编辑和转录的表观遗传调控在内的各种方法，在基因组中引入明确定义的遗传和表观遗传修饰。实际上，最近在转甲状腺素淀粉样变性、镰状细胞病和β-地中海贫血中使用CRISPR的临床试验为该技术及其为患者带来好处的激动人心的潜力提供了非常有希望的证明。