matriptase

摘要表达嵌合抗原受体特异性靶向CD19或B细胞成熟受体(BCMA)的基因修饰的T细胞疗法被批准用于治疗某些B细胞恶性肿瘤。然而，将这些成功案例转向治疗实体瘤患者遇到了各种挑战：包括由于CAR - T细胞介导的细胞毒性对表达目标抗原的非恶性组织的严重的临床靶向非肿瘤效应相关毒性的临床风险。事实上，在CAR-T治疗实体瘤患者的临床试验中已经观察到了靶向非肿瘤效应相关毒性（OTOT），强调了制定这种效应发生的预测、缓解和预防战略的重要性。在这篇综述里，我们总结了目前CAR-T细胞治疗实体瘤出现OTOT的临床证据，并讨论了临床前小鼠模型在预测临床OTOT方面的应用。我们描述了用于提高CAR-T治疗实体瘤特异性的一些当前策略，特别是对目标结合物的亲和力，逻辑电路和合成生物学。而且，我们强调了可用于减轻细胞输注后临床OTOT的控制策略，如调节或消除CAR - T细胞活性、CAR表达的外源控制和CAR - T细胞的局部给药等。介绍嵌合抗原受体(CAR) T细胞已成为一种有效的癌症治疗方式。这种方法依赖于基因工程患者来源或供体来源的T细胞来表达一种合成CAR，这种CAR可以以主要组织相容性复合体(MHC)独立的方式识别肿瘤细胞表面分子。CAR的设计不断发展，以提高灵敏度、特异性和疗效以及工程T细胞的持久性。CAR-T细胞的抗原识别是通过融合到跨膜和细胞内信号域的特异性单克隆抗体衍生单链可变片段(scFv)介导的。CD3ζ是T细胞活化所需的结构域，而共刺激结构域，如CD28和/或4-1BB，与CAR - T细胞增殖、分化和持续相关。到目前为止，FDA批准的所有六种CAR - T细胞产品都针对CD19或BCMA，并利用第二代CAR设计（如图1）。尤其是B细胞恶性肿瘤和多发性骨髓瘤对CAR - T细胞有反应，主要是由于丰富的系源性抗原表达如CD19和BCMA。抗CD19和抗BCMA的CAR-T细胞可以消耗内源性表达靶分子的非恶性B细胞和浆细胞，导致低γ球蛋白血症。这种毒性通常是可以忍受的，并且可以通过静脉注射免疫球蛋白来纠正。在绝大多数患者注射CAR-T细胞后，其他毒性，如细胞因子释放综合征和免疫效应细胞相关神经毒性综合征，主要与急性细胞因子的产生相关，是可控的。CAR - T细胞在血液病治疗恶性肿瘤中的成功为研究实体瘤这一问题提供了动力。CAR-T细胞治疗实体肿瘤患者发展的一个相当大的障碍是，大多数候选靶抗原通常在非恶性组织上共表达，由于靶向非肿瘤效应相关毒性(OTOT)，产生了很大的发病风险。在临床前和临床研究中，使用CAR - T细胞靶向恶性和非恶性组织共有的抗原，已经报道了不同严重程度的OTOT。在这篇综述里，我们研究了OTOT在CA-T靶向实体肿瘤的T细胞疗法的发展，总结了OTOT在临床前和临床研究的证据，并讨论临床中CAR – T中可能有助于克服的OTOT的进展。OTOT的机制和风险OTOT源于CAR-T细胞介导的识别和表达靶抗原的非恶性组织的裂解，可能引起严重不良反应。在识别靶抗原后，CAR- T细胞激活导致CAR和靶细胞之间形成免疫突触，触发效应功能（图2）。穿孔素和颗粒酶的释放被认为是CAR-T细胞介导的细胞毒性主要的机制。然而，其他的机制，如上调T细胞表面分子诱导靶细胞凋亡(如FAS配体)或分泌细胞因子，包括IFN和/或TNFγ，也可能导致组织破坏（图2）。生成对于实体肿瘤患者安全有效的CAR-T细胞，靶抗原的选择是至关重要的。最佳抗原候选物，称为新抗原，应该只在恶性细胞上表达，而不是在非恶性细胞上表达。这种抗原可能产生于肿瘤特异性的非同义突变、插入或缺失，这些突变会改变细胞表面蛋白质的氨基酸序列，癌胎抗原的异常表达，或肿瘤特异性翻译后修饰。然而，细胞表面新抗原是罕见的，特别是在低突变负荷的肿瘤中。EGFRvIII存在于24-67%的胶质母细胞瘤中，是少数已发现的例子之一。而且，大多数CAR-T细胞疗法治疗实体瘤的靶点是是肿瘤相关抗原(TAAs)，在非恶性组织中也表达(图3)。肿瘤相关抗原包括EGFR, HER2, CAIX, B7-H3,间皮素和GD2。CAR-T相关的OTOT的证据临床表现OTOT是在一项转移肾细胞癌病人接受抗CAIX第一代CAR - T细胞治疗的临床试验中观察到的现象（补充表2）。3例患者均显示2-4级肝毒性，肝活检均显示离散性胆管炎伴胆管上皮上CAIX的表达。同样的，在晚期CEACAM5-阳性实体瘤的患者进行抗CEACAM5 CAR - T细胞的I期临床试验中，产生了严重不良反应事件(呼吸急促、肺浸润或呼吸窘迫);其中有一个病人需要重症监护。总体上不利的疗效和安全性导致了该试验的终止。考虑到CEACAM5是在肠道中表达，但肺毒性出乎意料。研究人员发现了在8例患者中5例非恶性肺切除标本(63%)出现了中等到强的CEACAM5表达。这一发现得到了发表在其他杂志上的蛋白质组学数据的支持，在I型和II型肺泡细胞中显示低水平的CEACAM5表达 (图3)，提示OTOT可能诱发观察到的不良临床表现。图1 CAR结构。标准第二代嵌合抗原受体(CAR)与单克隆衍生的单链可变片段(scFv)抗体通过跨膜结构域(TM)连接到一个共刺激信号结构域(例如，来自CD28或4-1BB)和细胞内的CD3ζ信号域。CD28允许快速扩增，但耐久性较差，4-1BB促进持续的效应功能和持久性。ITAM，免疫受体酪氨酸激活基序；VH,重链可变域；VL，轻链可变域。图2 CAR-T细胞溶解机制和旁分泌作用。通过嵌合抗原受体（CAR）T细胞识别肿瘤相关抗原(TAA)，免疫突触形成，随后CAR-T细胞活化。同时，释放含有穿孔素和颗粒酶的细胞毒性颗粒，颗粒酶通过穿孔素通道进入靶细胞，通过破坏线粒体和激活半胱天冬酶触发细胞内生性凋亡。此外，CAR - T细胞上调FAS配体，与靶细胞上的FAS受体结合，触发凋亡和caspase介导的靶向细胞死亡的外源性途径。而且，CAR - T细胞释放IFNγ和TNF，激活免疫细胞，如巨噬细胞。CAR - T细胞可能识别非恶性细胞上的TAAs，导致健康组织的不希望的溶解。下一代CAR - T细胞还可以配备额外的效应功能(如IL-12分泌)将免疫反应扩展到包括内源性T细胞。OTOT，靶标，非肿瘤毒性。靶向HER2的CAR-T细胞已经在晚期实体瘤患者的治疗中进行了几种测试。在一份报告中，一位患有转移性结肠癌的39岁患者，单次输注高剂量(1010)抗HER2 CAR-T细胞导致急性呼吸窘迫，输液后5天死亡（附加表2）。同样地，在一项针对晚期胆道或胰腺癌患者的抗HER2 CAR-T细胞I期研究中，观察到轻度皮肤瘙痒和1例严重的上消化道出血。总之，临床数据表明，低剂量的抗HER2 CAR-T细胞具有中等毒性，有临床反应的证据。CAR-T细胞剂量、scFv特性、CAR设计、肿瘤位置和不同临床试验中的其他变量排除了关于接受抗HER2 CAR-T细胞治疗的患者的OTOT的明确结论，这表明需要更多的数据来验证HER2作为CAR-T细胞靶点。尽管EGFR广泛靶表达(图3)，用EGFR定向CAR-T细胞的OTOT是可控的。在输注抗EGFR CAR-T细胞后，报告了轻度或中度皮肤OTOT，包括纹状地衣样皮肤皮疹，部分表皮丧失和基底空泡变性细胞。在一项抗EGFR CAR-T细胞治疗患有晚期胆道癌I期研究中，潜在OTOT表现为口腔黏膜炎、口腔溃疡、胃肠道出血、脱屑和瘙痒(均为1-2级)。6-13%的转移性胰腺癌患者在接受抗EGFR CAR-T细胞的I期试验治疗中观察到更严重的粘膜和皮肤不良事件(一些3-4级)。研究人员在一名患者中使用甲基强的松龙控制了这些不良事件的发生。在另一项I期试验中，一名晚期胃接受抗CLDN18.2治疗。2名使用CAR-T细胞的患者出现3级粘膜毒性，另外5个出现较轻的这种毒性(1级和2级)。由于分化的胃粘膜细胞中CLDN18.2的高水平表达，作者将其定性为OTOT。尽管如此，该队列37例患者的安全性被认为是可接受的，无剂量限制性毒性报告出现。总的来说，这些I期临床数据证明了接受CAR-T细胞治疗的实体肿瘤患者发生严重OTOT的可能性。强调了TAAs在非恶性组织中的表达的重要性，以便准确地将CAR-T细胞相关的不良事件归因于OTOT。这些数据表明，OTOT可能受到无数因素的影响，包括输注细胞的数量，肿瘤和非恶性组织上的抗原表达密度、CAR设计和给药方式。图3非恶性组织的TAAs公开获得的选定实体瘤的蛋白表达密度。使用免疫组织化学建立表达评分，并基于染色强度，染色的比例（<25%, 25–75% 和>75%）和亚细胞定位。TAA，肿瘤相关抗原，*B4GALNT1被分析替代GD2的表达(B4GALNT1)参与GD2的生物合成)。数据截至2022年10月。两份报告表明CAR-T细胞也可能引起血液系统恶性肿瘤患者意想不到的OTOT。单细胞RNA测序分析的结果表明，在患者中观察到某些神经毒性，包括B细胞恶性肿瘤患者罕见的致命性脑水肿病例接受抗CD19 CAR-T细胞治疗，与大脑中CD19阳性周细胞的OTOT有关。此外，多发性骨髓瘤患者输注抗BCMA CAR-T细胞三个月后，OTOT对基底神经节表达BCMA的神经元和星形胶质细胞的抑制作用被认为是出现进行性运动障碍和帕金森病的原因。OTOT的临床前可预测性CAR-T细胞的OTOT风险已经在临床前模型进行了研究。对小鼠器官进行组织学分析，以检查CAR-T细胞浸润，肿瘤和正常组织坏死的程度，以及肿瘤周围和远离肿瘤的炎症部位的TAA表达水平。免疫组织化学可以验证可能的肿瘤外TAA表达和CAR-T细胞浸润，从而为OTOT提供明确的证据。例如，在小鼠模型中输注抗B7 - H4 CAR-T细胞后(输注后45-48天) 迟发性OTOT的检测是可行的。免疫组化染色非恶性小鼠组织显示广泛的B7-H4表达，与人B7-H4蛋白在非恶性组织中的分布相当。而且，荧光素酶标记的CAR-T细胞在小鼠中也可用于监测CAR-T细胞的转运和活化，从而提高了对CAR-T细胞迁移和肿瘤外相互作用的认识。尽管使用小鼠模型来研究OTOT，但在非恶性小鼠和人类组织中靶抗原表达的差异使预测临床OTOT变得谨慎（附加表1和表2）。例如，在8例神经母细胞瘤异种移植小鼠中，有5例报道了致死性中枢神经系统(CNS)毒性是使用基于scFv的14G2a抗GD2 CAR的高亲和变体，这也解释了OTOT对小鼠大脑GD2表达区域的作用。其他人对OTOT在这些毒性中的作用存在争议，因为他们甚至在高亲和力CAR中也没有观察到这种作用。这些临床前研究结果也与具有原始14G2a scFv CAR结构的抗GD2 CAR-T细胞的临床毒性特征相冲突。并且，在小鼠模型中，在接受抗CLDN18.2 CAR-T细胞治疗的患者中未观察到胃肠道OTOT，这很可能是由于几个因素，包括CLDN18.2在非恶性小鼠组织中的表达有限，以及CLDN18.2阴性胃干细胞的快速组织再生。此外，由于人和小鼠CLDN18.2同源物的抗原结构、靶表达行式或不同的组织微环境和/或解剖壁龛的差异，小鼠的OTOT可能不会转化为临床环境中的OTOT。使用不同的方法可以增强小鼠模型的预测性。包括使用人类同源基因取代小鼠基因的基因工程，或将细胞系移植到小鼠体内以模拟非恶性组织中肿瘤外TAA的表达的例子。尽管如此，这些方法很少使用，并且仍然可能无法准确反映TAAs在非恶性人体组织中的复杂表达模式。正在考虑使用现代器官芯片技术旨在模拟完全人性化模型中组织内的体内微结构和生理过程。这些模型不能完全模拟人类组织抗原表达的复杂性，尽管它们可能有助于解决更传统模型的缺陷。缓解OTOT的工程策略临床CAR-T细胞试验中观察到的毒性鼓励了旨在提高安全性同时保持抗肿瘤功效的技术的发展。利用合成生物学，新的方法正在被开发出来，以便更好地限制CAR-T细胞对肿瘤的有效细胞毒性活性，从而避免OTOT。CAR域微调通过修改CAR的scFv进行亲和调优已经成为一种有趣的方法来获得对肿瘤具有足够的亲和力细胞识别，同时保留TAA表达有限的非恶性细胞，这可以通过对现有的scFv进行诱变或筛选scFv库来确定具有不同亲和力的替代结合物来实现。高亲和力CAR-T细胞可能对低密度抗原表达的肿瘤细胞具有更好的反应性，但也可能导致识别存在于肿瘤外组织的靶抗原（图3）。对靶抗原具有非常高亲和力的ScFvs可能会由于激活诱导的细胞死亡而限制CAR-T细胞增殖的潜力。相反，低亲和力CAR-T细胞可能缺乏抗肿瘤活性，因为它们无法充分识别和/或裂解TAA表达水平较低的肿瘤细胞。并且，在血液系统恶性肿瘤患者中已经观察到了低亲和力的scFv增加了低抗原密度肿瘤细胞逃避CAR-T细胞识别的风险。在人类HER2异位表达的小鼠模型中，研究了scFv亲和力对OTOT的影响。研究人员发现，相比靶向相同抗原的低亲和力CAR-T细胞，高亲和力的抗HER2 CAR-T细胞导致更多肝损伤，这归因于肝脏对低亲和力CAR-T细胞的清除速度更快。此外，研究人员在小鼠胶质母细胞瘤异种移植模型中测试抗EGFR-细胞，结果显示OTOT强烈依赖于CAR亲和力。相较于输注低亲和力的CAR-T细胞存活率100%，给小鼠注射了高亲和力的抗EGFR CAR-T细胞后，毒性增加，53天存活率57%。事实上，在体外和体内小鼠异种移植模型中，具有可变scFv亲和力的抗HER2和抗EGFR CAR构建物在没有OTOT的情况下都具有强大的抗肿瘤反应。除了scFv的亲和调节外，对铰链和跨膜结构域(H/T)的修饰以及基于酪氨酸的免疫受体激活基元(ITAMs)的数量可以改变CAR的抗原密度阈值(图1)。比如，具有CD8-H/T的4- 1BB-CD3ζ CAR-T细胞与那些具有CD28-H/T的CAR-T相比，具有更高的抗原密度阈值,形成不太稳定的免疫突触。并且，减少CD3ζ结构域中ITAM的数量可以降低CAR - T细胞对具有有限抗原密度的细胞的细胞毒性，同时保持对高抗原密度目标的细胞毒性。CD3ζ中一个或多个ITAM的功能缺失突变也可用于校准激活和分化程序，突变ITAM的位置可以决定CAR-T细胞的功能、分化和抗肿瘤活性。逻辑门控CAR-T细胞布尔逻辑门控方法，其中涉及数学操作符“IF/THEN”、“AND”、“OR”和“NOT”可用于控制CAR-T细胞的激活，其中一些方法是可以使用的增加细胞杀伤的特异性，减少潜在的OTOT（图4）。使用AND -逻辑电路解耦CAR-T细胞激活信号。不同的CAR-T细胞激活信号(图5a)可以通过所谓的AND逻辑电路解耦，以避免在某些情况下的OTOT。双与逻辑CAR-T细胞表达两种不同的合成受体(一种含有CD3ζ，另一种含有CD28或4-1BB信号域)，每一种都以分裂的方式靶向不同的TAA（图4a和图5b）。理论上，这种双重控制降低了OTOT的风险，因为这两种TAA都需要在非恶性组织上表达才能使CAR-T细胞完全激活，而仅连接一种受体会导致信号传导减弱。在小鼠中，靶向CEA和间皮素的AND逻辑门控CAR-T细胞对双TAA阳性细胞显示出特异性的细胞毒性，而不识别单TAA阳性细胞。另一项研究表明，使用这种方法更有效地杀死双TAA阳性细胞。他们还发现，仅含有CD3ζ的CAR的参与可能导致泄漏。在这种情况下，逻辑电路仅被一个信号激活，导致单TAA阳性细胞裂解和OTOT风险增加。其他肿瘤相关的特征可以通过AND逻辑靶向，而不是第二个细胞表面抗原。例如，肿瘤抗原PSCA和免疫抑制因子TGF-β和IL-4是胰腺癌肿瘤微环境(TME)所独有的，已经被利用到一个AND逻辑系统中。研究人员产生了抗PSCA的CAR-T细胞，共表达了两种转基因细胞因子受体，能够将TGFβ和IL-4的免疫抑制作用转化为免疫刺激信号。这种方法增强了CAR-T细胞的效力和安全性，并在小鼠模型中显示出选择性抗肿瘤作用。这种策略降低了OTOT的概率，但含有CD3ζ的CAR仍然有可能泄漏。总体而言，AND-逻辑电路对多个TAA的依赖性增加了抗原逃逸的风险。TME的感知有助于IF/ THEN逻辑门控。IF/ THEN -逻辑门控提供了另一种限制CAR-T细胞杀伤TME的策略降低了泄漏的风险(图4b)。在酸性环境中对PH敏感的CAR-T细胞最佳识别TAAs提供了一个基于IF/ THEN -logic靶向的例子。这种方法利用了Warburg效应，其实这种效应在许多肿瘤中普遍存在，指的是糖酵解加速和乳酸生成增加，导致肿瘤内酸性环境。一种具有PH限制结合域的靶向HER2的CAR在酸性TME中优先检测HER2，在小鼠模型中导致CAR-T细胞扩增和高抗原密度HER2阳性肿瘤细胞的消退。缺氧感知也可以限制CAR的表达和TME的活性(图4b)。在一项概念验证研究中，HIF1α的缺氧感应亚域被融合到多链抗CD19 CAR的细胞内c端。在常氧条件下，HIF1α亚结构域和CAR被降解。然而，在TME的缺氧条件下，HIF1α不会发生降解，从而使局部CAR表达成为可能。类似的方法已应用于泛抗ERBB CAR防止小鼠致命毒性(补充表1)。T细胞仅在严格缺氧(0.1%氧气)下选择性表达CARs，导致卵巢腺癌小鼠异种移植模型中的肿瘤得到控制，无全身毒性。图4 规避OTOT的布尔逻辑门控原理。A，通过与两个靶向不同的肿瘤相关抗原(TAAs)的靶细胞结合，AND -逻辑嵌合抗原受体(CAR) T细胞被激活。B，基于IF/THEN肿瘤微环境的逻辑门控CAR - T细胞只有在某些肿瘤微环境特异性特征存在时才能被激活。例子包括ph限制的TAAs结合，car的缺氧依赖性表达或抗原结合位点的蛋白酶依赖性释出。C，非逻辑CAR - T细胞共同表达针对不同抗原的刺激性CAR - T和抑制性CAR - T。当靶细胞表达与非恶性组织相关的选择配体时，抑制性CAR抑制T细胞活化。D，在基于IF/THEN TAA的逻辑电路中，CAR-T细胞只有在遇到靶细胞上的两种不同的TAA时才会被激活。组成表达的合成Notch受体对一个TAA识别，随后诱导靶向另一个TAA的CAR的表达。scFv，单链可变片段；TM，跨膜结构域。另一种方法是使用蛋白酶敏感连接体将掩蔽肽附着在抗EGFR CAR的抗原结合位点上（图4b）。CAR的抗原结合位点只有通过蛋白酶裂解掩蔽肽才能被释放。这种方法将CAR的功能限制在TME, TME具有高浓度的局部膜型丝氨酸蛋白酶1 (MT-SP1)，尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)和溶酶体酶豆科蛋白。这种蛋白酶依赖的CAR提供的抗肿瘤活性水平以一种更具选择性的方式与未被掩盖的CAR相当。这些方法的一个重要警告是，某些非恶性组织可能共享TME的目标特征，导致TME感应CAR - T细胞在远离肿瘤的解剖位置被激活。例如，肾髓质和肠粘膜在生理条件下是缺氧的。因此，低氧诱导T细胞治疗的靶抗原选择或PH诱导的CAR表达和/或功能应该集中在在非恶性缺氧和/或酸性组织中不表达的TAAs上。SynNotch电路使用IF/ THEN逻辑门控促进多种抗原传感。使用合成Notch (SynNotch)电路的IF/ THEN逻辑门控CAR-T细胞依赖于多抗原感应，克服了亲和力和选择性之间的权衡（图4d）。通过将CAR-T细胞效应功能限制在多个肿瘤靶点上，这种方法可以使用更具侵袭性、更高亲和力的CAR，否则这些CAR有可能导致OTOT。SynNotch CAR-T细胞通过CAR转基因表达的两个步骤被激活，只有在SynNotch受体识别所谓的启动抗原后才被诱导（图5c）。在描述SynNotch CAR-T细胞的最初报告中，CAR的表达和T细胞的激活依赖于对两种不同的TAAs的识别。其他研究小组也研究了SynNotch电路，并在没有OTOT迹象的情况下证明了其有效的体外抗肿瘤活性。SynNotch CAR-T细胞通路在表达ALPPL2的实体瘤临床前模型中显示出增强的特异性。值得注意的是，通过阻止CAR介导的强直信号传导，在该模型中实现了优越的肿瘤控制。在被赋予串联CAR的SynNotch CAR-T细胞中，同一组在表达EGFR VIII的胶质母细胞瘤的异种移植模型中显示出精确的肿瘤靶向性(补充表1)，没有OTOT的证据。CAR-T细胞设计结合了亲和力调节的SynNotch电路，包括低亲和力的抗HER2 SynNotch受体和高亲和力的抗HER2 CAR。该系统允许SynNotch CAR-T细胞基于S型曲线识别靶标抗原密度阈值，其中CAR-T细胞在低水平HER2表达时无活性，但一旦HER2密度超过特定阈值，细胞毒性就会大幅增加。这些协同作用受到高抗原密度，使抗肿瘤活性强大，从而降低OTOT的风险。SynNotch电路的多功能性，包括使用多个SnNotch受体的选择，为设计更特异性和毒性更低的CAR-T细胞提供了可能。然而，宿主对SynNotch蛋白的免疫反应的可能性以及转基因的复杂性和大小为该技术的临床应用带来了挑战。为了克服后者，研究人员重新设计了潜在的SynNotch结构，并建立了“合成膜内蛋白水解受体”(SNIPR)系统，该系统更紧凑，并且与人类转录因子兼容。该方法在一项涉及表达ALPPL2 - HER2的卵巢癌异种移植模型的原理性临床前研究中得到了成功的测试。与AND逻辑相反，由于CD3ζ信号的独立细胞毒性作用，IF/THEN门与泄漏风险无关。然而，引发的SynNotch CAR-T细胞从肿瘤中迁移到表达CAR抗原的共定位的非恶性组织中仍然是一个潜在的风险。图5 在CAR-T细胞中测试的逻辑门控策略的例子。a，传统的第二代嵌合抗原受体(CAR) T细胞在单一结构中结合了最佳CAR - T细胞功能所需的两种信号。b，双逻辑CAR - T细胞通过结合不同肿瘤相关抗原(TAAs)的两个独立受体完成信号传导和共刺激。c，合成Notch (SynNotch) CAR - T细胞组成性地表达一个SynNotch受体。抗原结合该受体导致暴露Notch调控区和跨膜结构域的蛋白质切割位点，允许通过酶ADAM和γ-分泌酶进行顺序切割。这释放出一种栓系的细胞内转录因子，促进CAR的表达。该表达的CAR可以识别自身的同源抗原和触发细胞毒性反应。D，分裂，通用和可编程(SUPRA) CAR - T细胞表达亮氨酸拉链作为细胞外结合域。亮氨酸拉链可以结合携带单链可变片段(scFv)的亮氨酸适配分子。这种可溶性适配器scfv赋予CAR - T细胞对特定靶标的抗原识别能力。由于适配器- scFv偶联物被独立地施用于CAR - T细胞，因此注入不同的scFv可以在体内切换CAR靶标。可溶性拉链- scFv可以竞争性地结合适配器- scfv，阻止CAR - T细胞信号传导。该系统也可以使用与逻辑分割架构进行设计，如b所示。E，AND-logic亲和度控制的CAR - T细胞含有低亲和性scFv，依赖于亲和度来识别TAA。CAR - T细胞的激活依赖于抗原识别和两种低亲和力CAR在可溶性二聚体存在下的二聚体化。F，Co-LOCKR系统利用cage和关键中间蛋白识别并结合靶细胞。笼和关键分子携带一个TAA结合域，而只有笼携带一个包含隐藏的Bim结构域(结合位点)的锁存器。一旦笼子和钥匙结合了它们的同源抗原，锁存器就会被释放，暴露出Bim结构域，并允许CAR - T细胞识别。通过CD28或4-1BB进行共刺激。TF，转录因子；TM，跨膜结构域；VH，重链可变区；VL，轻链可变区。AND逻辑门控的通用CAR设计旨在进行外源控制。合成生物学使更复杂的逻辑系统的工程，包括输注可调控制CAR - T细胞的活性后。例如，一个分裂的、通用的和可编程的(称为SUPRA) CAR电路可以被修改以结合不同的逻辑门控策略。功能齐全的SUPRA-CAR包含两个元素:(1)连接到细胞外亮氨酸拉链的CAR的跨膜和内结构域，(2)连接到亮氨酸适配器的可溶性scFv(适配器- scFv)。SUPRA CAR-T细胞只有在适配器- scFv结合TAA并且适配器通过拉链附着在CAR上时才会被激活。为了避免OTOT, SUPRA电路可以进一步编程为包含与逻辑门(图5d)。在这种情况下，设计了两个SUPRA CAR，使CD3ζ信号和共刺激由两个独立的受体传递，以实现抗肿瘤活性。此外，实施结合不同TAA的适配器- scFv允许在体内切换CAR靶标。此外，为了防止CAR-T细胞信号传导，可以给予一种可溶性的拉链- scFv，它竞争性地结合适配器- scFv和阻止其抗原识别和CAR-T细胞活化。另一种设计使用了CAR-T细胞贪婪的概念，其中免疫反应依赖于多种低亲和力CAR-抗原的相互作用。在这种所谓的亲和控制CAR (Avid CAR)系统中，只有当两个低亲和CAR独立识别靶抗原并在特定的小分子二聚体存在下变成二聚体时，才能实现激活。这种设计可以进行修改，将CAR与针对不同TAA的scFv结合起来，从而扭转这一局面将系统转换为与亲和度相关的与逻辑电路(图5e)。已经报告了对该系统的各种扩展，包括AND逻辑利用VEGF作为二聚体。尽管在非恶性组织中也发现了VEGF，但它是肿瘤血管生成的关键介质，因此可以在TME内激活CAR-T细胞。使用SUPRA和AvidCAR设计和逻辑门控CAR-T细胞的能力提供了一种降低OTOT风险的方法，同时也提供了外源性控制的元素。SUPRA CAR-T细胞的可切换特性还可以通过给药靶向替代TAA的适配器- scFv来降低抗原逃逸的风险，而无需在体外重新设计CAR-T细胞。考虑到对多个TAA的依赖会增加抗原逃逸的风险，这对于使用AND逻辑电路的构建可能特别有用。此外，建立一个允许外源控制CAR-T细胞活性的系统是一项重要的安全措施，可以在出现任何毒性时对其作出反应非逻辑门控可以阻止CAR-T细胞激活。AND -逻辑和IF/THEN -逻辑电路调节刺激CAR的活动，一旦识别抗原，将会触发细胞毒性反应。相比之下，非逻辑门控则含有一种能诱导细胞毒性的刺激性CAR反应和一种抑制性CAR (iCAR)，它触发一种有效的抑制信号，将非恶性细胞上表达的标记物解释为防止杀伤的信号(图4c)。非逻辑电路的第一个例子是在小鼠异种移植模型中测试的PSMA靶向iCAR，其中PSMA用作非恶性组织的代理抗原，CD19作为靶抗原。iCAR T细胞成功抑制了共表达CD19的PAMA阳性NALM6细胞的消除，但不影响对PSMA阴性对应细胞的反应。相似的概念性验证方法在其他研究中也进行了使用，使用抗CD93 CAR和抗CD19 iCAR结构在体外成功的避免了OTOT。iCARs也被用于靶向杂合性缺失(LOH)以降低OTOT。当不可逆的基因改变仅影响一条染色体时，就会发生LOH，导致非恶性细胞易患癌症。HLA分子中的LOH是多种肿瘤发生免疫逃避的机制之一，并已被几个研究小组利用作为肿瘤特异性标志物(补充表1)。用抑制性受体靶向HLA分子会在遇到非突变细胞时阻碍CAR - T细胞信号传导，同时对LOH影响的细胞产生细胞毒性。另一种基于下游抑制T细胞功能的非逻辑方法提供了一种替代iCARs的方法。在这个系统中，synNotch受体被设计用来识别主要存在于非恶性组织中的抗原，然后激活被截断的促凋亡因子BH3相互作用结构域死亡的表达激动剂(tBID)，诱导CAR-T细胞凋亡。正如作者所指出的，找到肿瘤外细胞凋亡和肿瘤内扩张之间的平衡对于这种方法的临床成功至关重要。自适应逻辑门控与中间蛋白允许外源控制。还开发了一种可以执行与逻辑和非逻辑门控的多抗原传感系统，称为Co-LOCKR(图5 f)。在这种方法中，CAR-T细胞不直接与靶抗原结合，而是与促进CAR-T细胞与靶细胞结合的两种可溶性中间蛋白(称为“cage”和“key”)结合(图5f)。TAA结合的笼包含一个带有Bim结构域的锁存器，只有当共定位的关键蛋白与相应的抗原结合时才会显示出该结构域。随后，一种抗Bim的CAR - T细胞可以识别笼中的Bim结构域并触发CAR-T细胞的细胞毒性。此外，使用可以结合非恶性组织上表达的特定抗原的诱饵蛋白可以阻止CAR-T细胞结合Bim结构域并避免CAR-T细胞活化。这种非逻辑电路有望增加特异性并降低OTOT的风险。限制体内OTOT的其他策略CAR-T细胞的其他修饰正在开发中，以避免或减少输注后OTOT的严重程度。一些策略已经在临床上进行了测试，尽管大多数策略仅限于临床前模型。输注后CAR-T细胞控制临床批准药物对照。使用皮质类固醇进行全身免疫抑制是目前处理大多数免疫治疗相关毒性的首选策略。然而,使用皮质类固醇可能会对CAR-T细胞的抗肿瘤作用和持久性产生负面影响。酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼可以实现CAR-T细胞的可逆(或暂时)控制，它可以作为CAR-T细胞信号传导的立即关闭开关，而不影响细胞活力(图6a)。尽管尚未在临床测试，但达沙替尼可能提供一种有效的方法来控制急性CAR-T细胞毒性，特别是考虑到它能进入血脑屏障，从而控制神经毒性。然而，考虑到在达沙替尼停药后CAR-T细胞的活力和活性仍能维持，该药物可能不是长期治疗OTOT的理想药物。自杀式开关控制。自杀开关和其他旨在体内消除和/或灭活CAR-T细胞的策略是治疗潜在危及生命的不良事件的重要安全措施。已经测试了包括使用基于诱导型Caspase 9的自杀结构(iCaspase 9)的各种方法。这种结构可以通过给药小分子AP1903激活，在暴露后几分钟内诱导CAR - T细胞凋亡(图6b)。2021年发表的一项临床研究数据表明，iCaspase 9可用于安全改善接受抗CD19 CAR-T细胞治疗的患者的临床严重神经毒性。 图6 CAR - T细胞中的控制开关。a，达沙替尼对酪氨酸激酶LCK的可逆抑制可阻止CD3ζ内免疫受体酪氨酸激活基序(ITAMs)的磷酸化，从而中断嵌合抗原受体(CAR) T细胞效应功能的必要信号。b，AP1903给药并与FKBP12-F36V结合导致二聚化并激活了一个基于诱导caspase 9的自杀构建体(iCaspase 9)，触发了CAR - T细胞的凋亡。c，CAR转基因也可以编码选择标记物RQR8，该标记物可以用利妥昔单抗靶向触发补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，从而耗尽CAR-T细胞。d，一个蛋白酶靶点、一个蛋白酶和一个degron被融合到CAR的胞内C端。蛋白酶可以将自身和CAR的降解物分离，防止CAR降解并维持其在细胞表面的表达。然而，用asunaprevir抑制蛋白酶会阻止裂解，导致降解物的保留，从而降解整个CAR结构。e，在mRNA剪接过程中，外显子的包含或排除可以使用所谓的剪接修饰剂药物来改变。通过将CAR的起始密码子(ATG)插入到对剪接修饰子有反应的位点，可以控制CAR的翻译和表达。在这种药物存在的情况下，CAR的起始密码子仍然是mRNA的一部分。这允许mRNA的翻译，并允许CAR的组装和表达。在没有药物的情况下，起始密码子被移除，CAR翻译不会启动。LTR，长末端重复；scFV，单链抗体；TM，跨膜结构域；VH，重链可变区域；VL，轻链可变区域图7 CAR T细胞活性的区域限制。a，嵌合抗原受体(CAR)转基因可以置于热休克蛋白(HSP)的调节控制下，这样聚焦超声就可以产生局部的瞬时温度升高。这会激活HSP，从而可逆性上调CAR的转录和表达。b，利用三组分光诱导的核转位和二聚化(LINTAD)系统可以实现蓝光诱导的CAR转录。除了CAR转基因后，T细胞表达LexA-CIB1-biLINuS (LCB)构建体。 bilinus响应元件在局部应用时被激活蓝光照射，导致核定位序列(NLS)和LCB结构进入细胞核内的易位。LexA(作为LCB的一部分)可与CAR转基因中设计的LexA结合序列(BS)结合。然后，LCB的CIB1成分可以招募一个共表达的CRY2-VPR融合结构，该结构可以靶向最小启动子并触发CAR的表达。c，局部脑室内给予CAR T细胞作为一种全身静脉输注的替代疗法，CNS，中枢神经系统CAR-T细胞也可以被改造成表达一种额外的细胞表面分子，然后用单克隆抗体靶向。这允许CAR-T细胞通过补体依赖性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性清除。利妥昔单抗识别来自CD34和CD20衍生的多肽序列(称为RQR8)，以此为目的进行开发(图6c)。在小鼠脾细胞移植模型中，给予利妥昔单抗7天后，外周血样本中未检测到CAR转导的共表达RQR8的脾细胞。同样，使用西妥昔单抗可以靶向抗CD19 CAR-T细胞共同表达EGFR的截断版本(EGFRt)，从而消除CAR-T细胞和逆转B细胞发育不全。尽管这种方法具有潜力，但有几个因素可能会影响抗体介导的CAR-T细胞消除的效率。有限的单克隆抗体运输到中枢神经系统可能会阻碍CAR-T细胞在这个位置的消除。此外，在非恶性细胞上识别抗体靶点可能会引起额外的毒性。并且，单克隆抗体诱导的选择压力可能导致缺乏足够抗体靶向细胞表面标记物的CAR-T细胞群体扩大，从而逃避控制。最后，这种形式的T细胞消除动力学可能不够快，无法消除对重要器官的急性损伤。通过调节CAR表达和细胞毒性进行控制。在完全根除肿瘤之前使用自杀开关不可逆地消除CAR-T细胞可能会限制临床疗效。另一种选择可能是设计可逆的开关，允许暂时控制CAR-T细胞的激活并保持抗肿瘤功能。到目前为止，已经提出了几种设计，其中许多依赖于小分子或抗体的管理，以及其他方法。在关闭系统中，使用蛋白酶抑制剂阿苏纳韦来控制CAR表面表达。为了达到这个效果，一个蛋白酶靶点，一个蛋白酶和一个Degron被融合到CAR的C端。在没有阿苏纳韦的情况下，蛋白酶从CAR结构中分离出降解物，从而维持CAR表面的表达。阿苏纳韦给药后，蛋白酶被抑制，降解不能被切割，导致CAR降解(图6d)。类似地，已经开发了一种将CAR与配体诱导的降解结构域结合的系统。这种方法可以在配体的作用下使CAR的蛋白酶体降解，从而实现体内CAR表达的可调控制。在一种开关方法中，研究人员在CAR结构的跨膜结构域和信号结构域之间引入了蛋白酶裂解位点。此外，他们将一种以反式表达的膜结合NS3蛋白酶整合到CAR中。给予蛋白酶抑制剂依巴司韦抑制了CAR信号域的组成性切割，使CAR在小鼠模型中发挥功能。停止给药逆转了高剂量依巴司韦的CAR-T细胞相关OTOT，这表明药物剂量可以调节CAR-T细胞活性，在保持可接受的安全性的同时实现肿瘤控制。另一种允许远程控制CAR-T细胞的方法是先前讨论的AvidCAR（图5e）。建议在AvidCARs和其他开关系统中的二聚体包括AP20187，来那度胺和雷帕霉素。关于使用药物诱导剪接来调节治疗性蛋白表达的系统的数据也有报道，并且可能被改编为CAR-T细胞的开关（图6e）。实体肿瘤患者中CAR-T细胞结合药物诱导的安全开关是否会成功可能取决于药物耐受性和药物运输到CAR-T细胞活性部位。通过声音或光线控制CAR的表达。超声检查可用于控制CARs的转录和随后的表达。超声敏感的Piezo1离子通道被证明可以触发信号级联，导致体外抗CD19 CAR分子的转录上调。2021年8月，研究人员发表了一种方法，将抗PSMA或抗CD19 CAR的表达置于热休克蛋白的调控下（图7a）。该方法通过施加聚焦超声约5分钟，将肿瘤内的温度提高到43°C左右，实现了CAR在体内的表达控制。这诱导了肿瘤受限的细胞毒性反应，同时限制了肿瘤外的细胞毒性。类似于开关系统的光反应性CAR - T细胞可用于诱导局部CAR表达。引入光诱导核易位和二聚化(LINTAD)系统在体外和小鼠体内被证明可以控制CAR-T细胞介导的肿瘤细胞杀伤（图7b）。在其他地方，一种光响应通用CAR-T细胞已经开发出来，它依赖于对紫外线敏感的小分子CMNB(5-羧基甲氧基-2-硝基苄基)来识别TAA。体外肿瘤细胞的结合和杀伤依赖于紫外光的存在。使用声控或光控CAR-T细胞在空间和时间上诱导CAR-T表达可能会阻止CAR-T细胞的全身性激活，从而降低OTOT的可能性。CAR-T细胞的局部管理CAR-T细胞传统上是系统给药的，这给CAR-T细胞向肿瘤部位的充分运输和向非恶性组织的最小运输提出了挑战。在可能的情况下，区域或地方管理可以帮助克服这些挑战。例如，针对中枢神经系统肿瘤的CAR-T细胞脑室内和鞘内给药已经显示出有希望的临床前和早期临床结果。在三名胶质母细胞瘤患者中，有两名患者颅内递送抗IL – 13R α2 CAR-T细胞导致了短暂的抗肿瘤反应。尽管在IL – 13R α2高表达的患者中观察到3级神经毒性肿瘤细胞，但是不良事件是可控的。类似地，在一项I期试验中，抗HER2 CAR被直接注入复发性和/或难治性中枢神经系统肿瘤儿童患者的肿瘤腔或脑室系统（图7c）。本试验的初步数据提示，重复局部给药的耐受性良好，并导致局部免疫应答。2022年3月，研究者描述了在弥漫性内源性脑桥胶质瘤(一种高致死性儿童中枢神经系统肿瘤)患者中，抗GD2 CAR T细胞在脑室内成功给药的情况，4例患者中3例有临床和影像学改善，尽管GD2在正常脑组织中表达，但未观察到OTOT。在3例恶性胸膜间皮瘤(MPM)患者中也进行了将抗FAP CAR T细胞局部递送至胸膜腔的研究。本试验证明了在器官局限的肿瘤(如MPM)中局部给药的可行性。同样，27例恶性胸膜疾病患者通过胸腔内输注抗间皮素CAR T细胞。尽管39%患者在超过100天的外周血样本中检测到CAR T细胞，但未有OTOT的报告。抗B7 - H3 CAR T细胞已在几种肿瘤类型中，重点是递送途径，进行了研究。当局部给予抗B7 - H3 CAR T细胞时，在非典型畸胎样/横纹肌样的小鼠异种移植模型中产生了更有效的抗肿瘤反应。然而，使用免疫正常小鼠模型进行的一项研究的数据提示，无论给药途径如何，B7-H3 CAR T细胞均安全有效。正在进行的抗B7-H3 CAR-T细胞的早期临床试验，涉及脑肿瘤(NCT04185038)和其他实体瘤(NCT04483778，NCT04897321)可能使我们进一步了解给药途径对抗肿瘤活性和OTOT的影响。虽然CAR T细胞局部给药可将细胞毒性限制在特定组织腔室，但这些细胞仍有可能进入体循环。结论CAR-T细胞疗法的附加修饰可增强其针对实体瘤的效力正在开发中，并且正在稳步发展走向临床检测。大量TAA的发现为CAR-T用于治疗实体瘤患者奠定了基础，尽管它们在非恶性组织中的表达可能预示着增加OTOT发生的风险。正如数项CAR-T细胞临床试验的数据所观察到的，此类风险的评估策略并不完善，其中OTOT与临床前数据不一致。一个重要的研究领域是完善动物模型和/或改进体外系统，以更准确地预测这些毒性。深入研究集中于开发更具体的CAR系统，包括允许外源性控制T细胞功能或生存的CAR系统。调整scFvs的亲和力和改变CAR架构可能降低OTOT的风险。临床前模型已经探索了各种基于蛋白质的逻辑电路策略，旨在进一步限制CAR-T细胞对肿瘤部位的活化和杀伤。控制CAR-T细胞介导的OTOT的其他尝试包括设计用于外源性控制CAR-T细胞活性或及时清除CAR-T细胞的工程方法。局部应用CAR-T细胞在肿瘤环境中集中抗肿瘤活性可能避免OTOT，并且已经在早期阶段进行了临床研究测试。解决实体瘤新型CAR-T细胞研发过程中OTOT的风险是指导临床成功开发安全有效的治疗策略的必要条件。来源：Flugel, C. L., Majzner, R. G., Krenciute, G., Dotti, G., Riddell, S. R., Wagner, D. L., & Abou-el-Enein, M. (2023). Overcoming on-target, off-tumour toxicity of CAR T cell therapy for solid tumours. Nature Reviews Clinical Oncology, 20(1), 49-62.END

嵌合抗原受体（CAR） T细胞治疗已成为一种有效的癌症治疗手段。这种方法依赖于对患者或捐赠者来源的T细胞进行基因工程，以表达一种合成的CAR，该CAR以MHC非依赖的方式识别肿瘤细胞表面分子。CAR设计正在不断发展，以提高CAR T细胞疗法的敏感性、特异性、有效性和持久性。CAR T细胞治疗在血液瘤中的成功推动了实体瘤的发展。对于实体瘤患者来说，CAR T细胞疗法相当大的障碍是大多数候选靶抗原通常在非恶性组织上共表达，“靶上/肿瘤外”毒性会造成相当大的致病风险。目前临床前和临床对CAR T细胞疗法的研究报告了不同严重程度的“靶上/肿瘤外”毒性。本文就CAR T治疗实体瘤的“靶上/肿瘤外”毒性以及解决策略做一个简要介绍。“靶上/肿瘤外”毒性的风险和机制“靶上/肿瘤外”毒性源于CAR T细胞介导的对表达靶抗原的非恶性组织的识别和裂解，可能会导致严重的不良事件。在识别靶抗原后，CAR T细胞激活使得CAR和靶细胞之间形成免疫突触，触发效应器功能。穿孔素和颗粒酶的释放是CAR T细胞介导的细胞毒性的主要机制。然而，其他机制，如上调T细胞表面分子以诱导靶细胞凋亡(如Fas配体)或分泌细胞因子，包括IFN-γ和TNF，也可能导致组织破坏 (图1)。图1. CAR T细胞的杀伤机制和旁分泌作用为了产生对实体瘤患者既安全又有效的CAR T细胞，靶抗原的选择至关重要。最理想的候选抗原，称为新抗原，应该只在恶性细胞上表达，而不是在非恶性细胞上表达。这些抗原可能来自肿瘤特异性的非同义突变、改变细胞表面蛋白氨基酸序列的插入或缺失突变、癌胎儿抗原的异常表达或肿瘤特异性的翻译后修饰。然而，细胞表面的新抗原很少见，特别是在突变负担较低的肿瘤中。EGFRvIII在24-67%的胶质母细胞瘤中被发现，是为数不多的已确定的例子之一。因此，大多数实体瘤的CAR T细胞治疗靶点是肿瘤相关抗原(TAA)，这些抗原也在非恶性组织中表达。TAA的例子包括EGFR，HER2，CAIX， B7-H3，mesothelin和GD2等(图2)。图2. 实体瘤TAA在非恶性组织上的蛋白表达密度CAR T细胞相关“靶上/肿瘤外”毒性的临床证据“靶上/肿瘤外”毒性在一些临床试验观察到。例如，在转移性肾癌患者接受了抗CAIX第一代CAR T细胞的所有三名患者都观察到了2-4级的肝脏毒性，肝脏活检显示离散胆管炎，胆管上皮上有CAIX的表达。同样，在CEACAM5阳性的晚期实体瘤患者的I期临床实验中检测到抗CEACAM5 CAR T细胞会引发临床上的严重不良事件，如呼吸急促、肺浸润物等。由于疗效和安全性都不佳，导致该临床试验停止。考虑到CEACAM5在肠道中表达，胃肠道毒性的可能性是预料到的，但肺部毒性是意想不到的。研究人员发现，在8名患者中的5名的非恶性肺切除样本中，CEACAM5的表达为中到强。这一发现得到了蛋白质组数据的支持，其结果显示CEACAM5在I型和II型肺泡细胞上的低水平表达，表明“靶上/肿瘤外”毒性可能是导致观察到的不良临床表现的原因。针对HER2的CAR T细胞已经在晚期实体肿瘤患者中进行了几种适应症的测试。在一份病例报告中，一名39岁的转移性结肠癌患者单次输注大剂量(1010)抗HER2 CAR T细胞导致急性呼吸窘迫，随后在输注5天后死亡。同样，在晚期胆道或胰腺癌患者抗HER2 CAR T细胞的I期研究中，观察到轻度皮肤瘙痒和1例严重消化道出血。总之，临床数据表明，较低剂量的抗HER2 CAR T细胞具有中等毒性。尽管EGFR表达广泛，但以EGFR靶向的CAR T细胞疗法的“靶上/肿瘤外”毒性是可管理的。据报道，在注射抗EGFR CAR T细胞产品后，出现了轻度或中度的真皮”靶上/肿瘤外”毒性，包括苔藓条纹样皮疹、部分表皮丧失和基底细胞空泡样变性。在一项在晚期胆道癌患者中测试抗EGFR CAR T细胞的I期研究中，观察到潜在的“靶上/肿瘤外”毒性，形式为口腔粘膜炎、口腔溃疡、胃肠道出血、脱屑和瘙痒(均为1-2级)。在另一项I期试验中，一名接受抗CLDN18.2 CAR T细胞治疗的晚期胃癌患者出现了3级粘膜毒性，另外5名患者出现了不太严重的这种毒性(1级和2级)。原因可能是分化的胃粘膜细胞高水平表达CLDN18.2。然而，这组37名患者的安全性是可接受的，没有剂量限制毒性的报道。总的来说，这些I期临床数据证明了接受CAR T细胞治疗的实体肿瘤患者发生严重“靶上/肿瘤外”毒性的可能性。这突出了解TAA在非恶性组织上的表达以便准确地将CAR T细胞相关的不良事件归因于“靶上/肿瘤外”毒性的重要性。“靶上/肿瘤外”毒性可能受到多种因素的影响，包括输注细胞的数量、肿瘤和非恶性肿瘤组织上的抗原表达密度、CAR设计以及给药方式。减轻“靶上/肿瘤外”毒性的工程策略目前研究人员利用合成生物学的方法以更好地限制CAR T细胞对肿瘤的强大细胞毒活性，从而避免“靶上/肿瘤外”毒性。CAR domains的调节和修饰通过修饰CAR的scFv进行亲和力调节成为一种有趣的方法，以获得足以识别肿瘤细胞的亲和力，同时避免TAA表达有限的非恶性细胞。这通过突变现有的scFv或通过筛选scFv文库来鉴定具有不同亲和力的替代结合子来实现。高亲和力的CAR T细胞可能对抗原低表达的肿瘤细胞具有更好的反应性，但也可能导致识别存在于瘤旁组织上的靶抗原。与靶抗原有很高亲和力的scFv可能会限制激活诱导的细胞死亡导致的CAR T细胞增殖的可能性。相反，低亲和力的CAR T细胞可能缺乏抗肿瘤活性，因为它们不能充分识别或溶解TAA表达水平较低的肿瘤细胞。在异位表达人HER2的小鼠模型中，检测了scFv亲和力对“靶上/肿瘤外”毒性的影响。研究人员发现，与靶向相同抗原的低亲和力CAR T细胞相比，高亲和力抗HER2 CAR T细胞对肝脏的损害更大。这归因于低亲和力的CAR T细胞从肝脏更快地清除。另外，研究人员在小鼠胶质母细胞瘤异种移植模型中测试抗EGFR CAR T细胞表明，“靶上/肿瘤外”毒性强烈依赖于CAR的亲和力。注射高亲和力抗EGFR CAR T细胞的小鼠毒性增加，53天存活率仅为57%，而注射低亲和力CAR T细胞的小鼠的存活率为100%。在体外和小鼠异种移植模型中，具有可变ScFv亲和力的抗HER2和抗EGFR CAR T在没有“靶上/肿瘤外”毒性的情况下都能产生强大的抗肿瘤反应。除了ScFv的亲和力调节外，对铰链和跨膜区(H/T)以及ITAM的修饰可以改变CAR的抗原密度阈值。例如，具有CD8-H/T的4-1BB-CD3ζ CAR T细胞与具有CD28-H/T的细胞相比，具有更高的抗原密度阈值，并形成不太稳定的免疫突触。此外，减少CD3 ITAM的数量可降低CAR T细胞对低抗原密度细胞的细胞毒作用，同时保持对高抗原密度靶细胞的细胞毒作用。CD3ζ中三个ITAM中的一个或多个的功能缺失突变也可用于校准激活和分化程序，突变的ITAM的位置可以决定CAR T细胞的功能、分化和抗肿瘤活性。Logic-gated CAR TLogic-gated方法可用于控制CAR T细胞的激活，降低“靶上/肿瘤外”毒性的可能性(图3)。下边就经典的Logic-gated方法做一个简要介绍。图3. Logic-gated CAR-T原理示意图使用AND-logic方法解耦CAR T的激活信号不同的CAR T细胞激活信号可以通过AND-logic方法去耦合，以在某些情况下避免“靶上/肿瘤外”毒性。双重AND-logic 细胞表达两个不同的合成受体(一个包含CD3 TAA，另一个包含CD28或4-1BB信号域)， (图4)。这种双重控制从理论上降低了”靶上/肿瘤外”毒性的风险，因为这两种TAA都需要在非恶性组织上表达才能使CAR T细胞完全激活，而只连接一个受体将导致信号减弱。针对CEA和Mesothelin的AND-logic CAR T细胞显示出对双重TAA阳性细胞的特异性细胞毒性，而不识别单一TAA阳性细胞。图4. 双重AND-logic CAR T细胞通过两个独立的受体结合不同的TAA来完成信号传递和共刺激检测TME有助于IF/THEN-logic gatingIF/THEN-logic gating提供了另一种策略，可以将CAR T细胞杀伤限制在TME中，并降低泄漏风险。设计pH敏感的CAR T细胞，从而在酸性环境中最佳地识别TAA，提供了一个基于IF/THEN-logic靶向的方法。这种方法利用了在许多肿瘤中普遍存在的Warburg效应，即TME中糖酵解加速和乳酸产生增加，从而导致肿瘤内环境酸性。在小鼠模型中，具有pH限制性结合的HER2靶向CAR优先在酸性TME中结合HER2，导致CAR T细胞的强劲扩增和高抗原密度HER2阳性肿瘤细胞的消退。低氧感应也可以将CAR的表达和活性限制在TME。在一项概念验证研究中，HIF1 CAR的低氧敏感域被融合到多链抗CD19 CAR的细胞内C末端。在常氧条件下，HIF1α区和CAR降解。然而，在TME的低氧条件下，HIF1α不会发生降解，从而使CAR能够表达。一种类似的方法已经应用于一种pan-anti-ErbB CAR，它防止了对小鼠的致命毒性。只有的缺氧条件下，T细胞才能选择性地表达CAR，导致卵巢癌小鼠异种移植模型的肿瘤得到有效控制，并且没有全身毒性。另一种方法是使用对蛋白酶敏感的连接子将掩蔽肽连接到抗EGFR CAR的抗原结合部位。CAR的抗原结合部位只能通过酶裂解掩蔽肽来释放。这一策略将CAR的功能限制在TME上，TME具有局部高浓度的膜型丝氨酸蛋白酶1(MT-SP1)、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)和溶酶体酶legumain。这种依赖蛋白水解酶的CAR提供了与未掩蔽CAR相同的抗肿瘤活性水平，但更具选择性。这些方法的一个重要隐患是，某些非恶性组织可能具有TME的特征，导致TME敏感的CAR  T细胞在远离肿瘤的解剖位置被激活。例如，在生理条件下，肾髓质和肠粘膜是低氧的。因此，以低氧或pH诱导的CAR表达或功能为特征的CAR  T的靶抗原应选择在低氧或酸性非恶性组织中不表达的TAA。SynNotch使用IF/THEN-logic gating促进多抗原检测使用合成Notch(SynNotch)的IF/THEN-logic gating CAR T细胞依赖于多抗原感知，克服了亲和力和选择性之间的权衡。将CAR T细胞效应器发挥功能依赖于多个肿瘤靶点，可以使具有更高亲和力的CAR得以使用，否则可能导致”靶上/肿瘤外”毒性。SynNotch CAR T细胞激活分两步进行，只有在SynNotch受体识别所谓的启动抗原后才能诱导CAR表达(图5)。在最初描述synNotch CAR T细胞的报道中，CAR的表达和T细胞的激活依赖于两个不同的TAA的识别。SynNotch CAR T细胞能够清除双TAA阳性肿瘤，而只表达一个TAA的细胞可以存活。图5.  SynNotch CAR细胞结构性地表达SynNotch受体另外研究人员设计了将 synNotch circuits与亲和力调节相结合的CAR T疗法。例如将低亲和力抗HER2 synNotch受体和高亲和力抗HER2 CAR结合。该系统允许synNotch CAR T细胞基于S形抗原密度阈值去识别靶点，在该阈值下，CAR T细胞在低水平的HER2表达时不活跃，但一旦HER2密度超过特定阈值，细胞毒性就会大幅增加。这些协同作用使强大的抗肿瘤活性受制于高抗原密度，从而降低了“靶上/肿瘤外”毒性的风险。外源控制的logic gating方法研究人员开发了一种可以执行AND-logic和NOT-logic gating的多抗原传感系统，称为Co-LOCKR(图6)。在这种方法中，CAR T细胞不直接与靶抗原结合，而是与两种促进CAR T细胞与靶细胞结合的可溶性中间蛋白(名为“cage”和“key”)结合。TAA结合的cage包含一个带有Bim结构域的闩锁，只有当共定位的关键蛋白与其各自的抗原结合时才会显示该结构域。随后，抗Bim CAR T细胞可以识别cage的Bim结构域并触发CAR T细胞杀伤。此外，给予一种可以结合非恶性组织上表达的特定抗原的诱骗蛋白，可以阻止CAR T细胞结合Bim结构域，从而避免CAR T细胞的激活。这种NOT-logic方法有望增加特异度并降低“靶上/肿瘤外”毒性的风险。图6. Co-LOCKR系统使用cage和key中间蛋白来识别和结合靶细胞小编小结TAA在实体瘤中的表达为CAR T细胞治疗奠定了基础，但它们在正常组织中的表达预示着CAR T 可能具有“靶上/肿瘤外”毒性的风险。目前在实体瘤的新型CAR T细胞的开发过程中，解决“靶上/肿瘤外”毒性的风险是临床成功开发安全有效的治疗策略的当务之急。调整scFv的亲和力并改变CAR架构可能会降低“靶上/肿瘤外” 毒性的风险。目前也已经探索了各种基于蛋白质的logic-gating策略，旨在进一步限制CAR T细胞的激活和对肿瘤部位的杀伤。期待这些策略可以尽快临床转化，以更好的帮助患者。参考文献Overcoming on-target, off-tumour toxicity of CAR  T cell therapy for solid tumours.Recent advances and discoveries in the mechanisms and functions of CAR T cells.Side-effect management of chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy.