TRAF3IP2

-01-引言目前，肿瘤免疫治疗已成为第三代肿瘤治疗中最活跃的研究领域。以PD-1、CTLA-4和PD-L1为靶点的免疫检查点抑制（ICI）疗法在多种癌症的治疗中显示出卓越的效果，并且ICI的免疫疗法随着新的免疫检查点的开发（如TIM-3、LAG-3和TIGIT）而继续扩大。然而，ICI治疗的主要目的是维持先前已建立的抗肿瘤活性。相比之下，刺激性免疫治疗靶点，如CD40、ICOS、CD27、GITR、OX40和4-1BB则用激动剂来激活免疫，主要集中在免疫反应的早期阶段。这些分子最先起作用的很可能是CD40，因为它在抗原呈递过程中起着关键作用，间接地激活T细胞。最新研究显示，CD40激动剂不仅可直接激活树突状细胞（DC）、B细胞等免疫“指挥官”，还能重塑肿瘤微环境（TME），甚至让“冷肿瘤”变得对免疫治疗敏感。CD40激动剂在癌症免疫治疗中正展现出巨大的潜力。-02-一、CD40/CD40L的表达为了获得强大而特异的免疫反应，固有免疫系统和适应性免疫系统需要在多个环节上进行协调。免疫反应的许多关键阶段是由肿瘤坏死因子超家族（TNFSF）的配体及其受体介导的，包括CD40/CD40L。抗原特异性T细胞的有效抗原识别关键取决于特异性抗原呈递细胞（APC）的存在和功能，如B细胞和DC细胞。这些APC通常在细胞表面表达共刺激表面受体CD40（TNFRSF5）。CD40是一种48kda大小的Ⅰ型跨膜蛋白，是连接固有免疫和适应性免疫的重要免疫细胞通讯介质。CD40存在于血小板、B细胞和髓系细胞，但也存在于非造血细胞，如内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞甚至某些类型的肿瘤细胞。CD40的同源配体是CD154（TNFSF5/CD40L），一种39kda的II型跨膜蛋白。CD40L的表达通常可诱导并局限于造血系统的细胞，如血小板、粒细胞、活化T细胞、活化B细胞和活化自然杀伤细胞（NK）细胞，但内皮细胞和平滑肌细胞也有弱表达。-03- 二、CD40/CD40L的结构、组成及信号通路TNFRSF信号传导的结构已经比较明确，需要恰当的三维受体聚集和三聚体化。虽然TNFSF配体天然以三价功能单位存在，但受体通常分散分布在细胞表面。TNFSF配体以同源三聚体的形式自然地聚集在细胞表面，其中三个受体结合位点位于相邻单体之间的三个完全相同的缝隙处。关键的是，受体组装成功能性的三聚体复合物是通过天然配体单元的结合发生的。这些三聚体TNFSF配体与在其他细胞表面表达的相应受体的相互作用导致了非常精确的受体聚集。配体对细胞外受体的指令传递给邻近的受体细胞内结构域，然后是细胞内信号复合物的有序组装。TNFSF配体的三聚体结构和由此产生的受体簇是信号传递到细胞的前提。由于这种特殊的要求，一价和二价的结构在体内通常被证明是极低效的。与TNFRSF的其他成员一样，CD40是一种膜结合分子，可以通过细胞间直接接触被膜结合配体激活，也可以被溶液中的可溶性配体激活。多种下游分子和细胞反应进程已被证明受到CD40结合的调节。同源配体连接受体可诱导形成空间上明确的三聚体信号复合物，促进TNF受体相关因子（TRAFs）和NFκB激活剂-1（Act1）的招募。信号复合物的特定组成，主要取决于细胞类型，触发各种途径。例如，与TRAF6的结合主要激活JAK/Stat3通路，TRAF1/2诱导MKK/p38/ERK1/2信号传导，Act1在NFkB通路、JNK和PI3K信号传导中具有多种功能，并与TRAF3一起放大MKK/p38/ERK1/2信号。此外，根据特定的环境，CD40结合可以激活“经典”和非典型的NFkB通路。-04-三、CD40/CD40L的生物学作用CD40在单核细胞及其子代巨噬细胞和DC细胞以及B细胞上的表达在发挥免疫细胞的功能中起着重要作用。单核细胞是固有免疫前体细胞，具有很高的可塑性。它们具有分化为多种细胞类型的能力，如巨噬细胞、髓源性抑制细胞（MDSC）和DC细胞。CD40信号是单核细胞成熟过程的重要触发因素，主要驱动分化为M1谱系的巨噬细胞和DC细胞。CD40与DC细胞表面的结合促进了细胞因子和趋化因子的产生，诱导共刺激分子的表达，并促进抗原的交叉呈递。CD40L的主要功能之一是通过激活DC细胞来增强抗原对T细胞的提呈。这一步称为“许可”，通过上调表面蛋白如CD54和CD86，增加DC与T细胞的相互作用，从而激活后者。B细胞也是CD40L活性的靶点。在胸腺中，T细胞和B细胞之间广泛的串扰使之必须维持表达CD40的B细胞，从而保持自体反应性T细胞对B细胞的阴性选择。B细胞与CD4+T细胞的直接相互作用诱导T细胞表达CD40L，进而保护B细胞不受凋亡的影响。在这个功能中，CD40L通过激活PI3K/Akt提供一个生存信号，使活化的B细胞维持寿命并向浆细胞分化。抗原特异性B细胞通过CD40的稳态增殖和生存机制是通过抗凋亡成员Bcl-2家族的上调来维持的。事实上，CD40/CD40L系统的缺陷与B细胞的抗体类别转换以及细胞超突变的缺陷（hyper-IgM综合征）有关。B细胞与活化的表达CD40L的T细胞的相互作用也增加了MHC-II和CD80或CD86等共刺激分子的表达，并诱导B细胞中的Ig类别转换。活化的B细胞迁移到淋巴器官，在那里向T细胞呈递抗原，CD40激活的DC和B细胞通过释放免疫刺激性细胞因子和趋化因子如IL-6、IL-12p70、IFNγ、CXCL10和TNFα来支持免疫应答。此外，CD40活化的B细胞能够通过促进TNFα和IFNγ等细胞因子的分泌来诱导抗原特异性CD8+T细胞。一些研究证明，体外活化的表达CD40的B细胞是完全功能性抗原提呈的B细胞，随后用这些细胞进行过继细胞转移（ACT）治疗可提高抗肿瘤的疗效。-05-四、CD40/CD40L与肿瘤免疫数十年来，CD40/CD40L信号传导同步免疫反应的固有、细胞和体液分支的非凡能力激发了基础和临床研究的灵感。鉴于CD40的一般表达谱和生物学活性，人们已经做了许多尝试来探索CD40/CD40L信号在抗肿瘤免疫中的作用。CD40激活的DC细胞可用于癌症和传染性疾病（如结核病）的疫苗治疗。CD40信号的另一个有趣结果是表型从“另类活化”的M2型向抗肿瘤或“经典活化”的M1型的转变。这种M1/M2型的命名与肿瘤相关巨噬细胞（TAM）在肿瘤免疫治疗中特别相关。所谓的M1型的“经典活化”巨噬细胞产生于对GM-CSF以及IFNγ和LPS等刺激物的反应，通常被认为具有促炎性免疫反应和抗原交叉呈递的作用。M1型巨噬细胞主要与良好的抗肿瘤免疫反应相关。“另类活化”的M2型巨噬细胞是由于暴露于M-CSF和细胞因子（如IL-4和IL-10）而产生的，并参与组织修复和消除炎症状态。肿瘤相关的M2型被认为是癌症进展和转移的关键驱动因素。肿瘤和浸润性巨噬细胞的紧密相互作用强烈地塑造了肿瘤微环境，从而建立了炎症或促肿瘤的局部条件。有人提出，改善肿瘤内M2/M1谱系的平衡可以通过促进细胞毒性T细胞的浸润和激活来提高抗肿瘤免疫反应。这一点已经在多个模型中进行了描述，例如胰腺癌和小鼠异种移植胶质母细胞瘤模型。巨噬细胞复极化与CD40活化诱导CD206下调和CD54表达增加一致，表明巨噬细胞迁移能力的改变和有效激活。有趣的是，尽管CD40在许多组织中广泛表达，肿瘤细胞似乎更易受膜结合CD40L诱导的CD40杀伤。在B16黑色素瘤小鼠模型中，DC细胞上表达的膜结合CD40L可直接诱导CD40阳性肿瘤细胞凋亡，而非T细胞依赖的的细胞生长抑制活性则源于CD40刺激的IFNγ激活的巨噬细胞。这一现象的部分原因可能不是CD40信号的直接作用，而是对易感细胞类型死亡受体的二次上调。然而，抗CD40抗体Lucatumumab和dacetuzumab对B细胞恶性肿瘤有一定的临床效果，这可能归因于抗体介导的巨噬细胞吞噬和抗体依赖性细胞毒性（ADCC）的作用。结合CD40后，肿瘤细胞显示出DNA损伤的迹象，分泌促血管生成因子，如VEGF和IL-8，并且通常表现出衰老相关分泌表型（SASP）的状态，这是由于CD40诱导的NFκB通路的激活。-06-五、CD40激动剂的药物开发现状基于其独特的受体聚集模式，从TNFRSF产生的下游信号依赖于具有非常精确的结构和三维组成的激动剂化合物。由于CD40在抗肿瘤免疫反应中发挥关键作用，诱导CD40信号的各种策略已经被广泛地研究探索。大致可分为基于激动剂抗体的方法或基于CD40L的方法。目前，临床开发中有9种激动性人抗CD40抗体：4种IgG1抗体（APX005M、mitazalimab、2141-V11、SEA-CD40），2种IgG2抗体（selicrelumab和CDX-1140），1种IgG突变抗体（LVGN7409）和2种双特异性抗体（RO7300490、ABBV-428）。SelicrelumabSelicrelumab（也称为CP-870893，RO7009789）是一种完全人IgG2抗体，不依赖于通过Fc结构域交联来激活CD40。selicrelumab是临床试验中研究最广泛的CD40激动剂。最近，一项1期研究评估了selicrelumab在胰腺导管腺癌（PDAC）患者手术前使用或不使用化疗（nab-紫杉醇和吉西他滨）的新辅助治疗（NCT02588443）。接受selicrelumab单药治疗的患者的1年OS率（中位数+SE）分别为81.8%+11.8%，接受selicreumab联合化疗的患者为100%。Selicrelumab耐受性良好，相关不良事件（AE）大多较轻。此外，发现了selicrelumab诱导TME调节的证据，包括T细胞浸润、DC成熟、巨噬细胞复极化和肿瘤基质密度降低。CDX-1140CDX-140是一种人IgG2单克隆抗体，可驱动NF-kB激活。它结合CD40L结合位点之外的结构域，其激活机制独立于FcR交联。来自评估CDX-1140与抗PD-1治疗（pembrolizumab）联合使用或不使用的I期试验的数据显示，1.5 mg/kg CDX-1140联合200 mg pembrolizumab的剂量具有良好的安全性。观察到临床益处，尤其是在非小细胞肺癌（NSCLC）患者中，有80%的可评估患者具有稳定疾病（SD），而所有患者在之前的基于抗PD-1/L1的治疗中都经历了进展性疾病（PD）（NCT03329950）。APX005MAPX005M是一种人源化IgG1单克隆CD40抗体。通过Fc结构域中的点突变，APX005M增强了与FcγRIIb的结合亲和力，促进了CD40的交联并介导了ADCC。多个早期临床试验评估了APX005M与免疫疗法的联合应用。一项II期研究评估了APX005M与化疗（nab-paclitaxel和吉西他滨）联合使用或不使用抗PD-1（nivolumab）治疗转移性胰腺癌患者的疗效。研究表明，APX005并没有显著改善OS：在105名患者中，nivo/化疗达到了1年总生存期（OS）的主要终点，但APX005M/化疗或APX005M/Cnivo/化学均未达到。然而，APX005M/化疗后的存活率与更显著的肿瘤内CD4+T细胞浸润、循环分化的CD4+T细胞和APCs相关（NCT03214250）。最近，在随后的一项II期研究中，研究了APX005M与纳武单抗联合治疗抗PD-1疾病进展后的转移性黑色素瘤患者。客观反应率（ORR）为15%，中位反应持续时间至少为26个月。MitazalimabMitazalimab（也称为ADC-1013和JNJ-64457107）是一种靶向CD40的人IgG1单克隆抗体。它被设计为以FcγR依赖的方式与CD40结合，具有高效力和亲和力，这有利于肿瘤内给药，以减少剂量和不良免疫相关事件。在一项针对晚期实体瘤患者的I期研究中，静脉注射0.075-2mg/kg的Mitazalimab显示出可控的安全性。 2141-V112141-V11是一种完全人IgG1 CD40抗体，是selicrelumab的Fc优化版本，其中人IgG1 Fc经过5位点突变改造，可增强Fc与FcγRIIB的结合。一项I期研究评估了2141-V11在皮肤转移的实体瘤患者中的作用，在局部和远处病变中显示出抗肿瘤活性的迹象（NCT04059588）。另一项I期研究调查了2141-V11单药治疗对标准治疗无效的非肌肉浸润性癌症（NMIBC）患者的安全性和剂量（NCT05126472）。局部膀胱内给药用于减轻全身毒性。此外，在复发性胶质母细胞瘤患者的I期研究中，通过增强递送（CED）将2141-V11与免疫毒素（D2C7-IT）联合用于肿瘤内给药是安全且有一定疗效的：在入组的5名患者中，一名0.70 mg剂量的患者和两名2.0 mg剂量的患者观察到肿瘤响应的早期迹象。SEA-CD40SEA-CD40是一种全人源的非岩藻糖基化IgG1单克隆CD40抗体。非岩藻糖基化抗体增强了与FcγRIIIa受体的结合，可能提高了激动疗效。一项首次人体I期试验评估了晚期实体瘤和淋巴瘤患者的静脉注射SEA-CD40单一疗法。然而，SEA-CD40的抗肿瘤作用很小，在基底细胞癌患者中有1.8%（1/56）的部分反应，在滤泡性淋巴瘤患者中有1.8%（1/56）的完全反应。另一项研究检查了SEA-CD40联合化疗（nab紫杉醇和吉西他滨）和pembrolizumab治疗转移性PDAC患者的疗效。在10μg/kg和30μg/kg的剂量组中，分别有48%和38%的患者观察到了客观响应。两个剂量组的中位反应持续时间均为5.7个月（NCT02376699）。LVGN7409LVGN7409是一种IgG突变重组单克隆CD40抗体，具有工程Fc片段，可选择性结合FcγRIIB。LVGN7409以FcγRIIB交联依赖的方式激活CD40，因此在富含CD40和FcγRIIB的TME中发挥最佳作用。目前，有两项LVGN7409的I期研究。LVGN7409的第一项人体I期研究是在有或没有抗PD-1抗体（LVGN3616）和/或CD137激动剂抗体（LVGD6051）的情况下评估LVGN7407。静脉注射LVGN7409单药治疗在2 mg/kg以下具有良好的耐受性（NCT04635995）。RO7300490RO7300490是一种针对CD40和成纤维细胞激活蛋白（FAP）的新型双特异性抗体，后者在肿瘤组织中经常过表达，在健康组织中表达较低。因此，RO7300490能够直接重塑TME，同时可能避免与全身CD40激活相关的毒性。目前，一项I期研究正在评估RO7300490在晚期实体瘤患者中使用或不使用atezolizumab的疗效（NCT04857138）。ABBV-428ABBV-428是另一种双特异性抗体，旨在通过与肿瘤抗原间皮素相互作用实现CD40的局部激活。第一项人体I期研究评估了ABBV-428在晚期实体瘤患者中使用或不使用纳武单抗的情况（NCT02955251）。根据接受ABBV-428单药治疗的患者的中期数据，36%的患者在推荐的II期剂量（3.6 mg/kg）下的最佳临床反应为SD。未观察到CD40激动剂的毒性。然而，ABBV-428产生的临床活性很小，这可以用肿瘤细胞上间皮素的低表达来解释，这将限制肿瘤的可及性和ABBV-428对CD40的交联。-07-结语增强抗肿瘤免疫应答的策略是肿瘤学最有希望的新进展之一，而TNFRSF成员，如CD40，是其中重要的靶点。由于产生高效TNF-R-SF信号的独特要求，激动剂分子必须产生非常精确的受体结构和三维结构。虽然已经探索了诱导CD40信号的各种策略，但是20年来有限的临床成功表明需要探索新的方法，这种信号通路激动剂的真正威力尚未在临床开发中充分释放出来。目前CD40激动剂临床疗效有限的原因归咎于抗体的结构和功能特性，包括每个分子只有两个靶结合位点，不适合刺激TNFRSF。由于这一信号通路具有广泛的靶向性，因此也可与其他药物和疗法联合应用。相信不久的将来会产生更多令人鼓舞的临床数据，提高治疗效果，并拓宽更多癌症患者的治疗选择。参考资料：1.Concepts for agonistic targeting of CD40 in immuno-oncology. Hum Vaccin Immunother. 2020;16(2):377-387.2. Harnessing the Potential of CD40 Agonism in Cancer Therapy. Cytokine Growth Factor Rev. 2023 Dec 4;75:40–56公众号内回复“ADC”或扫描下方图片中的二维码免费下载《抗体偶联药物：从基础到临床》的PDF格式电子书！公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。

摘要：尽管基于干细胞的治疗方法在管理某些疾病方面显示出比传统手术更大的潜力，但它也不可避免地存在一些缺点，这些缺点可能会限制其临床转化。与干细胞相比，干细胞衍生的外泌体拥有许多优势，例如无免疫原性、无输注毒性、易于获取、保存方便，且没有致瘤潜力和伦理问题。外泌体可以通过垂直传递其多能性或多向分化能力，从其亲本细胞（如胚胎干细胞和成体干细胞）继承相似的治疗效果。在对过去五年的相关文献进行彻底搜索和细致剖析后，我们呈现了这篇全面、最新、专业特定和疾病导向的综述，以突出干细胞衍生外泌体在外科应用和潜力。来自干细胞（例如胚胎干细胞、诱导多能干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞和内皮干细胞）的外泌体能够治疗骨科手术、神经外科、整形外科、普通外科、心胸外科、泌尿科、头颈外科、眼科和妇产科中遇到的众多疾病。干细胞衍生外泌体的多样化治疗效果是通过组织特异性反应和细胞特异性分子信号通路的层级转化实现的。在这篇综述中，我们强调干细胞衍生外泌体作为管理各种外科状况的干细胞疗法的可行且强大的替代方案。我们建议未来的研究结合外科医生、纳米医学从业者和干细胞研究者的智慧，在这一相关且引人入胜的研究领域进行探索。 1.引言 干细胞是一群未分化的细胞，具有自我更新和重建功能性组织的独特能力。它们主要根据分化潜能、来源和谱系进展进行分类。根据它们的潜能，干细胞可以是全能的、多能的、多向的、寡能的和单能的。干细胞存在于胚胎和成体细胞中。胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）是多能干细胞的最佳例子，而成体多能干细胞则以造血干细胞（HSCs）、间充质干细胞（MSCs）、神经干细胞（NSCs）和内皮干细胞/祖细胞（EPCs）为代表。所有这些亚型的干细胞都已广泛用于人类疾病的治疗。 作为再生医学的一种方式，干细胞疗法引起了巨大关注，因为它为以前无法治愈的疾病患者提供了新的选择。随后，成千上万的相关临床试验被注册，涵盖了广泛的医学问题，如肌肉骨骼和神经系统疾病、免疫疾病、血液学功能障碍和退行性状况。然而，一些试验未能在临床上显示出任何益处。这可能是由于干细胞疗法不可避免的限制，如输注毒性、免疫原性、致瘤潜力和伦理问题。 外泌体，由几乎所有细胞类型包括干细胞分泌，被认为是比干细胞疗法更安全、更通用的替代品。外泌体是纳米级、球形、脂质双层单膜细胞外囊泡，充当细胞间信使。外泌体被视为其亲本细胞的缩小版，部分原因是某种细胞类型的外泌体提供细胞特异性或独特的生物分子集合。此外，已发现干细胞通过其可溶性分泌物包括外泌体以旁分泌方式发挥作用。换句话说，干细胞衍生的外泌体（SC-Exo）继承了其亲本细胞相似的治疗效果，例如抗炎、免疫调节和组织再生。总的来说，干细胞衍生的外泌体是干细胞疗法的强大替代品，没有表现出其细胞对应物所呈现的缺点。（表1） 在临床应用之前，外泌体必须在生产、纯化和修饰方面进行准备和优化。近年来，已发表了许多医学综述，分析了外泌体疗法的这些上游措施。然而，一些研究途径仍然未被充分调查：特别是，缺乏系统调查下游临床应用的研究，尤其是从外科角度来看。无论是由疾病还是外科医生的手术刀造成的组织损伤，都会通过炎症和再生动态作出反应，这使得外科成为干细胞衍生外泌体疗法的完美场所。干细胞衍生的外泌体继承了其亲本细胞相似的治疗效果，例如组织再生、抗炎和免疫调节。 在这项工作中，我们将剖析过去五年的相关出版物，以呈现一个全面、最新、专业特定和疾病导向的综述。我们的目标是弥合目前外科医生、纳米医学从业者和干细胞研究者之间存在的差距。 2.外泌体和外泌体疗法的一般背景 2.1.外泌体的生物发生、组成和摄取 外泌体在大小、内容和生产机制方面与其他类型的原发性细胞外囊泡（例如凋亡体和小囊泡）不同。外泌体形成的最广泛接受的机制，即内体途径，如下。最初的内体是通过细胞膜内陷产生的，在这个过程中生物活性物质开始在早期排序内体中积累。晚期排序内体随后形成多泡体（MVBs），在第二次内陷后。最后，MVBs与细胞膜融合，将携带的外泌体释放到外部。也有报道称非内体途径的外泌体生物发生，例如血浆膜出芽。 正如三大外泌体数据库（即ExoCarta、VesiclePedia和EVpedia）总结的，外泌体包含众多分子，包括蛋白质、糖复合物、脂质、核酸、代谢物和其他生物活性物质。每个类别的例子及其相应功能已在其他地方进行了全面审查。一方面，外泌体包括一个复杂的蛋白质网络，包括外部蛋白质（例如四跨膜蛋白、抗原呈递复合物和粘附分子）和内部蛋白质（例如热休克蛋白、ESCRT机制、细胞因子和趋化因子以及膜转运蛋白）。另一方面，作为人类外泌体核酸中最丰富的，微小RNA（mRNA）可以通过外泌体介导的细胞间通信参与造血、外泌体和神经及血管再生。 外泌体一旦到达受体细胞，就有多种摄取机制，这些机制可以归类为膜融合、受体相互作用和内吞作用（图1b）。最终，外泌体的货物被释放到细胞质中，这一过程取决于外泌体的来源、货物的性质以及受体细胞的代谢状态。从外泌体生物合成到摄取和细胞内信号传导的整个生命周期可以使用荧光、发光和放射性技术进行追踪。 图1 外泌体治疗的上游措施说明（使用Autodesk 3ds Max 2023生成的图表）。a 外泌体的生产和纯化（以MSCs和NSCs为例，展示多能干细胞）。b 天然外泌体的内容。c 外泌体的修饰。（BM 骨髓，DC 树突细胞，IAC 免疫亲和色谱，iPSC 诱导多能干细胞，MHC 主要组织相容性复合体，miRNA 微小RNA，MSC 间充质干细胞，MVB 多泡体，NSC 神经干细胞，SEC 尺寸排阻色谱，UC 脐带） 2.2.外泌体的来源和分类 根据外泌体是否经过人工修饰，它们大致被分类为天然外泌体和工程化外泌体（第2.4节）。根据物种来源，外泌体被分为动物源性和植物源性外泌体。目前，外泌体主要根据其亲本细胞的类型进行分类。几乎所有类型的人类细胞都能产生外泌体。这些包括但不限于巨噬细胞、树突状细胞（DCs）、血小板、干细胞，甚至是肿瘤细胞（图1a）。 例如，巨噬细胞源性外泌体有助于疾病进展（例如糖尿病、动脉粥样硬化和心力衰竭）和疾病治疗（例如皮肤创伤、炎症性肠病和真菌及病毒感染）。然而，它们在抑制和促进肿瘤方面似乎扮演着矛盾的角色。与DCs类似，DC源性外泌体（Dex）也可以通过其表面蛋白如主要组织相容性复合体（MHCs）与免疫细胞（例如T细胞、B细胞和NK细胞）相互作用。一些临床前和临床试验已经证明了基于Dex的免疫疗法对癌症的有效性和安全性。此外，肿瘤源性外泌体（Tex）不仅参与肿瘤增殖、侵袭、转移和免疫，而且可以作为癌症诊断和治疗的生物标志物。最近，Tex被用作抗肿瘤药物和DC疫苗的抗原呈递者，作为一种有前景的无细胞癌症免疫疗法。最后，干细胞源性外泌体的临床应用将在以下部分详细讨论。 外泌体可以在所有体液中找到，如血液、唾液、尿液、血浆、眼泪、精液、羊水甚至母乳。体液衍生的外泌体是疾病生物标志物的高稳定储库，协助液体活检在各种临床环境中进行，如癌症、心血管疾病和围产期疾病。然而，每种体液中共同存在的内容和可用性可能会给外泌体分离带来挑战。 2.3.外泌体的生产、分离和纯化 阻止基于外泌体的治疗进入临床实践的主要障碍之一是外泌体的产量和效率低。例如，在实验室环境中，从1毫升培养基中只能收获不到1微克的外泌体蛋白。有各种扩大外泌体生产的方法，这些方法被归类为生化策略（例如LPS、BMP-2、HIF-1α和IFN-γ及TNF-α）、物理策略（缺氧、热应激和饥饿）、机械策略（剪切应力和3D培养）和仪器策略（中空纤维生物反应器和搅拌罐生物反应器）。 外泌体在大小、内容、表面标记和来源方面是异质的，这使得它们的分离变得困难。目前可用的外泌体分离和纯化技术是基于它们的大小、表面电荷或免疫亲和性（图1a）。然而，没有一种“一刀切”的方法，因为这些技术都有优点和缺点。 例如，超速离心被认为是外泌体提取的金标准。尽管它需要最少的试剂和专业知识，但时间消耗、高成本、低效率和脂蛋白共分离限制了它的大规模使用。免疫亲和色谱是一种基于抗体和配体特异性结合的分离技术。它快速且提供高纯度、特异性和产量。然而，使用的抗原/蛋白偶联需要表达在外泌体表面。基于大小的分离技术主要是指超滤和尺寸排阻色谱，这两种方法都快速且适合大规模应用。但是孔堵塞、外泌体丢失和纯度低使得这种方法难以普及。尽管没有单一的技术是完美的，将上述技术与其他技术（例如基于沉淀和基于微流体的）结合起来可能是一种解决方案，以同时满足外泌体分离和纯化的多重要求。 2.4.外泌体的修饰 外泌体可以生化修饰以扩大、改变或改善它们的治疗效果。外泌体的修饰分为内部策略（例如药物装载）和外部策略（例如表面修饰）。一方面，外泌体可能是一个理想的治疗载体，用于输送药物、核酸和疫苗，因为它们在稳定性、非免疫原性和靶向受体细胞方面的优势。有各种货物装载技术，包括生产前装载方法（例如转染、共培养和电穿孔）和生产后装载方法（例如冻融循环、孵化、超声、挤出和低渗透析），这取决于它们是在外泌体生物合成之前还是之后应用（图1c）。例如，Tian等人使用电穿孔将阿霉素装载到Dex中以治疗乳腺癌。Kim等人使用孵化和超声将紫杉醇装载到RAW 264.7衍生的外泌体中以克服癌细胞的多药耐药性。Ohno等人使用转染将抗肿瘤let-7a miRNA装载到HEK293衍生的外泌体中以管理乳腺癌。 另一方面，外泌体的表面修饰以遗传工程外泌体膜或亲本细胞、化学连接靶向配体、静电相互作用和磁性纳米颗粒技术为例。表面修饰的主要目的是选择性地将外泌体输送到目标细胞以进行精确治疗。例如，Alvarez-Erviti等人通过遗传工程修改DC以表达Lamp2b和RVG肽，从而靶向中枢神经系统（CNS）。Zhu等人使用化学反应将肿瘤靶向肽c(RGDyK)插入外泌体表面以靶向胶质母细胞瘤。Nakase等人使用静电相互作用将外泌体与由pH敏感融合肽和阳离子脂质形成的复合物结合，从而实现增强的细胞质递送。 2.5.外泌体的特性和验证 外泌体在治疗应用前需要进行特性和验证。当前用于外泌体特性的方法主要集中在外泌体的大小、形态和货物剖面上。基于大小的验证包括纳米颗粒跟踪分析（NTA）、动态光散射（DLS）和可调电阻脉冲传感（TRPS），而基于形态的分析包括扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）。此外，货物剖面进一步细分为蛋白质组学、脂质组学和基因组学分析，包括西方印迹、ELISA、流式细胞术、质谱和PCR。由于上述每种特性方法都有优点和缺点，将三个方面的分析结合起来是一种普遍做法，例如一组TEM、NTA和西方印迹，以识别分离的外泌体。 例如，基于显微镜的方法，如SEM和TEM，可以分别直接可视化表面形貌和内部结构。然而，由于操作复杂和样品制备繁琐，TEM不适合快速测量大量样品。NTA有助于快速检测和实时外泌体观察，同时比流式细胞术具有更高的分辨率。NTA的主要缺点是难以区分外泌体和污染蛋白。作为一种成熟的技术，西方印迹可以定性和定量地检测外泌体蛋白生物标志物的表达，特别是来自细胞培养介质的外泌体。然而，它耗时且不适合检测来自生物流体的外泌体。 2.6.外泌体的储存 目前用于外泌体长期保存的方法主要包括冷冻保存、冻干和喷雾干燥。温度和防冻液是冷冻保存中最重要的两个成分。4°C的储存可能会削弱外泌体的生物活性并减少蛋白含量，而-80°C被认为是对外泌体形态和内容影响最小的最佳温度。不可渗透的二糖防冻液，特别是海藻糖，是最佳选择，因为它可以防止外泌体聚集和冷冻损伤。对于热敏感材料，例如外泌体和疫苗，通过冷冻干燥的冻干处理可以轻易储存，并且通过简单地加水重新配制。最近的一项研究表明，即使在室温下储存，带有冷冻保护剂的冻干可以保持外泌体蛋白和RNA的活性大约4周。最后，与冷冻干燥相比，喷雾干燥是一个单步过程，从而减少了对昂贵设备和漫长多步骤研磨的需求。然而，喷雾干燥的核心参数，如外泌体给药速率、雾化压力和出口温度，都会影响外泌体的稳定性和货物完整性。 图2 外泌体治疗在外科应用的下游说明（使用Adobe Photoshop 2023和Adobe Illustrator 2023生成的图表）。外泌体的治疗效果是通过疾病特异性组织反应、组织特异性细胞变化和细胞特异性分子信号通路的层次转化实现的。 3.骨科和创伤手术以及SC-EXO治疗 3.1.骨折 骨折是最常见创伤性大型器官损伤，大约有10%无法正常愈合。骨折愈合涉及一个合成组织体积增加阶段和一个分解组织重塑阶段，这两个阶段受到各种因素的控制，如干细胞、先天和适应性免疫功能以及稳定性。骨折的生物药理治疗可以局部给药（例如骨形态发生蛋白，BMP）或系统给药（例如甲状旁腺激素，PTH）。作为一种有前景的替代方案，外泌体治疗骨折愈合主要利用骨髓源性MSCs作为细胞供应者（表2）。 推测MSC源性外泌体促进骨折愈合的机制如下。首先，骨修复的进展需要多种细胞，例如炎症阶段的炎症细胞、纤维血管阶段的内皮和间充质祖细胞、骨形成过程中的成骨细胞和软骨细胞以及骨痂重塑过程中的破骨细胞。其次，这些细胞中的大多数可以吸收外泌体，特别是成骨细胞和血管内皮细胞，它们与骨折愈合最为相关。最后，在吸收外泌体后，受体细胞的基因表达被修改，从而激活各种信号通路（图3a），引起各种细胞和组织反应（图3b），最终导致改善骨折愈合。 图3 干细胞衍生外泌体治疗的机制（使用Adobe Photoshop 2023和Adobe Illustrator 2023生成的图表）。a 激活和调节各种信号通路。b 疾病特异性的细胞和组织反应。 早期研究使用了各种动物模型来研究骨折愈合。在横向股骨干骨折模型中，发现外泌体不仅促进了野生型小鼠的成骨作用，还挽救了CD9−/−小鼠骨折愈合的迟缓，这是一种已知具有较低骨结合率的品系。在股骨不连模型中，外泌体通过可能的BMP-2/Smad1/RUNX2途径促进成骨和血管生成，从而增强骨折愈合。在胫骨牵张成骨模型中，年轻MSC分泌的外泌体促进了老年MSC的成骨能力，并在老年大鼠中增强了新骨形成。此外，EPC源性外泌体通过刺激血管生成加速牵张成骨过程中的骨再生。作为外泌体的主要货物（第2.1节），RNA可以改变受体细胞的基因表达和表型功能，其中微小RNA（miRNA）和长非编码RNA（lncRNA）被最广泛研究。从外泌体miRNA的角度来看，一个小组发现，骨髓MSC源性外泌体中的miR-136-5p促进了体外成骨细胞的增殖和分化，从而促进了体内的骨折愈合。这是通过抑制miR-163-5p的下游靶基因，低密度脂蛋白受体相关蛋白4（LRP4），通过Wnt/β-catenin途径实现的。另一个小组发现，MSC源性外泌体miR-25可以通过Smad泛素化调节因子1（SMURF1）调节Runt相关转录因子2（Runx2）的泛素化和降解，以促进小鼠骨折愈合。从lncRNA的角度来看，特别是骨特异性lncRNA H19，一个中国小组揭示了尽管高脂饮食减少了成骨分化并削弱了骨折愈合，但这可以通过MSC源性外泌体lncRNA H19通过miR-467/HoxA10轴在肥胖诱导的骨折模型中逆转。此外，一个美国小组证明了外泌体lncRNA H19不仅改善了成骨作用，还通过血管生成素1/Tie2-NO信号途径改善了血管生成。 与其使用MSC自然衍生的外泌体，一些研究人员对分离前的外泌体进行了预处理以获得更好的结果。梁等人用小剂量的二甲基草酰甘氨酸（DMOG），一种小的血管生成分子，预处理MSCs，以准备外泌体，通过靶向蛋白激酶B/mechanistic target of rapamycin（Akt/mTOR）途径，在临界尺寸颅骨缺损模型中增强血管生成和骨再生。另一种方法，陆等人将miR-29a装载到MSC源性外泌体中，通过靶向vasohibin 1，显示出强大的促进血管生成和成骨作用的能力。此外，脐带MSC源性外泌体在骨折愈合中显示出与骨髓MSC相当的成果。此外，低氧条件下的MSC源性外泌体对骨折愈合的效果比正常氧条件下的更好。从机制上讲，低氧预处理通过激活低氧诱导因子1（HIF-1α）增强了外泌体miR-126的产生。各种研究表明，低氧预处理是MSC源性外泌体治疗骨折愈合效果的有效和有前景的优化方法。 3.2.骨关节炎 骨关节炎（OA）是最常见的关节疾病，也是成人活动限制的最常见原因，全球约有2.4亿患者受到影响。OA的病理学已经从被视为仅软骨发展到影响整个关节的所有组成部分的多组织疾病，包括骨骼、滑膜、肌肉、韧带和周围脂肪。临床试验成功揭示了阻止结构进展（例如，组织蛋白酶K和Wnt抑制剂）或减少OA疼痛（例如，神经生长因子抑制剂）的系统化合物。作为一种潜在的OA治疗选择，大多数MSC源性外泌体治疗在体外模型中以软骨细胞为目标。这些MSCs可以来自各种组织，如骨髓、滑膜、牙龈和髌下脂肪垫（IPFPs）。 一些关注软骨生成的研究特别关注miRNA的作用。吴等人发现IPFP MSC源性外泌体通过miR100-5p调节的mTOR-自噬途径抑制来保护关节软骨免受损害，并改善OA小鼠的步态异常。由于在临床上通过关节镜手术容易从OA患者中检索到人类IPFP，这种类型的外泌体治疗可能会简化和加速从实验室到床边的过程。刘等人发现MSC源性外泌体可以通过lncRNA-KLF3-AS1/miR-206/GIT1轴促进软骨细胞的增殖并抑制其凋亡。孔等人进行的细胞工作表明，滑膜MSC源性外泌体miR-320c可以通过靶向ADAM19增强软骨生成。此外，毛等人建议，来自软骨生成MSCs的外泌体miR-92a-3p可以通过靶向Wnt5a增强软骨生成并抑制软骨降解。82 与这些使用原始外泌体的研究相比，很少有小组在系统给药前对外泌体进行了修改。陶等人通过转染滑膜MSCs与miR-140-5p修改外泌体，发现外泌体miR-140-5p过表达可以增强软骨组织再生并防止大鼠模型中的膝关节OA。同时，王等人使用TGF-β1刺激MSCs，由此产生的外泌体miR-135b通过调节特异性蛋白-1增加了软骨细胞的增殖。在一项比较研究中，朱等人证明了来自iPSC衍生的MSCs的外泌体比滑膜MSC衍生的外泌体对OA的治疗效果更强。 其他研究不仅关注软骨形成，还关注在骨关节炎(OA)治疗中的抗炎和免疫调节作用。例如，间充质干细胞(MSC)衍生的外泌体在体外抑制了炎症因子、与谷氨酰胺代谢活性相关的蛋白、谷氨酰胺以及GSH/GSSG比例，同时在体内改善了小鼠的软骨细胞功能、组织炎症和运动能力，从而缓解了OA的进展。使用整体方法，近期研究已将注意力从软骨转移到其他组织（例如，骨骼）在关节中。首先，骨髓MSC衍生的外泌体miR-206促进了OA中成骨细胞的增殖和成骨分化，通过减少E74样因子3(Elf 3)，改善了炎症，并增加了小鼠股骨组织中骨钙素和BMP2的表达。其次，MSC外泌体处理的骨软骨缺陷表现出再生免疫表型，特征是CD163+ M2型巨噬细胞的浸润高于CD86+ M1型巨噬细胞，并伴随着促炎滑膜细胞因子IL-1β和TNF-α的减少。最后，牙龈MSC衍生的外泌体在预防胶原诱导的关节炎方面被证明具有免疫抑制作用。与亲代细胞相比，这些外泌体在抑制IL-17A和促进IL-10、降低关节炎的发病率和骨侵蚀方面具有相同或更强的效果，通过抑制IL-17RA-Act1-TRAF6-NF-κB信号通路。 目前，没有单一的“一刀切”药物可能适合所有OA患者。改变疾病的OA药物(DMOADs)可能成为下一代OA治疗。MSC衍生的外泌体治疗OA与DMOADs相吻合非常有价值和相关：两者都能靶向炎症细胞因子、基质降解酶和Wnt通路。因此，DMOADs开发中的新兴方法，如基于miRNA的模式和靶向细胞衰老，也可能被用来完善基于MSC的外泌体治疗OA。 3.3.脊髓损伤 创伤性脊髓损伤(SCI)是一个毁灭性的全球健康问题，对患者和社会都造成了重大的功能和经济负担。SCI的病理生理学包括由机械创伤引起的原发性损伤和以凋亡、水肿、缺血、炎症细胞浸润和兴奋毒性为特征的继发性损伤级联。尽管进行了外科干预，涉及药物治疗的临床研究可以被广泛分类为神经保护性或神经再生性。针对上述机制链的每个事件，MSC和NSC衍生的外泌体治疗都能对脊髓保护和再生产生有益影响。 一些研究小组已经针对神经细胞死亡。Ma等人。揭示了胰岛素样生长因子1(IGF-1)刺激的NSC衍生的外泌体可以通过miR-219a-2-3p/YY1途径抑制神经细胞凋亡，同时促进SCI后的功能恢复。另外，Zhang等人。发现蛛网膜下腔注射NSC衍生的外泌体可以通过激活自噬来抑制神经细胞凋亡，通过miR-374-5p/STK-4轴增强SCI后的功能恢复。Shao等人。使用MSC衍生的外泌体探索了其他形式的细胞死亡（例如，铁死亡），发现外泌体lncGm36569可以通过miR-5627-5p/FSP1轴抑制神经细胞铁死亡，从而减少神经功能障碍。 一些研究小组已经针对抗炎和免疫调节。Nakazaki等人。发现分数静脉注射MSC衍生的外泌体可以靶向M2型巨噬细胞并上调TGF-β，从而稳定微血管并改善功能恢复。类似地，Liu等人。证明除了缺氧增加骨髓MSCs中外泌体的产生外，预处理的外泌体miR-216a-5p也可以通过TLR4/NF-κB/PI3K/Akt途径调节小胶质细胞M1/M2极化，修复创伤性SCI。Huang等人。有价值地证明了硬膜外脂肪MSC衍生的外泌体可以减轻NLRP3炎症体并改善SCI后的功能恢复。与MSC衍生的外泌体相比，内皮祖细胞(EPC)衍生的外泌体可以提供相当的抗炎效果。Yuan等人。显示EPCs的外泌体miR-222-3p可以通过SOC3/JAK2/STAT3途径促进抗炎巨噬细胞，并改善SCI后小鼠的功能修复。 一些研究小组已经针对血管生成和血-脊髓屏障(BSCB)完整性。例如，Zhong等人。使用未修饰的NSC衍生的外泌体，发现它们富含VEGF-A，因此可以增强脊髓微血管内皮细胞(SCMECs)的血管生成活性。相比之下，Chen等人。用FTY720修饰NSC衍生的外泌体，FTY720是一种免疫调节剂和微血管调节剂，通过PTEN/Akt途径保护SCMECs的屏障功能，从而改善后肢功能。众所周知，脊髓微血管内皮与周细胞之间的连接对于维持BSCB的结构完整性至关重要。因此，Zhou的团队试图验证外泌体治疗在周细胞稳态中的作用。他们证明骨髓MSC衍生的外泌体可以减少体外周细胞焦亡并增加周细胞存活率，同时改善BSCB完整性和运动功能恢复。 最后，一些研究小组在神经保护和神经再生期间针对其他方面，如神经毒性星形胶质细胞和内源性NSC的可持续性。Lai等人。证明人脐带MSC衍生的外泌体可以通过靶向神经毒性星形胶质细胞来促进脊髓功能的恢复。此外，miR-146a-5p修饰的外泌体比未修饰的外泌体具有更强的效果。Li等人。发现从神经生长因子(NGF)过表达的骨髓MSCs衍生的外泌体可以增强NSCs的神经元分化和轴突再生。Zhou等人。证明胎盘MSC衍生的外泌体可以促进增殖内源性NSCs的激活，从而改善运动活性和膀胱功能障碍，这是一个可能进一步恶化SCI患者生活质量的常见后遗症。 3.4.肌肉和肌腱撕裂 肌肉和肌腱撕裂可能是由急性创伤（例如，骨折，第3.1节）或慢性过度使用（例如，运动损伤）引起的。肌肉拉伤和肌腱撕裂的愈合遵循典型的伤口愈合过程，涉及炎症、增殖和重塑阶段。包括基于细胞和基于生长因子的治疗在内的多种非外科策略已被试验以改善愈合。以下概念验证研究表明，MSC衍生的外泌体可能成为下一代肌肉骨骼治疗。 一方面，一些研究小组专注于肌肉-肌腱-骨单元的各个组成部分。Nakamura等人。声称MSC衍生的外泌体可以改善C2C12肌细胞的体外肌生成和HUVECs中的血管生成，同时加速体内骨骼肌再生在心脏毒素诱导的肌肉损伤模型中。这些好处至少部分是通过miRNAs如miR-494介导的。Chen等人。发现脂肪MSCs的外泌体可以增强原代腱细胞的增殖和迁移，同时通过上调装饰蛋白和小胶原在兔子跟腱断裂模型中改善修复肌腱的机械强度。 另一方面，一些研究小组将肌肉-肌腱-骨单元视为一个单一的功能系统，并使用肩袖撕裂作为疾病模型，这是患者寻求治疗的最常见肩部疾病。一组研究人员发表了两项连续的研究，使用脂肪MSC衍生的外泌体。在大鼠大量肩袖撕裂模型中，外泌体治疗可以防止肌肉的萎缩、炎症和血管化。在兔子慢性肩袖撕裂模型中，外泌体治疗可以防止脂肪浸润并改善生物力学特性。另一组报告说，骨髓MSC衍生的外泌体可以增加肩袖重建后的断裂负荷和刚度，诱导肩袖端点周围的血管生成，并促进腱-骨界面的生长。 3.5.其他骨科疾病 骨质疏松症是一种代谢性骨病，其特征是骨密度低和骨结构弱化，增加了骨折的风险。它是由破骨细胞骨吸收过度补偿成骨细胞骨形成引起的。在一项细胞研究中，脂肪MSC衍生的外泌体可以拮抗缺氧/血清剥夺诱导的骨细胞凋亡和骨细胞介导的成骨细胞生成。进一步的动物研究揭示了脐带MSC衍生的外泌体可以通过miR-1263/Mob1/Hippo途径抑制骨髓MSC凋亡并预防废用性骨质疏松症，并通过miR-2110和miR-328-3p改善胫骨密度和逆转雌激素缺乏性骨质疏松症。 与脊髓损伤(SCI)相比，周围神经损伤（例如坐骨神经损伤）更为常见。随后的神经再生受到神经元和施万细胞之间相互作用的控制，并因炎症细胞浸润而变得更加复杂。研究表明，脂肪MSC衍生的外泌体可以通过增加体外神经突起生长和体内轴突再生以及步行行为来靶向神经元。脂肪MSC衍生的外泌体可以通过促进施万细胞的增殖、迁移和神经营养因子的分泌来靶向施万细胞，在体外促进神经营养因子的分泌，并在体内恢复去神经肌肉萎缩。LPS预处理的MSC衍生外泌体可以通过增强体外M2型巨噬细胞极化来靶向炎症细胞，并加速体内周围神经再生。 腰椎间盘退变(IVD)是导致下背痛的主要原因，这是导致全球残疾寿命年数最多的伤害。其分子过程包括细胞外基质(ECM)退化、炎症、氧化应激、凋亡、衰老和自噬减少。外泌体治疗的新途径试图解决这些问题。Cheng等人证明，骨髓MSC衍生的外泌体通过外泌体miR-21抑制髓核细胞(NPC)凋亡，缓解IVD退变。另一方面，Chen等人发现，人类ESC衍生的外泌体可以通过传递miR-302c抑制NLRP3炎症体，从而减轻髓核细胞的焦亡。除了细胞死亡和线粒体损伤外，NPC中的氧化应激也被MSC衍生的外泌体抑制。由于IVD退变和OA共享常见的分子疾病谱，使用MSC衍生外泌体治疗OA（第3.2节）的积极结果可以作为IVD退变研究的参考。 股骨头坏死（ONFH），也称为缺血性坏死，是一种影响年轻人群的致残性疾病，通常导致全髋关节置换。糖皮质激素(GC)诱导的骨坏死是ONFH最常见的原因之一，其发病机制表现在两个方面：股骨头的血液供应受损和成骨活性减弱。刘等人表明，iPSC衍生的MSCs的外泌体可以通过PI3K/Akt途径促进血管生成和成骨来预防GC诱导的ONFH。Zuo等人证明，过表达miR-26a的外泌体衍生自HSCs，可以提供类似的治疗效果。 4.神经外科和SC-EXO治疗 4.1.缺血性中风 中风是全球死亡第二大原因，也是导致残疾的第三大原因，其中缺血性中风是最常见的亚型。缺血性级联反应中的关键事件包括神经元功能障碍、兴奋毒性、神经化学损伤和神经炎症。在治疗方面，新一代的临床试验正在进行中，使用细胞保护药物，如免疫调节剂、IL-6受体拮抗剂、Rho激酶抑制剂和自由基清除剂。针对上述病理生理学的每个事件，几乎所有亚型的SC-exo都显示出对中风恢复的强效治疗效果（表3）。 一些研究小组已经针对神经保护和神经发生。首先，SC-exo治疗可以抑制神经细胞死亡。Luo等人发现，NSC衍生的外泌体可以抑制凋亡，同时在正常和缺氧糖剥夺（OGD）条件下促进SH-SY5Y细胞的增殖。这在大脑中动脉闭塞（MCAO）模型中也得到了测试，表现为减少的梗死面积和神经细胞凋亡，通过外泌体miR-150-3p。其他体外和体内研究表明，使用EPC衍生的外泌体具有类似的抗凋亡效应。Zhang等人发现，通过用干扰素γ（IFN-γ）预处理亲代NSCs，可以提高外泌体的抗凋亡效应。其次，SC-exo治疗可以保护中枢神经系统的细胞。Kang等人揭示，来自骨髓MSCs的外泌体可以通过抑制NLRP3炎症体介导的焦亡来挽救OGD诱导的神经细胞损伤。来自缺氧培养的外泌体比正常培养的外泌体具有更显著的神经保护效应。同样，Li等人发现，来自人类iPSC衍生的神经祖细胞的外泌体对OGD神经元和神经突起生长具有神经保护作用。在缺血条件下保护神经功能是通过PTEN/Akt途径调节的。此外，Sun等人证明，NSC衍生的外泌体也可以保护星形胶质细胞，这些细胞在中风后变成支持反应性星形胶质细胞（RAs）。第三，SC-exo治疗可以改善中风后的神经发生。Wei等人表明，来自骨髓MSCs的外泌体中的Zeb2/Axin2可以改善中风后的神经发生、神经可塑性和空间记忆以及神经功能，可能通过SOX10、Wnt/β-catenin和内皮素-3/EDNRB途径。Wang等人说明，修饰miR-126的EPC衍生的外泌体可以通过增强神经发生来缓解急性脑损伤并促进中风后的功能恢复。 一些研究小组已经针对抑制神经炎症。首先，未修饰的SC-exo治疗通过外泌体miRNAs显示出抗炎效应。Dong等人表明，骨髓MSC衍生的外泌体可以在体外诱导BV2小胶质细胞失活和M2极化，同时通过传递miR-23a-3p减少体内梗死大小并改善神经功能。类似地，Zhang等人揭示，脐带MSC衍生的外泌体miR-146a-5p可以减轻体外OGD后小胶质细胞介导的神经炎症，同时通过IRAK1/TRAF6信号通路改善体内行为缺陷和小胶质细胞激活。其次，通过修饰外泌体可以增强SC-exo治疗的抗炎效应。Yoon和同事建立了过表达肿瘤易感性基因（TSG）101的人类NSCs，从而增加外泌体分泌。工程化外泌体不仅在体外减轻了LDH释放和促炎因子，而且在体内减少了梗死体积，抑制了DNA损伤途径，并上调了神经营养因子。此外，Tian的团队通过巧妙地将RGD肽附着在NSC衍生的外泌体膜上，开辟了新的领域，该外泌体在静脉给药后靶向缺血性大脑的损伤区域，从而通过抑制MAPK途径抑制脑缺血后的炎症反应。有趣的是，Gao等人使用从小鼠成纤维细胞重编程的诱导NSCs（iNSCs）进行中风治疗。他们表明，iNSC衍生的外泌体与NSC衍生的外泌体具有相似的治疗效应，不仅可以促进神经发生，还可以抑制神经炎症。 最后，一些研究小组在中风恢复期间针对其他方面，如神经化学损伤和氧化应激。Zhu等人将脑源性神经营养因子（BDNF）装载到NSC衍生的外泌体中，构建工程化外泌体。在H2O2诱导的氧化应激模型中，外泌体治疗显著增强了NSC的存活。在大鼠MCAO模型中，外泌体治疗不仅抑制了小胶质细胞激活，还促进了内源性NSCs向神经元的分化。总的来说，基于BDNF的NSC衍生外泌体的修饰在治疗缺血性中风中提高了效果。另一方面，修饰miR-210的EPC衍生外泌体可以保护神经元免受缺氧和再氧化（H/R）诱导的凋亡、氧化应激和活力下降，从而支持缺血性中风的治疗。来自富含ACE2的EPC衍生外泌体的miR-17-5p可以改善老年小鼠的脑缺血损伤。在Xu和同事进行的一项有趣的研究中，NSC-exo和EPC-exo的组合，通过BDNF-TrkB和Nox2/ROS途径保护H/R损伤的神经元，通过miR-210和miR-123过表达对缺血性中风发挥更好的治疗效果。 与缺血性中风相比，出血性中风对大多数幸存者构成了更致命的威胁和更严重的残疾。miR-137过表达被发现可以增强EPC衍生外泌体对氧血红蛋白处理的SH-SY5Y细胞（一种体外出血性中风模型）中凋亡、铁死亡和线粒体功能障碍的神经保护效应，部分通过COX2/PGE2途径实现。 4.2.创伤性脑损伤 全球每年大约有7000万患者遭受创伤性脑损伤（TBI），这构成了严重的身体、心理社会和经济威胁。TBI可以分为原发性损伤（例如，轴突死亡、神经炎症、神经化学变化和代谢功能障碍）和继发性损伤（例如，缺血和缺氧损伤、脑水肿、颅内压增高、脑积水和感染）。每位TBI患者都有一套独特的情况，这取决于伤害的位置和严重程度等变量，使得医疗和外科治疗相当具有挑战性。因此，使用SC-exo的系统疗法可能成为管理TBI的“一刀切”选项。 一系列最初关注MSC衍生外泌体疗法功能恢复和宏观方面的动物研究发表。在大鼠TBI模型中，接受外泌体治疗的动物在空间学习和感觉运动功能方面显示出显著改善。此外，外泌体治疗显著增加了病变边界区域新生内皮细胞的数量，以及齿状回中的新生未成熟和成熟神经元。在另一个具有类似发现的大鼠TBI模型中，从3D系统中培养的MSC衍生的外泌体比传统2D条件下的外泌体提供了更好的结果。在对主要运动皮层进行TBI的猴子模型中，接受外泌体治疗的动物在恢复的前3-5周内恢复到术前的抓握模式和获取食物奖励的潜伏期。在一个更复杂且临床上更现实的大动物模型中，研究了TBI和出血性休克，外泌体疗法减轻了神经损伤的严重程度并加快了神经恢复。 相比之下，近年来完成的研究为SC-exo疗法对TBI的分子机制提供了新的见解。Chen等人报告称，脂肪MSC衍生的外泌体可以通过特别被微胶质细胞摄取并抑制它们的激活来促进功能恢复、抑制神经炎症、减少神经元凋亡和增加神经发生，通过抑制NF-κB & MAPK途径实现。Wen等人表明，骨髓MSC衍生的外泌体可以减少TBI小鼠模型的皮层组织中细胞凋亡，抑制神经炎症，并促进微胶质细胞向抗炎表型的转变。这是通过miR-181b对IL-10/STAT3途径的作用实现的。Abedi等人证明，NSC衍生的外泌体可以改善神经行为表现，抑制星形胶质细胞神经炎症，增强神经发生，同时保持NSC干性。一个有价值的额外发现是，与亲本NSC相比，外泌体在感觉运动功能恢复方面似乎更优越。最后，剂量反应和治疗窗口表明，MSC衍生的外泌体可以改善血管生成和神经发生，以及感觉运动和认知功能，同时减少神经炎症和海马神经元细胞丢失。尽管100 µg和1天可能是最佳剂量和治疗窗口，但外泌体在至少7天伤后的治疗窗口内对TBI治疗显示出广泛的有效剂量范围。 TBI和SCI是两种最严重的CNS创伤，日益被认为是全球健康优先事项。第3.3节和4.2节中提出的新兴证据对这两个密切相关的研究子专业是相互有益的。因此，未来对TBI和SCI的SC-exo疗法的研究可以是机制基础的（例如，脑肠轴转录因子炎症体和补体系统的作用）或基于修饰的（用药物装载外泌体，例如，免疫调节剂抗氧化剂循环RNA和microRNAs）。 4.3.阿尔茨海默病 与TBI和SCI不同，阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）是最常见的神经退行性疾病（NDD）。NDD的标志包括但不限于，病理性蛋白聚集，突触和神经网络功能障碍，异常蛋白质稳态，细胞骨架异常，能量稳态改变，DNA和RNA缺陷，炎症和神经元细胞死亡。AD是全球最常见的痴呆形式，占2500万例。目前，只有两类药物被批准用于症状性AD治疗，包括胆碱酯酶抑制剂和NMDA拮抗剂。尽管有几种疗法正在积极进行临床试验，但它们都远未治愈AD。大脑-药物输送的挑战，例如，血脑屏障（BBB）和药代动力学缺点，很可能被纳米大小的外泌体解决，这些外泌体还包装有强大的生物分子。大多数SC-exo疗法涉及淀粉样β（Aβ），它位于AD病理生理学的中心。 最初的工作集中在清除病理性蛋白Aβ肽的聚集。Elia及其同事通过脑内注射MSC衍生的外泌体，在AD的临床前模型的早期阶段减少了皮质和海马中的Aβ斑块负担和营养不良的神经突起。此外，作者使用免疫印迹确认了Neprilysin的存在，Neprilysin是一种能够降解Aβ的中性内肽酶，存在于外泌体的裂解物中及其mRNA中。 一些团队专注于缓解突触功能障碍和氧化应激。Wang等人发现，MSC衍生的外泌体可以挽救突触损伤并改善APP/PS1小鼠的认知行为，同时减轻外源性Aβ诱导的诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达。与使用MSC衍生的外泌体不同，Li等人给予NSC衍生的外泌体并增强线粒体功能，激活sirtuin 1，突触活动，并挽救认知缺陷。Huber等人注意到，热休克诱导的NSC衍生的外泌体表现出更大的神经保护作用，对抗氧化应激以及Aβ诱导的神经毒性。 一些团队将研究重点放在能量稳态上。Chen等人发现，MSC衍生的外泌体可以改善AD转基因小鼠的大脑葡萄糖代谢和认知功能，分别使用18F-FDG PET/CT成像和NOR测试。 一些团队专注于小胶质细胞神经炎症。在Zavatti的细胞研究中，发现羊水MSC衍生的外泌体可以减轻神经炎症小胶质细胞表型并从Aβ中恢复神经毒性，使用LPS刺激的BV2小胶质细胞和SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞作为模型。Ding等人表明，脐带MSC衍生的外泌体可以通过调节小胶质细胞激活来减轻神经炎症和减少Aβ沉积，从而增加AD小鼠的空间学习和记忆功能。 一些团队专注于神经元细胞死亡和神经发生，希望抵消AD的进展。Reza-Zaldivar及其同事给予AD小鼠MSC衍生的外泌体，SC-exo疗法刺激了侧脑室区的神经发生并减轻了Aβ诱导的认知障碍。这些效果与MSC中显示的效果相当。 一些团队专注于血脑屏障（BBB），其功能障碍导致通透性增加、微出血、葡萄糖运输受损以及周细胞和内皮细胞退化。刘等人指出，5xFAD（家族性阿尔茨海默病）小鼠在4个月大时BBB破裂，更重要的是，用NSC衍生的外泌体治疗逆转了AD引起的BBB缺陷。 最后，一些团队专注于提高AD的SC-exo疗法的技术性。当外泌体被静脉注射时，它们可以在大脑以外的其他器官中被追踪，而不是目标区域。崔等人将MSC衍生的外泌体与CNS特异性狂犬病病毒糖蛋白（RVG）结合，以靶向转基因AD小鼠的大脑。修改后的外泌体不仅显示出增加的皮层和海马体输送，而且还显著改善了学习能力和记忆能力，同时减少了Aβ沉积。另一方面，高等人通过体细胞重编程获得了iNSC，为治疗性外泌体的来源开辟了新窗口。他们证明，与NSC衍生的外泌体具有相似治疗效果的iNSC衍生外泌体，可以减轻各种AD表型，例如，认知功能、Aβ沉积、神经炎症和神经再生，在临床前小鼠模型中。 4.4.帕金森病 帕金森病是老年人中第二常见的神经退行性疾病，全球影响超过600万患者。PD是由黑质多巴胺能神经元坏死和名为Lewy体的蛋白质包涵体存在引起的。分子病理生理学包括α-突触核蛋白蛋白质稳态、线粒体功能障碍、氧化应激、钙失衡和神经炎症。 在一项使用骨髓MSC衍生外泌体的研究中，黄等人发现，外泌体衍生的肿瘤坏死因子刺激基因-6（TSG-6）可以减轻1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+，神经毒素MPTP的代谢产物）诱导的神经毒性。在这个使用SH-SY5Y和SK-N-SH细胞的体外PD模型中，外泌体抗PD进展效应被发现是通过STAT3/miR-7/NEDD4轴介导的。 在一项使用NSC衍生外泌体的研究中，李等人揭示了SC-exo疗法可以帮助预防PD的神经病理学和进展。在体外对SH-SY5Y和BV2细胞工作时，NSC衍生的外泌体可以减少细胞内活性氧（ROS）和相关的凋亡途径。在体内对6-羟多巴胺诱导的PD小鼠工作时，NSC衍生的外泌体可以下调促炎因子并显著减少多巴胺能神经元丢失。确认了NSC特异性microRNAs的存在，如miR-182-5p、miR-183-5p、miR-9和let-7，并发现它们参与细胞分化、神经营养功能和免疫调节。 4.5.多发性硬化症 多发性硬化症（MS）是最常见的非创伤性、神经退行性和致残性CNS疾病，影响年轻成人。MS的病理标志是大脑和脊髓中脱髓鞘病变的形成，伴有炎症和自身免疫参与。目前批准的疾病修饰疗法包括基于干扰素的、免疫调节的、免疫抑制的和免疫重建药物。一些初步研究强调了MSC衍生外泌体对MS治疗的潜力。 在一项使用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）大鼠的动物实验中，李等人表明SC-exo疗法显著降低了神经行为评分，减少了炎症细胞渗入CNS，并减少了脱髓鞘。此外，外泌体治疗通过调节小胶质细胞的极化，上调M2相关细胞因子，同时下调M1相关细胞因子。 在一项使用两种脱髓鞘小鼠模型（EAE模型和铜饮食模型）的动物研究中，张等人发现SC-exo疗法可以通过直接作用于少突胶质细胞（OL）前体和间接作用于小胶质细胞来促进再髓鞘化。MSC衍生的外泌体可以改善神经系统结果，增加新生成和成熟的OL数量，减少Aβ前体蛋白密度，通过从M1转变为M2表型减少神经炎症，并抑制TLR2/IRAK1/NF-κB途径。 4.6.其他神经外科和相关疾病 上述已经详细讨论了MSC和NSC衍生外泌体疗法在四种主要类型的神经外科或神经系统疾病中的外科潜力。除了血管破裂、创伤、神经退行性和自身免疫相关疾病外，最近证明其他疾病也适合SC-exo疗法（表3）。这些包括但不限于：1，痴呆症，如血管性痴呆。HIV相关的神经认知障碍和辐射诱导的认知功能障碍；2，功能障碍，如癫痫和机械性痛觉过敏；3，先天性异常，如开放性脊柱裂；4，神经心理状况，如抑郁和压力；5，大脑衰老；6，医源性大脑问题，如深度低温循环停止。 5.整形外科和SC-EXO疗法 人体所有部位都发生伤口愈合，其中皮肤伤口最为常见。伤口相关费用最高的是外科伤口，其次是糖尿病溃疡。伤口愈合的总体但重叠阶段包括止血、炎症、血管生成、增殖和重塑，每个阶段由不同的细胞类型控制，并由各种信号通路调节。超过一半的相关使用SC-exo疗法促进皮肤伤口愈合的工作是基于MSC的（表4）。 在炎症阶段，外泌体能够抑制外周血单个核细胞的增殖，并在体外促进调节性T细胞的转化，减少皮肤中淋巴细胞的浸润。此外，外泌体能够减少IgE、嗜酸性粒细胞和肥大细胞的数量，并下调炎症细胞因子。在血管生成阶段，受过教育的外泌体（例如，阿托伐他汀和去铁酮）能够通过Akt/eNOS和PTEN/PI3K/Akt途径促进糖尿病伤口的血管生成。内皮祖细胞衍生的外泌体能够通过Erk1/2途径和p53途径加速皮肤伤口愈合。在增殖阶段，干细胞衍生的外泌体能够促进成纤维细胞和角质形成细胞的增殖和迁移。一些是通过PI3K/Akt、Akt/HIF-1α、ERK1/2和Wnt/β-catenin途径实现的，而另一些则是通过抑制LATS2、PPARγ和AIF核转位实现的。在伤口愈合的最后重塑阶段，肉芽组织被永久性瘢痕所取代，异常的伤口愈合可能会发生（例如，瘢痕疙瘩和肥厚性瘢痕）。间充质干细胞衍生的外泌体能够通过TGF-β/Smad2途径抑制成纤维细胞-肌成纤维细胞的转化，并在早期增加胶原蛋白合成，在晚期减少，从而减少瘢痕形成。此外，胚胎干细胞衍生的外泌体被发现对伤口愈合具有与间充质干细胞衍生的外泌体相似的治疗作用。陈等人使用人类胚胎干细胞衍生的外泌体帮助治疗压力性溃疡。他们注意到外泌体能够通过激活Nrf2改善内皮细胞衰老，并恢复与衰老相关的血管生成功能障碍，从而加速伤口愈合。此外，Bae等人揭示了来自胚胎干细胞的外泌体mmu-miR-291a-3p能够通过TGF-β受体2途径抑制人皮肤成纤维细胞的细胞衰老，从而加速切除性皮肤伤口愈合过程。除了伤口愈合，其他与整形外科相关的疾病已被证明适合SC-exo治疗（表4）。这些包括但不限于：1，皮肤移植，如皮瓣；2，组织丢失，如颅面缺陷；3，自身免疫性皮肤病，如硬皮病；4，皮肤感染，如利什曼病；5，毛发移植，如治疗脱发；6，皮肤老化。 6.普通外科和SC-exo治疗 作为普通外科的一个主要亚专业，肝胆外科对SC-exo治疗引起了极大的关注。首先，急性肝损伤（ALI）/急性肝衰竭（ALF）是一种罕见但具有挑战性的综合征，表现为肝功能障碍、凝血病、脑病和多器官衰竭。大约60%的ALF病例需要并接受原位肝移植或导致死亡。在一项研究中，林的团队关注了ALI的细胞死亡方面，并发现间充质干细胞衍生的外泌体能够通过稳定SLC7A11对抗四氯化碳诱导的ALI中的铁死亡。或者，邵的团队关注了外泌体的预分离修饰，并揭示了来自脐带间充质干细胞的外泌体能够通过外泌体miR-455-3p改善IL-6诱导的ALI。其次，与ALI相比，肝纤维化发生在肝脏持续慢性损伤时，可能会发展成肝硬化、肝衰竭、肝细胞癌甚至死亡。马等人发现间充质干细胞起源的外泌体circDIDO1能够通过miR-141-3p/PTEN/Akt途径在人肝纤维化中抑制肝星状细胞的激活。此外，王等人发现来自3D人类胚胎干细胞球体的外泌体能够通过外泌体miR-6766-3p的失活Smad途径减轻肝星状细胞的激活并抑制肝纤维化。对于那些需要肝移植的晚期肝纤维化患者，肝脏缺血再灌注损伤（IRI）是移植物功能障碍和器官排斥的严重并发症。杨等人证明骨髓间充质干细胞衍生的外泌体能够缓解肝IRI，减少肝细胞凋亡，并降低肝脏酶水平，通过增强自噬。杜等人表明，来自iPSC衍生的间充质干细胞的外泌体能够通过激活鞘氨醇激酶和鞘氨醇-1-磷酸途径保护肝脏免受肝IRI。第三，非酒精性脂肪肝病（NAFLD）被知道对中风恢复产生不利影响。使用2型糖尿病小鼠模型，Venkat等人证明HSC衍生的外泌体能够同时减少肝功能障碍并改善神经和认知功能。最后，急性胰腺炎是一种不可预测且可能致命的疾病，其预后主要取决于是否发展成多器官功能障碍综合征。陈等人揭示了来自iPSC衍生的间充质干细胞的外泌体能够通过Akt/Nrf2/HO-1途径改善严重急性胰腺炎引起的心肌损伤。外周动脉疾病影响全球2亿患者，在最严重的阶段，可能导致严重肢体缺血，使患者面临增加的心血管事件、截肢和死亡风险。作为一种无细胞治疗，胎盘间充质干细胞衍生的外泌体输注能够在小鼠耳缺血损伤模型中增强血管生成，使用激光多普勒血流分析。从机制上讲，间充质干细胞衍生的外泌体不仅促进体外管状结构的形成，而且动员内皮细胞进入皮下Matrigel栓塞体内，主要通过外泌体促血管生成的微小RNA，如miR-30b。此外，HSC衍生的外泌体能够通过改善肢体灌注、毛细血管密度、运动功能及其截肢来修复小鼠的缺血后肢。这很可能是由于内皮细胞相对于平滑肌细胞和成纤维细胞的外泌体miR-126-3p的内化。人类iPSC衍生的外泌体通过外泌体miR-199b-5p展示了类似的新生血管生成效应。另一方面，腔内再通越来越多地被用来重建血流到缺血区域，并恢复外周动脉疾病患者的组织丢失或坏疽。三个独立的团队都证明了EPC衍生的外泌体能够通过增强内皮细胞功能促进血管修复并加速大鼠球囊诱导的血管损伤模型中的再内皮化。此外，Kong等人通过抑制新内膜增生展示了EPC衍生的外泌体对球囊损伤的类似保护效果。这是通过促进再内皮化和抑制再狭窄而不是通过直接抑制平滑肌细胞的增殖和迁移来实现的。 McCulloh及其同事发表了一项关于坏死性小肠结肠炎（NEC）的SC-exo治疗的有趣研究，该研究对需要手术的早产儿的总体死亡率超过30%。作者比较了四种不同类型的干细胞衍生的外泌体的治疗效应，即羊水间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、羊水神经干细胞和新生儿肠神经干细胞。当以至少4×10^8的浓度注射时，所有类型的SC-exo都被证明能够像它们的亲本干细胞一样有效地减少实验性NEC的发生率和严重程度。 败血症是普通外科中致命且可能可以预防的并发症，其中微血管功能障碍导致多器官衰竭和死亡。使用通过盲肠结扎和穿刺（CLP）的小鼠败血症模型，周等人证明EPC衍生的外泌体能够改善败血症结果。这表现为减少肺和肾脏血管渗漏，改善器官功能，并增加通过外泌体miR-126-5p和miR-126-3p的生存率。同样，刘等人通过外泌体miR-382-3p通过IκBα/NF-κB途径展示了EPC衍生的外泌体对败血症诱导的器官损伤和免疫抑制的保护作用。 7.心脏外科和SC-EXO治疗 全球主要死因是缺血性心脏病（IHD），主要由阻塞性冠状动脉粥样硬化引起。动脉粥样硬化斑块的破裂是急性动脉血栓形成导致心肌梗死（MI）最常见的触发因素。心肌长期缺氧可导致心肌细胞死亡。尽管及时的再灌注至关重要，但可能发生心肌IRI，从而减轻再灌注的有益效果。尽管现代冠状动脉再灌注，与急性MI导致的心力衰竭发展相关的死亡率和发病率仍然很高，这突出了下一代心脏保护治疗的重要性，如SC-exo。 邢等人进行的工作关注动脉粥样硬化。脂肪来源的间充质干细胞衍生的外泌体miR-342-5p被证明可以通过靶向H2O2挑战的HUVEC模型中的PPP1R12B来保护内皮细胞免受动脉粥样硬化的影响。彭等人和高等人进行的工作关注MI。来自间充质干细胞的外泌体miR-25-3p能够通过靶向促凋亡蛋白和EZH2来缓解MI，在OGD心肌细胞模型和左前降支结扎动物模型中。类似地，人类iPSC衍生的外泌体可以在不增加心律失常并发症的频率的情况下改善MI的恢复，在猪模型中。温等人和桑索等人进行的工作关注心肌细胞的死亡。间充质干细胞衍生的外泌体可以通过miR-144靶向PTEN/Akt途径在缺氧条件下改善心肌细胞凋亡，而iPSC衍生的外泌体可以调节缺氧心肌细胞中的自噬。卡苏尔等人和陈等人关注心肌IRI。前者发现来自非心肌细胞相关细胞的外泌体，即CTX0E03 NSCs，可以通过JAK/STAT途径减少梗死面积，同时延迟心肌细胞线粒体通透性转换孔的开启。后者发现间充质干细胞衍生的外泌体miR-143-3p可以通过CHK2-Beclin2途径调节自噬来抑制心肌IRI。最后，陈等人证明骨髓间充质干细胞衍生的外泌体可以减轻压力过载诱导的重构中的心肌肥大和纤维化，从而为心力衰竭提供了有希望的潜在治疗。 与间充质干细胞衍生的外泌体相比，来自胚胎干细胞的外泌体对心脏状况显示出相似的治疗效果。在保护心肌细胞方面，Khan等人发现胚胎干细胞衍生的外泌体miR-294可以改善心肌细胞存活，促进新生血管形成并抑制MI后的纤维化，从而增强MI后心脏功能。此外，Tavakoli Dargagni等人证明胚胎干细胞衍生的外泌体可以通过抑制TLR4-NLRP3介导的焦亡细胞死亡来减轻阿霉素诱导的心脏毒性。类似地，Singla团队表明胚胎干细胞衍生的外泌体可以通过增强抗炎M2型巨噬细胞和减少炎症诱导的焦亡来改善心脏重构。在管理心力衰竭方面，Pang等人展示胚胎干细胞衍生的外泌体可以通过FGF2信号在主动脉缩窄诱导的心力衰竭模型中减轻心力衰竭，改善心脏功能，并促进心肌血管生成。使用冠状动脉闭塞诱导的心力衰竭模型，Kervadec等人表明胚胎干细胞衍生的心血管前体分泌的外泌体可以恢复心脏功能，如减少左心室收缩末期和舒张末期容积。最后，同一研究小组后来证明，来自更易获得的细胞来源的外泌体，例如iPSCs，能够提供与胚胎干细胞衍生的外泌体相似的心脏保护效果。 其他重要的SC-Exo亚型，如iPSC-exo、HSC-exo和EPC-exo，也显示出心脏保护效果。例如，iPSC分泌的外泌体可以发挥细胞保护作用，维持细胞内Ca2+稳态并促进心肌细胞存活，从而改善MI的恢复。HSC-exo可以减少心脏损伤相关指标和心脏纤维化程度，同时提高心力衰竭动物模型的射血分数。此外，HSC衍生的外泌体的全身输注可以改善急性MI大鼠模型中的缺血性心肌病，同时在治疗副作用如肾脏损伤方面也有额外的好处。使用声波刺猬蛋白（Shh），一种血管生成因子，通过将外泌体Shh传递到缺血心肌，可以保持急性MI后的心脏功能。Ke等人证明EPC衍生的外泌体可以通过激活间充质-内皮转化和降低HMGB1的表达来增强心脏成纤维细胞的增殖和血管生成，后来发现EPC衍生的外泌体中的外泌体miR-218-5p和miR-363-3p可以通过靶向p53/JMY途径改善MI。在Yue等人的一项有趣的研究中，发现IL-10缺乏引起的全身炎症会通过在受体细胞中外泌体富集整合素相关激酶（ILK）和ILK介导的NF-κB途径的激活来损害EPC衍生的外泌体对心肌修复的修复特性。 在治疗胸部疾病方面，刘等人证明人类胚胎干细胞衍生的外泌体可以减轻炎症，防止过量胶原沉积，并保持博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺部的肺泡结构。这是通过外泌体mi-17-5p靶向血栓蛋白-2实现的。同样，周等人证明iPSC衍生的外泌体中的外泌体miR-302a-3p可以通过TET1抑制M2型巨噬细胞，从而减轻肺纤维化。刘等人表明EPC衍生的外泌体可以通过调节Mitofusion-2和Ras-Raf-ERK1/2途径抑制肺动脉平滑肌细胞增殖及其对凋亡的抵抗力，从而作为治疗肺动脉高压的潜在治疗候选药物。两个独立团队都揭示了人类EPC衍生的外泌体可以通过将miR-126传递到受损肺泡来改善LPS诱导的急性肺损伤的结果。张等人发现EPC衍生的外泌体可以改善肺微血管内皮细胞的生物活性，并保护它们免受过氧化损伤，在发育中的肺血管中，从而有助于治疗支气管肺发育不良。此外，Montay-Gruel等人证明人类胚胎干细胞衍生的外泌体可以改善与暴露于肺部电离辐射相关的晚期正常组织并发症，如在肺癌术后治疗中遇到的。 8.泌尿科和SC-EXO治疗 慢性肾脏病（CKD）是一种以肾脏结构、功能或两者持续变化为特征的综合征，影响全球10-14%的人口。CKD最常见的病理特征和最终表现是某种形式的肾纤维化。当伤口愈合失调时会发生肾纤维化，导致过多的细胞外基质蛋白，如胶原和纤维连接蛋白的积累。在他们的研究中，刘等人发现骨髓间充质干细胞衍生的外泌体可以通过靶向NFAT5的外泌体miR381-3p来减轻血管钙化，这是CKD中发病率和死亡率的一个不利指标。这在透析患者的严重动脉钙化中得到了进一步验证。在替代研究中，几个小组证明了骨髓间充质干细胞衍生的外泌体在治疗肾纤维化方面的能力，每个都有不同的作用机制解释。在细胞研究中，尹等人发现外泌体可以通过运输Nedd4L来防止TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的上皮-间充质转化，Nedd4L激活自噬。在5/6亚全肾切除大鼠模型中，刘等人揭示外泌体可以通过调节Smurf2/Smad7轴来改善肾功能并减少纤维化大小。在单侧输尿管梗阻诱导的间质纤维化小鼠模型中，陆等人证明外泌体可以通过激活EP2受体减少M1和M2型巨噬细胞的极化来改善肾纤维化。 急性肾损伤（AKI）和CKD紧密相连，每个都是发展为另一个的风险因素。肾脏IRI是AKI和急性肾衰竭的主要原因。Lim等人证明来自iPSC衍生的间充质干细胞的外泌体可以通过激活ERK1/2信号通路纠正AKI小鼠的血清肌酐水平、小管坏死、凋亡、炎症细胞因子产生和氧化应激。在张等人的类似工作中，发现EPCs的外泌体miR-21-5p可以通过抑制CLP大鼠中RUNX1的表达来减轻败血症诱导的AKI。 9.耳鼻喉头颈外科和SC-EXO治疗 听力损失是全球最常见的感觉缺陷，影响着近20%的全球人口。感音神经性听力损失（SNHL）的原因非常多样，如老年性耳聋、耳毒性药物诱导、噪声诱导和特发性突发性SNHL。Tsai团队证明，脐带间充质干细胞（MSC）衍生的外泌体能够挽救顺铂诱导的听力损失中外毛细胞的丢失，并修复耳蜗损伤。耳蜗保护效应的潜在机制是通过miRNAs（例如miR-125a-5p和miR-125b-5p）和重塑因子（例如纤维连接蛋白和半乳糖结合蛋白-3）介导的。耳蜗缺血再灌注损伤（IRI）是特发性突发性和噪声诱导性SNHL的主要原因之一，可能导致感觉毛细胞和双极耳蜗螺旋神经节不可逆损伤。其病理生理学包括氧化应激、细胞过度死亡和炎症调节失调。Hao等人发现，过表达miR-21的神经干细胞（NSC）衍生的外泌体可以通过抑制小鼠耳蜗中的炎症过程来预防IRI引起的听力损失。这通过降低听觉脑干反应阈值、上调IL-10和下调TNF-α和IL-1β得到证实。甲状腺功能减退症是一种非常常见的疾病，可能由于甲状腺切除术或放射性消融治疗甲状腺功能亢进或甲状腺癌而发生。干细胞治疗和干细胞衍生的外泌体治疗已成为通过甲状腺再生治疗甲状腺功能减退症的有希望的管理方法。Degoserie等人使用体外甲状腺叶培养系统表明，EPC衍生的外泌体可以促进甲状腺细胞组织成甲状腺滤泡和腔扩张（即滤泡形成），这由层粘连蛋白-α1促进。颞下颌关节（TMJ）紊乱是影响31%成人和11%儿童的第二常见肌肉骨骼疾病。与其他滑膜关节一样，TMJ也容易受到骨关节炎（OA）的影响，共享常见的病理生理过程（第3.2节）。Zhang及其同事证明，MSC衍生的外泌体可以通过减轻免疫能力兔模型中的炎症和恢复基质稳态来缓解TMJ OA。外泌体介导的关节修复归因于腺苷激活Akt、ERK和AMPK信号传导，以及增强s-GAG合成。 10.眼科学和SC-EXO治疗 获得性视神经病变是成人失明的主要原因之一，有多种病因，如血管性、炎症性、创伤性、毒性、压迫性和营养性病因。视网膜神经节细胞（RGC）丢失是视神经病变的标志，通过多种细胞死亡途径发生。Mead和Tomarev发现，骨髓MSC衍生的外泌体可以在大鼠视神经压碎模型中促进RGC的生存和轴突再生。外泌体的神经保护和神经营养效应是通过外泌体miRNAs实现的，展示了无细胞潜力用于创伤性和退行性眼病。视网膜退行性疾病（例如，年龄相关性黄斑变性和视网膜色素变性）是全球导致双侧不可逆视力丧失的主要原因。其特征是光感受器、RGC或视网膜色素上皮（RPE）细胞的逐渐退化。Bian团队发现，NSC衍生的外泌体可以在RCS视网膜退化大鼠模型中保护光感受器、视觉功能和防止外核层变薄。这是通过外泌体靶向TNF-α、IL-1β和COX-2显著灭活小胶质细胞炎症实现的。在两项连续研究中，Gao团队表明，ESC衍生的外泌体可以通过增强视网膜Müller细胞的增殖和逆转分化来缓解视网膜退化，作为替代视网膜神经元前体。一方面，这是通过调节Müller细胞中外泌体HSP90的Oct4表达实现的。另一方面，通过向Müller细胞传递BDNF蛋白激活Wnt信号通路也发挥了重要作用。此外，使用遗传性视网膜退化大鼠模型，Park等人证明，无论是视网膜下还是玻璃体内注射人类HSC衍生的外泌体都可以提供退化视网膜的功能挽救。角膜缺陷愈合失败常常导致角膜盲，据报道是仅次于白内障的导致失明的主要原因。最严重和难以治疗的病例需要角膜移植。Wang等人比较了iPSC和MSC衍生的外泌体作为角膜上皮缺陷治疗的治疗提供者。发现这两种类型的外泌体都可以促进体外增殖、细胞周期进展和迁移，同时抑制凋亡，并加速体内角膜上皮缺陷愈合。更重要的是，iPSC衍生的外泌体比MSC衍生的外泌体具有更强的治疗效果。角膜移植是固体器官移植最成功的形式之一。然而，高达90%的高风险受者可能会发生移植物排斥。先天和适应性免疫是移植物失败的主要原因。免疫抑制药物仅显示出部分效果。Jia等人表明，MSC衍生的外泌体可以跨越生物屏障，并在角膜同种异体移植排斥的大鼠模型中延长移植物存活时间。这可能是通过抑制CD4+和CD25+ T细胞的浸润以及通过Th1信号通路减少IFN-γ和CXCL11实现的。 11.妇产科和SC-EXO治疗 原发性卵巢功能不全（POI）或早发性卵巢衰竭（POF）定义为40岁之前卵巢功能丧失。POI的非遗传因素包括自身免疫性疾病、代谢状况、感染和医源性程序（例如，化疗、放疗和手术）。POI女性遭受各种并发症，如骨质疏松症、不孕、心血管疾病和抑郁。尽管及时启动激素替代疗法对于控制这些症状和并发症至关重要，但它无法恢复卵巢功能。目前正在测试的实验性治疗方法包括线粒体激活、体外激活、干细胞治疗和外泌体治疗。Li等人进行的工作表明，脐带MSC衍生的外泌体可以在环磷酰胺（CTX）诱导的POI小鼠模型中改善卵巢功能。SC-exo治疗不仅恢复了与卵巢功能相关的激素水平和卵巢滤泡数量，还改善了POI小鼠的生殖能力。此外，外泌体通过调节Hippo途径促进卵巢颗粒细胞（GCs）的增殖，这种效应被YAP抑制剂中和。使用iPSC衍生的MSCs的外泌体也获得了类似的结果。Ding等人进行的工作表明，脐带MSC衍生的外泌体可以在POI小鼠模型中恢复卵巢表型和功能，促进CTX损伤的人类GCs和卵母细胞的增殖，并通过传递外泌体miR-17-5p和靶向其下游mRNA SIRT7来减轻ROS积累。进一步阐明miR-17-5p通过抑制SIRT7下调PARP1、γH2AX和XRCC6的表达。最后，Yang等人完成的工作揭示，骨髓MSC衍生的外泌体可以在化疗诱导的POF大鼠模型中恢复发情周期，增加基底和窦卵泡的数量，增加雌二醇E2和抗苗勒管激素水平，并降低卵泡刺激激素和黄体生成激素水平。从机制上讲，这是通过靶向PTEN的外泌体miR-114-5p实现的。 12.从外泌体治疗的临床前研究到临床试验 如第3至11节所讨论的许多临床前研究已证实，MSC衍生和NSC衍生的外泌体治疗许多疾病的优势，涵盖外科实践的亚专业。不仅限于干细胞衍生的外泌体，许多临床试验已证明外泌体的作用是双重的：生物标志物和治疗剂。在ClinicalTrials.gov上使用“外泌体治疗”、“外泌体治疗”和“外泌体”作为关键词进行搜索，产生了188条记录。然而，其中只有60（32%）直接涉及使用外泌体作为治疗剂的干预性研究（表5）。其余的，特别是与肿瘤学相关的试验，大多使用外泌体作为生物标志物，例如疾病发病机制中的关键角色（例如NCT04288141，NCT04154332），诊断标志物和治疗前的指导（例如NCT04629079，NCT03791073，NCT05451342，NCT03432806），监测指数和治疗效果的预测工具（例如NCT05427227，NCT04499794，NCT04852653，NCT05370105，NCT03800121，NCT05370105，NCT05328089），以及治疗后的预后指标（例如NCT06026735，NCT05705583，NCT05411445，NCT04167722，NCT05575622）。外泌体作为生物标志物的临床应用已在其他综述中广泛探讨328-332，因此不在本综述中讨论。就60项外泌体治疗临床试验的临床特征而言（表5），有几个亮点值得一提。 首先，所涵盖的疾病范围非常广泛，包括外科和内科疾病。这些包括第3至11节中讨论的许多外科疾病，如骨科疾病（NCT05060107中的膝关节骨关节炎、NCT04998058中的骨丢失和NCT04849429中的椎间盘退变）、神经外科疾病（NCT03384433中的缺血性中风和NCT04388982中的阿尔茨海默病）、整形外科疾病（NCT02565264和NCT05475418中的皮肤伤口愈合）、普通外科疾病（NCT05871463中的肝硬化）、心胸外科疾病（NCT05669144中的心肌梗死）和眼科疾病（NCT05413148中的视网膜色素变性）。换句话说，一些临床前研究尚未发展成为临床试验。这些包括但不限于，针对骨折、脊髓损伤、创伤性脑损伤、急性肝损伤和听力损失的外泌体治疗，这些可能成为未来外泌体治疗相关临床试验的方向。 其次，越来越多的临床试验关注两种医疗状况，即COVID-19（16项试验，占27%）和癌症（5项试验，占8%）。MSC衍生的外泌体可以通过修复作用和再生效应管理COVID-19中的病毒感染和肺损伤。前者表现为阻断病毒进入和复制，抑制细胞因子风暴，后者表现为预防炎症、液体清除和恢复肺通透性。此外，外泌体可以被设计成药物（例如，CD24，一种强大的免疫调节剂）传递平台，甚至疫苗来对抗COVID-19。与用于COVID-19管理的MSC衍生外泌体相比，用于癌症治疗的外泌体主要依赖非干细胞和货物工程。部分原因是MSC衍生的外泌体对肿瘤发生和转移表现出有争议的效应。尽管MSC衍生的外泌体与肿瘤细胞之间的确切相互作用仍有待讨论，但科学家们通过修改外泌体货物来传递抗癌核酸和抗癌药物，以及外泌体膜用于特定肿瘤靶向，克服了几个障碍。 最后，在用于疾病治疗的40项临床试验中，有38项（95%）使用MSC，2项（5%）使用iPSC作为外泌体的细胞来源。然而，这与第3至11节中讨论的临床前研究显著不同。NSC衍生外泌体在临床试验中使用不足，可能部分是因为其母细胞的供应限制。目前，NSC可以从三个来源获得：1、从初级CNS组织（例如成人和胎儿大脑）中分离；2、从多能干细胞（例如iPSC和ESC）分化而来；3、从体细胞（例如成纤维细胞和血细胞）重编程为iNSC。最近的研究开发了成纤维细胞衍生的iNSC，为从NSC样细胞中获得外泌体开辟了新窗口。这些iNSC-exo不仅在体外促进细胞生存和增殖不亚于NSC-exo，而且在缺血性中风后恢复和减轻AD样表型方面也有所增强。因此，iNSC可能是产生临床级外泌体的优秀细胞来源，用于临床试验。 总之，从临床前研究到外泌体治疗的临床试验的进展已经加快。然而，外泌体治疗的临床指示不足和亲本干细胞来源有限等问题仍有待解决。此外，一旦克服了在放大制造、遵守良好生产规范和监管框架方面的限制，干细胞衍生的外泌体治疗将很快被纳入临床实践，并服务于患者床边。 13.结论和未来展望 外泌体最近被追求作为一种无细胞的干细胞治疗替代品。ESC、iPSC、HSC、MSC、NSC和EPC衍生的外泌体特别引人注目，部分原因是其亲本细胞的多能性或多向分化能力。在经过有或没有修改的生产和纯化后，干细胞衍生的外泌体在治疗外科实践中遇到的许多疾病方面展现出巨大的潜力。这些疾病包括骨科疾病（例如骨折、骨关节炎和脊髓损伤）；神经外科（例如缺血性中风、创伤性脑损伤和阿尔茨海默病）；整形外科（例如伤口愈合）；普通外科（例如急性肝损伤）；心胸外科（例如心肌梗死）；泌尿外科（例如慢性肾病）；头颈外科（例如感音神经性听力损失）；眼科（例如获得性视神经病变）和妇科（例如原发性卵巢功能不全）。从机制上讲，干细胞衍生的外泌体通过疾病特异性的细胞和组织反应（例如组织再生、抗炎、抗细胞死亡、免疫调节和抗氧化应激）以及组织特异性的分子信号通路（例如Wnt/β-catenin、PTEN/PI3K/Akt/HIF-1α、MAPK和JAK/STAT通路）实现多种治疗效果。总的来说，干细胞衍生的外泌体治疗已被证明是外科领域干细胞治疗的强大且多功能的替代品。 干细胞衍生的外泌体的临床应用的未来重点应该放在这种治疗管道的各个节点上。首先，针对外泌体治疗前的大规模生产，需要一个高通量细胞来源以及一个可重复和可扩展的生产和分离协议。与静态系统培养单层细胞相比，生物反应器形式的动态系统，例如中空纤维生物反应器和搅拌罐生物反应器，可以通过在短期内产生大量细胞和外泌体来提高效率。然而，由于在反应器中遇到的物理和剪切应力，亲本细胞和衍生外泌体的表型可能会发生变化。因此，必须优化生物反应器的工作参数，以促进干细胞衍生外泌体的大规模生产。其次，针对外泌体的治疗方式，需要探索除全身给药之外的传递方法。当通过静脉系统传递时，外泌体会迅速从血液循环中清除，并在肝脏、脾脏和肺部积累，这可以通过局部给药来克服。最近，各种生物材料被用来保护、协助和增强局部传递的外泌体，以最大化它们的治疗效果。这些生物材料可以根据它们的来源（例如天然、合成和混合聚合物）、格式（例如支架、补片、喷雾和微针）和响应性（例如温度、pH和蛋白质）来设计，从而允许疾病特异性定制。最后，针对外泌体治疗的治疗指示，应该在未来的临床前研究和临床试验中包括比本综述中讨论的更多的疾病。例如，考虑到MSC衍生外泌体的免疫调节效应，气道炎症状况（例如过敏性鼻炎和哮喘）可能是外泌体治疗的合适候选者。最适合使用外科植入物治疗的疾病（例如人工耳蜗植入物、人工晶状体和避孕宫内节育器）可以以植入物为基础的局部释放外泌体的形式进行管理。除了主要疾病外，次要疾病，包括外科手术和全身麻醉相关的并发症（例如认知障碍、伤口麻木和恶性高热）可能成为外泌体治疗的治疗目标。总的来说，扩大外泌体生产的努力与多模式外泌体传递相结合，将加速干细胞衍生外泌体在迅速扩大的疾病谱中的临床应用。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要:免疫细胞治疗作为一种革命性的治疗方式，显著改变了癌症护理。这是一种专业的免疫疗法，利用活的免疫细胞作为治疗癌症的疗法。与传统药物不同，细胞疗法被认为是“活药”，这些产品目前是定制的，需要先进的制造技术。尽管嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法在治疗血液恶性肿瘤方面受到了行业的极大关注，但其在治疗实体瘤方面的有效性常常受限，导致替代性免疫细胞疗法的出现。肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）细胞疗法、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）细胞疗法、树突状细胞（DC）疫苗和DC/CIK细胞疗法旨在利用身体的自然防御机制来定位和消除癌细胞，通常具有较少的副作用或风险。另一方面，如嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞、T细胞受体（TCR）-T、嵌合抗原受体-自然杀伤细胞（CAR-NK）或CAR-巨噬细胞（CAR-M）等细胞疗法通常使用自体干细胞、同种异体或异种细胞，或基因修饰细胞，需要更高水平的操作，被认为是高风险的。这些高风险细胞疗法通常在肿瘤靶向和信号传导方面具有特殊特性，触发新的抗肿瘤免疫反应。最近，在抗肿瘤机制和细胞疗法产品设计的基本和临床研究以及技术创新方面取得了显著进展。随着技术的迅速整合和高创新格局，关键的未来发展方向已经出现。为了满足细胞疗法技术进步治疗癌症的需求，我们在本研究中全面系统地调查了免疫细胞疗法的技术创新和临床进展。基于免疫细胞疗法的治疗机制和方法学特点，我们分析了这些疗法的主要技术优势和临床转化风险。我们还分析和预测了应用前景，为相关企业提供必要的信息，以便他们做出关于研发方向选择的明智决策。 1.引言 癌症是一种利用多种逃逸机制来躲避抗癌免疫的全身性疾病，并且显著改变整个免疫系统的功能和组成。抗癌治疗的演变跨越了一百多年，其效果和特异性不断提高，旨在消除癌细胞的同时尽量减少对健康组织的损害。为了实现这一目标，免疫细胞治疗在现有方法中脱颖而出，成为了一种改变游戏规则的解决方案。2017年，食品药品监督管理局（FDA）批准了两种嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞疗法，即Kite Pharm的axicabtagene ciloleucel（Yescarta）和Novartis的tisagenlecleucel（Kymriah），用于治疗淋巴瘤。这些批准标志着抗癌治疗加速发展的一个重大里程碑。免疫细胞治疗的基本概念是通过外部供应具有所需功能的细胞来增强免疫反应，以帮助患者对抗癌症。它不仅重新激活了现有的免疫反应，还推动了新的免疫反应加入到抗肿瘤努力中。免疫细胞治疗的反应通常涉及多种免疫细胞类型的激活和协作，包括抗原呈递细胞，如树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，T淋巴细胞（T细胞）和自然杀伤（NK）细胞。肿瘤负担的免疫系统不仅在免疫细胞数量上失衡，而且在调节抗癌免疫反应的分子和信号通路上也表现出功能异常。因此，精确施用适当的治疗策略是必要的，以防止免疫细胞治疗的效果不佳。 根据癌症类型及其机制，免疫过程的各个领域为治疗干预提供了途径。方法包括，例如，提取和扩增具有预先癌症识别能力的免疫细胞（例如，肿瘤浸润性免疫细胞），外部分化有效的细胞类型[例如，细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞]，以及基因修饰细胞以实现特定识别和肿瘤细胞消除[例如，T细胞受体（TCR）工程，嵌合抗原受体（CAR）]。在本综述中，我们将讨论最新的免疫细胞治疗，总结应用于实现和优化这些治疗类别的策略，并提供未来的展望。 2.用低风险免疫细胞治疗癌症 低风险免疫细胞治疗旨在使用患者自己的免疫细胞来消除癌细胞。需要注意的是，“低风险”强调的是细胞治疗领域内某些治疗相对更安全、副作用较少，属于再生医学或先进治疗药物产品（ATMPs）。低风险免疫细胞治疗包括四种关键技术：肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）疗法、CIK细胞疗法、DC疫苗和DC/CIK细胞疗法。为了更全面地理解这些方法，必须深入研究促进这些细胞治疗的基本机制和临床进展。 2.1.TIL细胞治疗 TILs是存在于实体肿瘤微环境（TME）中的天然单核细胞，包括肿瘤内肿瘤浸润性淋巴细胞（iTILs）和基质肿瘤浸润性淋巴细胞（sTILs）。与iTILs相比，sTILs主要是效应记忆T细胞，更容易被检测到。作为一群已经接触过肿瘤组织的异质性淋巴细胞，TILs“预训练”攻击癌细胞，同时留下健康的细胞。在小鼠肿瘤模型中，这些异质细胞已经显示出治疗晚期癌症的潜力，第一个人类TIL治疗导致转移性黑色素瘤显著消退。实体瘤缺乏理想的肿瘤标志物，使得靶向肿瘤相关抗原（TAAs）具有挑战性。TILs作为具有多样化受体的多克隆细胞，为实体瘤提供了独特的治疗选择。与基因修饰的免疫细胞相比，TILs在克服实体瘤的异质性方面表现出优越性，特别是像黑色素瘤这样高度异质性的肿瘤。此外，它们具有注射后迁移至TME的趋化因子受体，并且与CAR-T细胞相比，它们的非靶向毒性较低，这归因于T细胞成熟过程中的负选择。 TILs可以从切除的肿瘤组织中分离出来。鉴于TIL在原始TME中的稀缺性，可供扩增的TIL数量有限，以及阻碍TIL抗肿瘤细胞毒性的额外因素（例如，Treg，肿瘤相关巨噬细胞，髓系抑制细胞和各种免疫抑制分子）。TIL的生产和扩增是TIL治疗成功的至关重要步骤。TIL在体外的扩增涉及快速扩增协议（REP）。在REP前阶段，TILs在高剂量白细胞介素（IL）-2下进行初级扩增。一些方法涉及选择肿瘤特异性TILs进行进一步扩增，而其他方法则扩增大量TILs以保持疗效。在REP阶段，同时给予高剂量IL-2和抗CD3，并使用辐照的同种异体外周血单核细胞（PBMCs）作为饲养细胞，直到获得足够数量的细胞。然后，经过质量控制的扩增细胞产品准备用于患者给药后进行淋巴细胞减少。 自1988年Rosenberg等人成功将TIL治疗应用于转移性黑色素瘤患者以来，一系列临床试验相继出现。1996年，TIL治疗首次被引入用于治疗非小细胞肺癌（NSCLCs），在涉及113名患者的临床研究中。结果显示，TIL与IL-2联合使用对NSCLCs是一种有效的治疗方法，与II期或IIIa期相比，对IIIb期NSCLCs有选择性益处。在初步成功后，TIL治疗的后续发展一直朝着提高治疗其他肿瘤类型的疗效方向发展，包括皮肤、肾脏和胃癌。这些发展中的具体方法旨在阐明TIL细胞类型的组成及其与临床结果的相关性。例如，成功生成的肿瘤浸润性B淋巴细胞（TIBs）已被发现可以预测转移性肾细胞癌（mRCC）患者的临床结果改善。另一项关于胃癌TIL治疗的研究表明，TIL的组织学亚群与不同的存活时间相关。目前，TIL治疗的临床转化仍处于初步阶段，缺乏长期临床观察。然而，初步成功表明有机会开发具有更有效分离和扩增方法的有希望的治疗性TILs，并可能与其他抗肿瘤疗法结合使用。 2.2.CIK细胞疗法 CIK细胞是具有混合T和NK细胞样表型的异质免疫效应细胞。它们是通过将人的PBMC或脐带血单核细胞与干扰素γ（IFN-γ）、抗CD3抗体、重组人IL-1和IL-2一起体外培养产生的。CIK细胞独特地表现出对肿瘤的主要组织相容性复合体（MHC）不受限制的靶向性，减少异体反应性，并能够攻击各种肿瘤类型。在体外培养过程中，CIK细胞分泌各种细胞因子以激活巨噬细胞、NK细胞和CD8+ T细胞的细胞毒性活性，从而直接抑制肿瘤细胞的生长并促进间接杀伤效果。CIK细胞诱导凋亡基因和抗肿瘤基因的表达，进行细胞毒性活动并促进肿瘤细胞凋亡。它们主要通过粘附分子淋巴细胞功能相关抗原-1/认知配体细胞间粘附分子-1（LFA-1/cam-1）与肿瘤细胞上的抗原结合的机制来实现肿瘤杀伤效果。这促进了MHC-I或MHC-II分子的表达，导致增强的呈递、激活、识别和直接杀伤肿瘤细胞。 激活的CIK细胞分泌各种细胞因子，包括IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和其他细胞因子，不仅直接增强细胞毒性效果和抑制肿瘤细胞，还通过调节免疫系统间接杀死肿瘤细胞。主要由CIK细胞产生的IFN-γ增强了NK细胞、巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活性。它还可以促进肿瘤细胞上MHC-I分子的表达，导致CTL杀伤增加。最近的研究指出，CIK细胞分泌的IFN-γ可以促进慢性淋巴细胞性白血病（CLL）细胞上ICAM-1的表达，对细胞毒性效应细胞的凋亡诱导产生积极影响。肿瘤细胞的凋亡基因也可以被CIK细胞激活，因为这些细胞表达FasL，一种属于TNF超家族的Fas配体，它诱导肿瘤细胞凋亡。Verneris指出，某些肿瘤细胞（如黑色素瘤和卵巢癌）通过诱导表达FasL的淋巴细胞凋亡来逃避免疫清除，但它们对CIK细胞敏感。这是因为，在CIK细胞的诱导过程中，Fas敏感或激活的T细胞被IFN-γ等细胞因子的作用或激活诱导的细胞死亡机制选择性地消除。结合CIK细胞中高水平的抗凋亡基因表达，这些因素使CIK细胞能够耐受表达FasL的肿瘤细胞诱导的凋亡。 尽管存在复发和无反应性的担忧，CIK细胞的异质性使它们能够靶向并杀死各种肿瘤细胞。自1991年引入CIK细胞疗法以来，已有超过5,000名患有多种肿瘤类型的患者，包括肺癌、乳腺癌、脑癌和结肠癌等，参与了CIK细胞疗法。全球CIK细胞（或CIK细胞与DC联合）的临床试验已超过80项。CIK细胞的治疗潜力超出了它们与NKG2D的相互作用，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）轴。与其他免疫疗法、常规化疗或放疗一起，CIK疗法表明了协同的抗肿瘤效果，正在发展中，是治疗癌症的一条令人鼓舞的途径。虽然临床前景看好，但一些公开讨论是必要的。与其他免疫细胞相比，CIK细胞输注后的毒性效应、最小化额外的支持性护理、确定与其他免疫疗法的优势、了解与CIK细胞在癌症微环境中的串扰的关键决定因素，以及在多个中心推广这种方法需要探索。 2.3.DC疫苗 操纵患者的自体DCs进行“疫苗接种”以对抗肿瘤组织是一种有前景的方法。DC疫苗涉及用TAAs（如肽、蛋白质、DNA/RNA或病毒）处理体外培养的DCs。DCs将摄取抗原，然后在仔细控制的培养过程中激活。DCs作为强大的抗原呈递细胞，对影响免疫系统起着至关重要的作用。虽然未成熟的DCs处理外来抗原，触发成熟和迁移到淋巴结，成熟的DCs可以在TME内促进肿瘤耐受，可能导致T辅助型2反应。 DC疫苗，通常采用体外成熟的自体单核细胞并用抗原冲击，已在多种肿瘤患者中显示出良好的耐受性和最小的毒性。然而，抗原特异性免疫反应的幅度和持续时间普遍较弱，限制了客观的临床反应。尽管在儿童肿瘤中的反应有限，正在进行的研究集中在增强疫苗生产的每一步上。策略包括扩大DC来源、提高免疫原性、优化抗原选择、开发新的免疫佐剂以及探索同时进行的免疫调节或化疗。 Sipuleucel-T是唯一获得FDA批准的自体DC疫苗，为有效的成人恶性肿瘤治疗提供了希望，特别是对于去势抵抗性前列腺腺癌。通过培养患者的PBMCs与一种由TAA（前列腺酸性磷酸酶（PAP））和GM-CSF组成的重组蛋白（PAP-GM-CSF）来生产。这种开创性的疫苗代表了DC疫苗领域的一个重要进展，展示了在成人和儿童恶性肿瘤中改善结果的潜在途径。在临床试验中，DC主要用于与CIK细胞、免疫检查点抑制剂（ICI）以及化疗和放疗结合的免疫疗法中以改善结果。研究表明DC能够激活自然杀伤T（NKT）细胞，或同时激活CD4+和CD8+ T细胞。 2.4.DC/CIK细胞疗法 当多种低风险的免疫细胞疗法一起使用时，可以实现积极的综合协同效应，特别是在DC和CIK的共同应用中尤为明显，它们是可适应和协同的。这种协同作用旨在增强身体对疾病的免疫反应。CIK细胞以其广谱的肿瘤杀伤效果而闻名，但由于缺乏特定的识别能力而受到限制。DC目前被认为是最有效的抗原呈递细胞，最近的研究表明CIK和DC之间的相互作用会在两个群体内部引起免疫刺激性表面分子表达的变化。实际上，与CIK细胞共同培养DCs发挥了互补作用，相互促进成熟，共同增加抗肿瘤活性，并展现出有希望的协同效应，即使在之前对CIKs有抵抗力且之前未与DCs共同培养的肿瘤细胞系上也是如此。DC分泌的细胞因子，如IL-2、IL-12和IFN-γ增强了CIK细胞的成熟，导致CIK细胞中CD3+、CD8+和CD56+亚群的水平增加。值得注意的是，DCs显著增加的IL-12分泌显著增强了CIKs的细胞溶解功能。此外，这种合作环境还减少了IL-10的分泌和调节性T细胞（CD4+CD25+ Treg细胞）的数量，减弱了它们对肿瘤免疫的抑制作用，并增强了CIK细胞的肿瘤杀伤效果。同时，CIK细胞增强了DCs的抗原呈递特异性和共刺激分子的表达，有助于整体增加抗肿瘤活性。此外，DC和CIK细胞的共同培养抑制了人类端粒酶逆转录酶（hTERT）蛋白的表达，抑制了端粒酶活性，并阻碍了肿瘤细胞的增殖。 基于上述机制，DC-CIK疗法以相互适应和协同为特点，已成为近年来肿瘤治疗领域的研究焦点。基础和临床研究迅速发展，并证明了在显著增强抗肿瘤免疫方面的有效性。尽管存在轻度移植物抗宿主病（GvHD）的担忧，试验经验表明结果是可控的。案例研究已经证明了安全性和提高的疗效。DC/CIK细胞疗法针对免疫系统的多个方面，从而形成了更全面的对抗疾病的方法。这在复杂情况或难治性恶性肿瘤中尤为有益，其中多种免疫功能障碍发挥作用。总的来说，低风险的免疫细胞疗法可以帮助增强免疫系统识别和消除有害实体的能力，从而改善健康结果。这些疗法的协同效应有潜力显著提高基于免疫的治疗的有效性，并为患者提供更好的结果。然而，评估和定制这些疗法的确切组合和剂量以确保其对个体患者的安全性和有效性至关重要。 3.高风险免疫细胞治疗技术的进步 高风险免疫细胞治疗使用自体干细胞、异体或异种细胞，或基因修饰细胞，所有这些细胞都需要进一步的操作和评估。这些治疗的设计非常适合其预期目的。这些治疗刺激针对肿瘤的新免疫反应，通常有潜力重新激活已有的反应。在这里，我们描述了高风险免疫细胞治疗中的特征设计、转染方法、细胞来源，以及克服抑制性肿瘤微环境（TME）的方法，包括CAR-T、T细胞受体-T（TCR-T）、CAR-NK和CAR-巨噬细胞（CAR-M）。此外，我们提供了对未来趋势的见解。 3.1.CAR的设计 CAR是工程受体蛋白，为免疫细胞提供了识别癌细胞表面特定抗原的新能力，从而可能触发免疫细胞消除癌细胞的潜力。当前研究表明，即使是对CAR结构的微小修改也可能会显著影响治疗效果。它通常由三个模块化域组成：细胞外域、跨膜域和细胞内域。 细胞外域：靶向的艺术。细胞外域包括一个用于目标结合的单链可变片段（ScFv）和一个铰链区域，通常在CAR工程细胞中的免疫球蛋白（Ig）样域铰链，并通过跨膜域锚定到细胞膜。通过CAR的细胞外域引入了驱动免疫细胞激活的新功能，包括T细胞、NK细胞和巨噬细胞。CAR工程免疫细胞能够识别癌症特异性靶标表位，不受MHC和共受体的限制，使它们在寻找和杀死癌细胞方面更有效。 CAR工程免疫细胞已经从针对单一抗原发展到针对两种不同抗原，以优化治疗阴性抗原癌细胞逃逸或抗原丢失的复发，并且结合任一抗原都将触发CAR工程免疫细胞的激活。这可以通过几种方式实现（图1A-C），例如将编码两个独立CAR分子的单个双顺反子向量转导到单个细胞中，或将编码双价CAR分子的向量转导到细胞中，或共同给药两种不同的CAR工程免疫细胞产品，或共同转导两个向量到单个免疫细胞中编码不同的CAR。这些方法对于B细胞淋巴性白血病特别有前景，尤其是对于复发或难治性B细胞急性淋巴性白血病（B-ALL），因为临床研究表明CD19/CD22共转导CAR-T细胞具有显著的疗效，以及CD19/CD22双特异性CAR-T细胞。同样，I期临床试验表明，双特异性CD20/CD19 CAR-T也可用于治疗复发和难治性B细胞恶性肿瘤患者，治疗28天后的总体反应率为82%，显示出治疗目的的安全性和有效性。此外，Wang等人表明，CD19/CD22双顺反子CAR-T与单特异性CD19或CD20 CAR-T细胞相比，在体外和体内表现出相当或更好的功能。 除了ScFv的优化，细胞外区域也得到了改进。与传统CAR直接作用于靶细胞不同，研究人员提出了一个新概念：模块化CAR（modCAR）。这种CAR-T（图1D、E）通常与其适配器一起工作，适配器的一端结合到细胞上，另一端用于识别和结合肿瘤表面抗原。适配器分子可以是单克隆抗体、抗体片段（图1D）、小分子或任何结构（图1E），只要能针对至少一个所需的抗原并介导目标与效应细胞之间的交联。它提供了一种高度灵活、可定制和通用的方法，以快速优化效应细胞活性，潜在地实现智能抗原靶向。 图1. CAR的设计策略。针对肿瘤的CAR设计示意图。(A) 通过将编码两个独立CAR分子的双顺反子载体转导到单个细胞中，可以生成双顺反子CAR工程细胞。(B) 通过将编码串联CAR分子的载体转导到细胞中，生成双价CAR。(C) 通过共同给予两种不同的CAR工程免疫细胞产品（上图）或共同转导两种编码不同CAR的载体到免疫细胞中（下图），实现双特异性，但产品将复杂且昂贵。可以使用抗体（D）或其他适配器（E）生成modCAR。(F) 设计装甲CAR以共表达分子，包括细胞因子和/或趋化因子，以增加效果和持久性。(G) SynNotch CAR通过添加分泌蛋白和结合剂，并利用特设计对机制执行AND、NOT和OR布尔逻辑门。这也可以通过特设计的转录因子和转录机制（H）实现。CAR：嵌合抗原受体；modCAR：模块化CAR。 装甲CAR细胞（图1F）旨在分泌细胞因子或其他分子，以帮助抵消肿瘤微环境（TME）的免疫抑制特性，潜在地提高CAR工程细胞的持久性和有效性。有时被称为第四代CAR细胞或TRUCKs（T细胞重定向用于抗原无限制的细胞因子启动的杀伤），它们为CAR靶向组织提供了一种多功能治疗，超越了传统CAR-T细胞的能力。TRUCK概念目前正在通过共表达分子如趋化因子配体或基于第二代或第三代CAR的细胞因子组合进行探索。其中，IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23以及这些分子的各种组合正在早期阶段试验中。值得注意的是，IL-7和IL-15已被发现可以促进CAR-T细胞的增殖，而IL-12和IL-18增强了T细胞的效应能力。此外，表达特定分子的工程CAR-T细胞，如CCL-19或CCL-21，能够趋化其他免疫细胞或CAR-T细胞向附近的癌细胞移动。这增强了免疫细胞的渗透和CAR-T细胞的存活，从而提高了CAR-T细胞的有效性。 CAR设计中的最新发展是合成Notch（SynNotch）受体（图1G，H），它提供了一种精确的靶向策略，允许精确控制CAR工程细胞的激活，同时通过引入可诱导的开关来最小化非靶向效应。一个典型的案例使用了布尔逻辑和逻辑门的原理，当所有条件满足时，通过构象变化激活的共定位依赖的蛋白开关（Co-LOCKR）可以执行AND、NOT和OR布尔逻辑门。在体外已经证明了针对癌细胞的特异性，但在临床应用中仍面临各种挑战。 细胞内域：信号和细胞功能。细胞内域由一系列共刺激域组成，CAR的分类基于共刺激域的数量。第一代CAR仅由CD3ζ组成，而第二代CAR除了CD3ζ外还含有一个共刺激域，第三代CAR则涉及一个以上的共刺激域以及CD3ζ。 在T细胞中，第一代CAR已构建包含编码针对2,4,6-三硝基苯酚（TNP）抗体的可变区域的重组基因片段，这些片段被拼接到α或β T细胞受体（α或β TCR）的C区之一。转导T细胞后，这种结构可以稳定地表达在T细胞表面，并能够识别MHC非限制性的肿瘤细胞，但在临床试验中显示出较弱的抗肿瘤效果。第二代CAR-T利用T细胞激活的经典信号，并增加了一个共刺激分子，如4-1BB（也称为CD137）或CD28，这显著提高了CAR-T细胞的激活水平和增殖能力。临床数据支持接受第二代CAR-T细胞治疗的患者对其肿瘤负担有延长和有效的控制。新发现的共刺激分子包括可诱导的共刺激分子（ICOS）、OX40（也称为CD134）和CD40等。第二代CAR结构在临床实践中最广泛使用。第三代CAR-T细胞包含两个共刺激分子，导致增强的细胞毒性。在临床试验中，当共同给予淋巴瘤患者CD19导向的第二代CAR-T细胞（带有CD28共刺激域）和第三代CAR-T细胞（带有CD28和4-1BB）时，观察到更长的持久性和优越的扩张。然而，目前评估仅第三代CAR-T的临床数据有限。在一个研究者发起的试验中，HD-CAR-1，一种第三代CAR-T治疗，在成人复发/难治性ALL患者中进行了评估。在90天的研究期结束时，80%的患者实现了完全缓解。此外，最近的研究表明，配备有4-1BB和CD28共刺激域的CAR-T细胞增强了T细胞记忆表型，与仅有一种共刺激分子的细胞相比，表现出更好的增殖和细胞因子释放水平。 迄今为止，大多数涉及CAR-NK细胞的研究都使用了最初用于T细胞的CAR构建。已经开发了包含CD28或4-1BB共刺激域的第二代CAR-NK。最近的研究报告称，含有细胞内域的CAR-NK，包含4-1BB和CD3ζ，克服了抑制信号并诱导了NK细胞特异性，导致杀死CD19+ aALL细胞。然而，已经为NK细胞特别创建了新的CAR设计，这些不同的CAR构建对NK细胞的细胞毒性和细胞因子产生有不同的影响。研究表明，包含NK特异性共刺激域2B4（也称为CD244）的CAR-NK细胞对肿瘤细胞有显著增强的细胞毒性活性，诱导快速增殖，增加细胞因子产生，并减少凋亡。这表明，与NK细胞上的常规4-1BB CAR相比，NK细胞特异性激活信号在CAR性能中起着至关重要的作用。此外，利用不同的信号域，如CD3ζ、DAP10和DAP12的CAR构建，在原代NK细胞或NK92细胞系中表现出不同的抗肿瘤活性。具体来说，与包含DAP10域的CAR相比，具有CD3ζ信号域的CAR表现出优越的性能，而使用DAP12域的CAR优于包含CD3ζ域的CAR。 CAR-M细胞与CAR-T细胞具有相同的结构和代级分类，但其细胞内信号域的功能不同，主要是为了增强吞噬作用。CAR-M细胞能够直接利用CD3ζ细胞内域传递吞噬信号。Fc受体（FcRγ）的γ亚基和多个表皮生长因子样域蛋白10（Megf10）也可以作为细胞内信号域。最近的研究结果表明，添加一个串联的PI3K招募域可以增加对癌细胞的吞噬。CAR-M的第一个临床试验产品是第一代产品，包含CD3ζ作为其细胞内域，并且第一阶段的临床试验结果显示了有希望的初步安全性和有效性结果，并获得了FDA的快速通道指定。 4.提高基因转移方法的效率 在免疫疗法中引入核酸，包括基因表达和CRISPR基因编辑，是一个至关重要但具有挑战性的步骤。近年来，非病毒转染技术因其在克服与病毒载体生产相关的劳动密集和昂贵程序以及cGMP合规性方面的经济利益而越来越受欢迎。例如，转座子或移动遗传元素被用来实现高效和持久的转基因表达，在产生稳定的CAR-T细胞方面引起了极大的兴趣。此外，电穿孔或机械穿孔能够使免疫细胞如T细胞短暂表达基因组编辑核酸酶，例如CRISPR-Cas9的表达，并已在基于mRNA的人类T细胞修饰中进行了探索。这些非病毒转染技术在程序简单性、容量和吞吐量以及有利的安全概况方面提供了优势。 与非病毒转染相比，病毒转导方法在临床环境中是主流模式，并被广泛认为是转染困难细胞类型（如免疫细胞）的一种高效方法。常用的病毒载体，如腺相关病毒载体和腺病毒载体，不能整合到宿主基因组中。然而，逆转录病毒载体和慢病毒载体可以整合，并且表现出高传递效率，使它们非常适合转导高度复制的细胞，如免疫细胞。Tecartus和Yescarta都是由Kite Pharma生产，依赖于γ逆转录病毒（GRV）载体将CAR构建体转导到T细胞中，而Kymriah则使用慢病毒（LV）载体进行转导。一般来说，γ逆转录病毒和LV系统经常用于将基因转移到T细胞中，研究表明它们通常可以获得30%-80%的转导效率。然而，安全性、效率和便利性问题是必须考虑的问题。 与T细胞相比，病毒基因传递到原代NK细胞已被证明既具挑战性又效率低下，可能由于NK细胞的固有特性。研究表明，使用逆转录病毒载体成功转染原代扩增的NK细胞，单轮转染效率范围为27%-52%，经过两轮转染后为47%-75.4%。虽然逆转录病毒已被广泛用于最近的临床前和临床研究中生产CAR-NK细胞，但缺乏有效的基因转移方法仍是NK细胞在免疫疗法中使用的主要障碍。此外，与逆转录病毒转染相关的插入性突变和对原代NK细胞活性的有害影响是临床应用中的主要限制。与逆转录病毒载体相比，基于慢病毒的转染具有较低的遗传毒性和插入性突变风险。然而，原代NK细胞在LV转导中的效率很低，需要多轮转染。最近，Bari等人表明，用狒狒包膜糖蛋白变体（BaEV-LV）伪型的LV载体的转导效率比用泡状口炎病毒糖蛋白（VSV-G-LV）伪型的高20倍以上，这是用于伪型LV载体的第一种且仍最广泛使用的糖蛋白。他们通过这种转染方法成功地在约70%的不同供体的原代人类NK细胞中表达了CD19-CAR，这些CD19-CAR NK细胞有效地且特异性地根除了CD19阳性肿瘤细胞。用BaEV-gp伪型的慢病毒带有肿瘤特异性CAR在NK92细胞中的转导率几乎达到100%，在iPSC衍生的NK细胞或激活的原代NK细胞中为50%-80%。因此，它可能是NK细胞CAR基因转移的有希望的载体。此外，用长臂猿白血病病毒（GaLV）包膜蛋白伪型的慢病毒可以有效转导原代NK细胞。电穿孔和脂质体介导的转染方法也用于在NK细胞中传递外源基因。与上述病毒转染相比，这些方法提供了更快的转基因表达、降低的凋亡水平、更小的个体间差异和更高的基因转移效率。然而，外源DNA通常不会整合到目标细胞的基因组中，导致转基因表达在转染后约3-5天内下降。但当与DNA整合技术结合时，这些方法可以产生稳定转染并表达转基因的细胞。DNA转座子是可以通过切割和粘贴机制在载体和染色体之间有效转座的移动DNA元素。PiggyBac（PB）和Sleeping Beauty（SB）是迄今为止最常用的两种转座子系统，与其他系统相比，在哺乳动物细胞中显示出最高的转座活性。通过将含有CAR的质粒和转座酶DNA转染到iPSC中，成功地稳定创建了表达CAR分子的CAR-iPSC-NK细胞。 与病毒载体相比，转座子系统提供了许多好处，例如较低的免疫原性、增加的生物安全性、降低的生产成本，以及能够转移基因片段，其载荷能力接近9-10 kb。这些优势使其成为将CAR整合到NK细胞基因组中以实现持久表达的一个有力选择。然而，要充分利用转座子系统对原代NK细胞进行转染，需要进行优化，例如通过电转染提高转导效率和细胞活性。 巨噬细胞比其他造血系统中的细胞更难转染和抵抗遗传操作，因为它们有能力识别并响应外来核酸。Bobadilla及其同事创建了一种基于HIV-1的慢病毒系统，该系统通过感染时Vpx诱导的SAMHD1降解，已被证明可以有效传递转基因到骨髓细胞。Klichinsky团队使用复制缺陷的嵌合腺病毒载体Ad5F35有效地传递CAR到巨噬细胞，并同时促进M1表型的表达，最终增强了肿瘤杀伤活性。这些结果强调了基因工程巨噬细胞在癌症免疫疗法中的潜力。与生成CAR-NK细胞的方法类似，转座子系统也被用来将感兴趣的基因整合到宿主基因组中。 4.1.新型细胞来源方法推动现成的免疫细胞治疗产品 迄今为止，所有商业批准的癌症免疫细胞疗法都依赖于自体使用，即使用的材料是患者自己的细胞。尽管这种方法已证明有效，但存在一些重要的限制，例如在处理快速癌症进展的患者时制造的不良等待时间，由于患者T细胞功能障碍可能导致的生产失败，与健康淋巴细胞一起提取的恶性白血病细胞污染产品的风险，高生产成本，标准化的复杂性，以及再剂量机会的限制。因此，当前的研究工作集中在开发同种异体疗法上，以克服自体疗法的限制。特别是，CAR-NK是一种有前景的同种异体细胞治疗，对实体瘤和血液系统恶性肿瘤均无重大毒性副作用。它是一种更简单、可再注射、更实惠的通用治疗。 然而，当前的治疗尚未显示出强大的疗效和/或长期持久性，并且NK细胞更难进行工程改造。CAR-NK细胞的研究主要在临床前和早期临床试验阶段，很少有临床试验报告。尽管如此，通用的同种异体CAR-NK细胞在癌症治疗中仍显示出巨大潜力。 目前，CAR-M主要是自体疗法，但“现成的”同种异体CAR-M已经出现并正在进行进一步研究。 在开发同种异体方法时，必须系统地解决最重大的风险：免疫排斥和GvHD（移植物抗宿主病）的发展。免疫排斥可能限制治疗的效力，因为接受者的免疫系统可能会排斥移植物。GvHD可能是致命的，由供体T细胞内源性的αβ TCR复合体识别宿主肽-人类白细胞抗原（HLA）复合体引起，导致组织损伤。为了解决同种异体风险，可以采用两种主要策略。第一种是在供体αβ T细胞上除了引入CAR转基因外，还进行额外的遗传修改。另一种是选择替代的细胞来源或亚群，如诱导多能干细胞（iPSCs）、脐带血（UCB）细胞、γδ T细胞、记忆T细胞亚群、病毒特异性T细胞（VST）等。 为了消除内源性αβ TCR介导的GvHD，最直接的方法是破坏编码T细胞受体恒定（TRAC）α链的基因。Eyquem等人开发了一个案例，通过腺病毒转染和CRISPR-Cas9敲入技术将CAR构建体整合到TRAC位点，同时诱导CAR表达和TCR失活。与随机整合相比，CAR表达可以由内源性TCR启动子调控，并在暴露于抗原时模仿TCR转录，防止恒定的和过度的T细胞激活，这可能导致T细胞分化和耗竭。此外，研究结果表明，这些TRAC-CD19 CAR-T细胞在ALL小鼠模型中显示出比用逆转录病毒编码的CAR的T细胞更大的抗肿瘤效力。 此外，除了CRISPR-Cas9，基因编辑技术，如TALENs和锌指核酸酶（ZFNs），也被发现在消除TCR表达以创建“通用”供体T细胞方面有效。然而，尽管TCR缺失的CAR-T细胞降低了GvHD的风险，但其长期持久性较短，可能是由于免疫排斥。因此，科学家们敲除了β2-微球蛋白（B2M）基因以限制HLA类I分子的表达。这种方法防止了异体CAR-T细胞通过它们的TCR被识别为外来物，但仍然容易受到宿主NK细胞的溶解。因此，一项研究使用突变的B2M融合蛋白来解决这个问题。为了在激活的异体CAR-T细胞生产过程中提高HLA-II消除的效率，一些学者提出抑制CIITA或HLA-DRA、HLA-DQA和HLA-DPA基因。 iPSCs具有无限的增殖和分化潜力，使它们成为创建众多同质HLA组合库的理想资源。通过从库中选择一个HLA匹配的iPSC来源，可以最小化宿主和移植物之间CAR-T细胞的免疫排斥风险，但必须进行严格的质量控制以确保安全，因为未分化的、增殖的iPSCs可能引发不良结果。Wang等人生成了缺乏HLA-I/II、B2M和CD155的低免疫原性iPSC衍生的CAR-T细胞。 研究通过体内发挥效应功能证明了它们抑制肿瘤进展的有效性。此外，iPSCs也为生产满足临床需求的CAR-NK和CAR-M细胞铺平了道路。与分化的NK细胞或巨噬细胞相比，iPSCs可以更有效地被工程化以稳定表达CARs。Li等人通过在培养基中添加各种细胞因子和促分化蛋白来分化CAR转染的iPSCs为CAR-NK细胞。这些iPSC衍生的CAR-NK细胞在体外和体内都显示出强大的抗肿瘤活性。Zhang等人建立了一个骨髓/巨噬细胞分化协议，诱导CAR-iPS向骨髓细胞系分化，成功产生了足够的CAR-iMac细胞（iPSC衍生的CAR-M细胞）。然而，当在小鼠模型中测试时，CAR-iMacs的有效性有限。总的来说，iPSC衍生的工程免疫细胞的发展涉及复杂的生产程序，需要精确的细胞产品制造和质量保证，以支持更广泛的临床应用。 γδ T细胞表达TCRγδ并以HLA独立的方式识别恶性细胞。它不需要消除TCR表达或信号，并且GvHD的风险低或不存在。研究表明，γδ CAR-T细胞显示出与传统的αβ CAR-T细胞相似或更大的细胞毒性效应，并且在体内没有观察到GvHD。然而，它们在体外的细胞毒性能力持续性较差。此外，针对CD20的γδ CAR-T细胞在B细胞淋巴瘤的动物模型中取得了有希望的结果，目前正在进行第一阶段的临床试验。 脐带血（UCB）提供了一个容易获得的NK细胞和同种异体T细胞来源。它们富含γδ T细胞和造血干细胞（HSCs），尽管总细胞数量有限。UCB衍生的CAR-T细胞在体内显示出增强的肿瘤抑制作用，减少了IL-10的分泌，并降低了调节性T细胞（Tregs）的比例，表明了改善的治疗潜力。Van Caeneghem等人从脐带血中分离出CD34+ HSCs，然后生成CAR-T细胞。这些CAR-T细胞具有原始表型（CD45RA+ CD62L+），并且不表达TCRαβ复合体，显著降低了GvHD的风险，并有效地消除肿瘤细胞。 记忆T细胞的特征是CD45RA−CD45RO+表型，它们不太可能发展为GvHD，也不太可能迁移到表现GvHD的器官。研究表明，T记忆干细胞（TSCM）和中央记忆T细胞（Tcm）与它们的分化对应物相比，具有优越的增殖和干细胞潜力，并且在T细胞转移后的临床研究中表现出高扩张和持久性。 VSTs拥有能够识别病毒抗原的TCR，如巨细胞病毒（CMV）、Epstein-Barr病毒（EBV）等。经过CAR改造的VSTs在实体瘤中显示出有希望的结果，但与CARs相比，工程化针对肿瘤的转基因TCR VSTs更具挑战性。在肿瘤细胞中表达EBV相关抗原的霍奇金淋巴瘤患者中，输注CAR-VST细胞取得了良好的耐受性和缓解率。针对HER2的CAR-VST细胞产品在CMV血清阳性和进行性胶质母细胞瘤患者的第一阶段临床试验中显示出既安全又临床有效。值得注意的是，可以建立VST库，以覆盖大多数患者，并促进CAR-T或TCR-T重定向到肿瘤的临床使用。 PBMCs通常来自外周循环或脐带血等。它是临床目的的主要NK细胞来源。PBMC衍生的NK（PB-NK）细胞可以从HLA匹配和不匹配的供体中分离出来，扩大了潜在供体池。通常，它们显示出成熟的表型，增殖能力降低，细胞毒性增加，没有GvHD的风险。Töpfer等人已经证明，表达CAR的NK细胞系YTS以及PB-NK细胞可以成功地重定向针对前列腺干细胞抗原（PSCA）阳性肿瘤，导致大部分治疗小鼠的肿瘤被完全根除。一种短暂表达针对间皮素的mRNA CAR，MCY-M11的CAR-PBMC细胞产品已进入临床试验，它是一种混合产品，包含不同的CAR工程T细胞亚群、单核细胞和B细胞群体，展现出理想的功能和免疫表型特征。 NKT细胞，也称为CD1d限制性T细胞，是一类同时具有T细胞和NK细胞特性的异质性T细胞群。这些细胞主要识别非多态性CD1d分子，这是一种结合自身和外来脂质以及糖脂的抗原呈递分子。I型NKT细胞或称为iNKT细胞不具有HLA限制性，可能作为通用供体细胞发挥作用，但其在体内的持久性尚未知晓。研究表明，CAR19-iNKT细胞表现出抗淋巴瘤活性，并且具有增强的消除脑淋巴瘤的能力。另一种异体NKT细胞，表达带有CD28和IL-15的抗CD19嵌合受体，目前正在进行临床试验，针对复发或难治性B细胞恶性肿瘤患者（NCT03774654）。 4.2.改善肿瘤微环境以增强治疗性免疫细胞的效果 免疫细胞治疗实体瘤的效果受限于低持久性和注入后的不充分增殖，这在很大程度上归因于免疫抑制微环境，它不是被动的旁观者，而是癌症进展的积极推动者。肿瘤细胞居住在这个由浸润和驻留宿主细胞（如T细胞和巨噬细胞）、分泌因子（如IL-10和转化生长因子-β（TGFβ））以及细胞外基质（ECM）组成的异质微环境中。这些组分可以相互作用，为恶性细胞的生长、迁移和转移创造支持性环境，从而逃避免疫系统和肿瘤特异性细胞毒性T细胞。为了根除肿瘤，科学家们开发了几种策略来促进CAR工程或TCR工程治疗性免疫细胞向癌症焦点的迁移和渗透，包括利用趋化因子受体如CCR2、CXCR2、CCR4、CXCR4等。这些研究表明，CAR-T、TCR-T和NK细胞显示出增加的肿瘤渗透率，导致肿瘤退缩和增强的抗肿瘤效果。然而，将基因工程免疫细胞渗透到肿瘤中只是抗癌的第一步。有时，可能需要直接转化方法来修改免疫抑制微环境。使用免疫检查点抑制剂，如抗PD-1、抗PD-L1抗体和抗CTLA4抗体，可以改善免疫抑制肿瘤微环境。然而，它可能导致药物抗性的出现、T细胞耗竭和复发，有时甚至会导致危及生命的毒性。在肿瘤微环境中阻断TGF-β信号是另一种提高检查点抑制剂效果和增强抗肿瘤反应的方法，因为它在肿瘤信号、重塑和代谢中起着至关重要的作用。临床证据也表明TGF-β信号与对检查点阻断剂无反应的患者之间存在相关性。为了解决这个问题，已经开发了双功能抗体-配体陷阱，使用针对CTLA-4或PD-L1的抗体与TGFβ受体II外域（TGFβRIIecd）融合。它可以在肿瘤微环境中隔离TGF-β，耗尽调节性T细胞，并促进CTL共刺激。此外，通过转导优势负性TGFβ受体-II（dnTGFβRII），开发了对TGFβ有抵抗力的肿瘤特异性T细胞，并已在动物模型和临床研究中显示出治疗益处。另一种新策略是利用肿瘤微环境中高浓度的免疫抑制信号分子，通过引入嵌合开关受体（CSR），如PD-1:CD28、TIGIT:CD28、CTLA-4:CD28、TGF-βRII:4-1BB、Fas:4-1BB。CSR由PD-1、CTLA-4或TGF-βRII的细胞外域和CD28或4-1BB的细胞内域组成。T细胞与CSR一起被转导，与CAR或TC共表达，以产生工程化CTL。这些工程化CTL仍然与肿瘤细胞上的免疫抑制分子相互作用，但通过细胞内域传递共刺激信号而不是抑制信号。最近，这一策略已经进行了临床测试。这些工程化细胞被发现能有效克服免疫抑制肿瘤微环境，例如分泌更多的IFN-γ，积聚在肿瘤中，并展现出优越的抗肿瘤功能。细胞外基质为各种抗癌疗法创造了物理屏障。然而，巨噬细胞在调节ECM和展示肿瘤归巢行为方面发挥着关键作用。CAR工程巨噬细胞被证明能主动迁移到肿瘤部位，可以作为药物递送系统在抗原特异性环境中局部递送细胞因子和/或细胞毒性物质，显著改变免疫抑制肿瘤微环境，并通过吞噬作用消除肿瘤细胞。张等人使用CAR修饰的巨噬细胞解决了ECM引起的免疫细胞渗透不足的问题。体外研究表明，CAR-147巨噬细胞能够重塑肿瘤的ECM，诱导CD3+ T细胞渗透，并提高肿瘤微环境中IL-12和IFN-γ的水平，最终展现出抗肿瘤效果。 4.3.临床研究进展 从临床进展的角度来看，自2017年FDA批准首个CAR-T细胞疗法产品以来，全球已有10个CAR-T产品获得批准（补充表1）。自2013年以来，CAR-T、CAR-NK和TCR-T疗法的临床研究迅速增加，到2022年CAR-T细胞疗法的数量达到258例，值得注意的是，2023年的数据来自1月至10月（图2A）。从国家角度看，高风险细胞疗法的临床研究主要分布在美国和中国，占全球研究的80%以上（图2B）。CAR-T疗法的主要临床治疗靶点是CD19、CD22、CD20和B细胞成熟抗原（BCMA）。在血液肿瘤中，增长最快的适应症是淋巴瘤和骨髓瘤。目前，TCR-T有一种治疗产品在市场上，用于转移性葡萄膜黑色素瘤。总的来说，TCR-T在实体瘤中的进展速度比血液肿瘤快（图2C）。TCR-T的靶抗原主要集中在MART-1、HPV16-E6、NYESO、HPV16-E7等。在病症方面，TCR-T的临床研究主要用于实体瘤的治疗。这些实体瘤大多与病毒感染有关，如与人类乳头瘤病毒（HPV）感染相关的宫颈癌。此外，TCR-T在头颈、肝脏和结肠癌症的临床研究正在迅速进展（图2C）。就CAR-NK病症而言，血液肿瘤仍然是进展最快的，其中淋巴瘤病症的进展速度更快（图2C）。 图2. CAR-T、TCR-T和CAR-NK疗法的临床试验。临床试验数据统计。(A) 2018年至2023年细胞疗法临床研究的数量，分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK几组。(B) 按国家分组的细胞疗法临床研究数量，同样分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK几组，Y轴在50到450之间中断。(C) 针对不同适应症的细胞疗法药物的临床进展，细胞疗法药物的分组与(A)相同，适应症分为液体和固体肿瘤两组。原始数据下载自https://classic.clinicaltrials.gov/，更新至2023年10月30日。CAR-T：嵌合抗原受体T细胞；CAR-NK：嵌合抗原受体自然杀伤细胞；CNS：中枢神经系统；HPV：人乳头瘤病毒；TCR-T：T细胞受体T细胞。 CAR-NK的临床治疗靶点主要是血液肿瘤的CD19、CD22和BCMA，以及实体瘤的PSMA、HER2、ROBO1和MUC1。总的来说，TCR-T和CAR-NK仍处于早期临床开发阶段。到目前为止，CAR-M的临床研究仍处于起步阶段，只有一个I期临床试验（NCT04660929）。图2的数据可从补充表2获得。 5.结论与展望 免疫细胞治疗在肿瘤治疗中变得越来越重要。与替代免疫治疗方法（如免疫检查点抑制剂和细胞因子）相比，免疫细胞治疗表现出了优越的疗效、特异性，并倾向于引起可接受的副作用。当作为某些癌症的独立治疗时，特别是采用性T细胞转移疗法，在血液系统恶性肿瘤如白血病和淋巴瘤中显示出了显著的成功。然而，由于免疫抑制肿瘤微环境、肿瘤异质性、靶标抗原表达低等因素，一些实体瘤对单独的免疫细胞治疗更具挑战性。在许多情况下，转向另一种免疫细胞治疗或将免疫细胞治疗与其他治疗策略（如化疗、放疗、其他免疫治疗或靶向治疗）结合起来被认为是有益的，可以通过不同的机制增强整体治疗效果。目前，全球已有10个CAR-T产品获批，而DC疫苗和TCR-T各有一个获批产品。在低风险免疫细胞治疗方面，TIL和DC疫苗在治疗实体瘤方面显示出了希望。此外，CIK治疗与其他免疫策略结合使用时显示出协同的抗肿瘤效果。这些方法通常由具有不同功能特征的异质细胞组成，在治疗相对高异质性的恶性肿瘤方面具有优势。另一方面，高风险免疫治疗如CAR-T和TCR-T通常是定向的和高度特异性的，使它们特别适合相对快速增殖的恶性肿瘤。在血液肿瘤中，CAR-T和TCR-T已经得到了临床验证，它们在治疗实体瘤方面的应用正在稳步进展。而基于其生物学特性，CAR-NK和CAR-M在治疗实体瘤方面具有固有优势。TCR-T专注于特定的肿瘤相关抗原和新抗原，使它们在外来抗原如病毒相关恶性肿瘤方面受益。研究人员目前正在努力突破包括CAR-T在内的细胞治疗技术的瓶颈。新的细胞来源和降低GvHD风险和其他风险的方法为“现成的”或同种异体细胞治疗创造了机会，这些治疗可以事先准备并在需要时轻松地给多个患者使用，实现更快的诊断和癌症治疗。此外，针对CAR的新颖设计最小化了对健康组织的损害，并与传统治疗相比减少了副作用。某些设计甚至为治疗实体瘤提供了可能性。此外，修改肿瘤环境和诱导记忆T细胞的策略使得实现长期效果成为可能。同时，由于这些疗法新颖、复杂和技术性，它们可能对公共卫生和个体患者构成以前未探索的风险。TIL细胞治疗、DC/CIK细胞治疗和DC疫苗被认为是低到中等风险。风险因素包括生产中使用的生物活性物质，如抗体、细胞因子、血清、生长因子和抗生素，以及在保存、冷冻、解冻和冷链运输过程中的产品稳定性和活性风险。此外，产品本身可能存在固有风险，如不完全去除肿瘤细胞或其他不需要的细胞，以及与归巢、植入、迁移和增殖相关的潜在并发症或降低的产品活性。然而，高风险免疫疗法需要更多的操作，使用基因修饰细胞、自体干细胞或同种异体或异种细胞，这需要额外的评估。在临床上，这些疗法有时可能引发细胞因子风暴和细胞因子释放综合征（CRS），这两种都是危及生命的全身性炎症综合征。因此，这些产品的风险管理考虑相应更具挑战性。必须仔细评估产品与患者相互作用产生的即时和延迟影响的潜在风险。这些风险包括不需要的免疫原性及其相关效应，包括CRS、GVHD、移植物排斥、过敏反应、超敏反应和免疫缺陷。此外，评估与患者细胞的预期和非预期遗传修饰相关的潜在风险也很重要，包括细胞功能、细胞凋亡、生长或分化的变化、插入性突变或遗传毒性以及恶性转化的可能性。然而，准确评估免疫细胞治疗的风险仍然具有挑战性。一些真正的风险超出了预期或在临床前研究中没有被揭示。重要的是要理解风险在临床研究中无处不在，它被定义为在特定时间框架内发生不利结果的可能性。评估可接受的免疫细胞治疗风险水平涉及权衡各种因素，而不仅仅是绝对风险，而是可能随之而来的潜在治疗益处。与患有较轻微肿瘤或癌症适应症且存在适当治疗方法的患者相比，患有危及生命的晚期或严重恶性肿瘤的患者可接受的风险水平要高得多。总的来说，免疫细胞治疗的技术障碍相对较高，创新动力强，技术发展多。近年来进展呈爆炸性增长。尽管CAR-T、TCR-T和DC疫苗已获批准，但其他免疫细胞治疗仍处于早期临床和临床前研究阶段。低风险疗法如TIL面临由于无法完全消除Tregs而有限的效力。CIK细胞治疗在获取和扩增方面遇到困难。DC肿瘤疫苗受到缺乏理想的肿瘤特异性抗原、TAA免疫原性弱、难以高效诱导免疫原性DC以及体外DC致敏方法的静脉回输无法有效激活DC分化和成熟的影响。高风险细胞治疗在克服肿瘤异质性的障碍方面仍有很长的路要走。CAR-T细胞仍面临效应T细胞耗竭、细胞因子风暴和免疫抑制微环境等挑战。TCR-T细胞治疗的挑战包括如何减少TCR不匹配和针对新抗原的最小选择。CAR-NK疗法正在经历遗传操作和细胞增殖困难。尽管CAR-M可能成为有希望的抗癌疗法，但它们尚未完全实现。临床研究需要确认肿瘤相关巨噬细胞在决定TME是否可以将肿瘤靶向CAR-M转化为肿瘤支持表型方面的高适应性。然而，免疫细胞治疗在抗癌疗法的未来开发中仍具有至高无上的潜力。人们普遍认为，快速的技术创新将使这些疗法成为高效的癌症治疗手段，显著改善治疗效果，推进人类医疗保健。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。