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摘要：嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤治疗中表现出显著的疗效，目前已有9种CAR-T细胞产品上市。此外，CAR-T细胞在将治疗应用扩展到实体瘤、心肌纤维化以及自身免疫和传染性疾病等不同领域展现出了有希望的潜力。尽管因此，目前的研究工作集中在解决这些问题上，以提高CAR-T细胞的安全性和有效性，并降低复发率。取得了这些进展，但与治疗相关的毒性反应和复发方面的重大挑战仍然存在。本文提供了CAR-T细胞疗法当前状态的全面概述，包括它们的成就、现有挑战和潜在的未来发展方向。 1. 引言  嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法是一种绕过主要组织相容性复合体依赖的免疫耐受和肿瘤逃逸的过继细胞疗法；它针对广泛的抗原（蛋白质、碳水化合物和糖脂），并且比常规化疗具有更高的持久性，呈现出一种有希望的免疫疗法形式。它通过基因修饰来自患者或健康供者的T细胞来靶向癌细胞，满足当前精准和个性化医疗的趋势。CAR-T细胞在治疗B细胞恶性肿瘤方面显示出有希望的结果，目前已有9种针对B细胞恶性肿瘤或骨髓瘤的CAR-T细胞产品上市。CAR-T细胞具有不可忽视的毒性副作用，其中细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）最为常见。CAR-T细胞毒性的管理是CAR-T细胞疗法的一个重要方面。当前CAR-T细胞的发展继续减少毒性并提高疗效。 2. 现状  2.1 CAR-T细胞的结构和功能  CAR基本上由不同的部分构成：胞外、铰链、跨膜和胞内结构域。具体来说，胞外结构域，被称为抗原结合域，来源于单克隆抗体的可变重链（VH）和可变轻链（VL）。这些链通过柔性连接，形成一个单链可变片段（scFv），主要用于促进对肿瘤细胞表面的相关抗原的识别。VH和VL链之间的相互作用以及决定互补性的区域的相对位置可以影响CAR对目标抗原的亲和力和特异性。铰链或间隔区域是胞外结构的一部分，从跨膜域延伸到结合单元。其作用与CAR-T细胞的功能有关，除了连接胞外和跨膜结构域之外。Okuno等人发现，铰链区域长度的修改有助于区分正常细胞和肿瘤细胞。此外，降低铰链区域的灵活性可以减轻CAR-T细胞的过度激活，并在高肿瘤负荷下提高存活率。跨膜结构域作为胞内间隔的信号通道，通常来源于CD3-ζ、CD4、CD8或CD28分子。其主要功能是将CAR分子锚定到T细胞膜上，研究表明它通过控制CAR表达的水平和稳定性来调节CAR信号，这在信号或突触形成中起作用，并与内源性信号分子的二聚体形成相关。胞内结构域主要由共刺激域和信号转导区域组成。在CAR工程中，CAR共刺激的含义是一个重要的焦点，最终目标是制造优化胞内结构域功能的CAR架构（图1）。 图1. CAR的五代。第一代CAR-T细胞结构仅包含1个抗原识别域，scFv，一个铰链区，一个跨膜域和细胞内激活域，而第二代CAR-T细胞有额外的共刺激域，第三代CAR-T细胞有2种不同的共刺激域。第四代CAR-T细胞通过修改分泌细胞因子。第五代CAR-T细胞是CAR-T细胞的最新一代，具有更高的安全性和可控性。CAR = 嵌合抗原受体，IL = 干扰素。 2.2 CAR-T细胞的发展  不同代的CAR-T细胞具有相同的基本结构。它们主要在胞内结构域以及引入的细胞因子和配体方面有所不同。第一代CAR-T细胞具有最简单的结构，仅包含抗原识别域、scFv、铰链区、跨膜域和胞内CD3-ζ激活域。缺乏共刺激域导致在临床试验中存活时间显著缩短，限制了细胞毒性潜力。将诸如CD28或4-1BB等共刺激域整合到第一代CAR-T细胞中，构成了第二代CAR-T细胞的出现，增强了增殖能力和细胞因子分泌。目前，所有商业化的CAR-T细胞产品都是第二代的。第三代CAR-T细胞设计包含一个双重共刺激框架，结合了不同的分子，即CD28和4-1BB。理论上，这种配置与第二代相比具有更高的细胞毒性和更长的治疗有效性。然而，目前的证据并不支持它们与第二代产品相比在临床上的优越性能。第四代CAR-T细胞，通常被称为TRUCK或装甲CAR-T细胞，通过细胞因子分泌如白介素（IL）-12，或表达抗-PD-1抗体或自杀基因来增强治疗潜力。这种增强通过绕过抑制因素提高了CAR-T细胞的疗效。与其第二代对应物相比，第四代CAR-T细胞表现出增强的扩张动力学、提高的效力和对抑制影响的增加抵抗力。超越第四代，第五代CAR-T细胞在第二代CARs的基础上增加了IL-2受体β（IL-2Rβ）链在CD3-ζ和CD28或4-1BB之间，提供了一个STAT3结合位点，激活JAK-STAT信号传导。通用CAR-T（UCAR-T）细胞，来自健康供体，通过生物素结合免疫受体或分裂、通用、可编程CARs基因编辑来破坏T细胞受体（TCR）和人类白细胞抗原I类基因，能够识别广泛的抗原。新兴技术，如逻辑门控，越来越多地被应用于CAR-T细胞的设计，以克服传统CAR-T（C-CAR-T）细胞的缺陷并提高其安全性和有效性。 2.3 CAR-T细胞的制造  CAR-T细胞的生成涉及一系列的过程。最初步骤中，T细胞是从患者或供体的外周血中获取的。与造血干细胞移植（HSCT）中的外周血干细胞收集一样，自体CAR-T细胞的获取由于患者同时存在的细胞减少症和受损的T细胞功能而面临独特的障碍。这阻碍了T细胞的有效回收，并为CAR-T细胞的高效获取带来了重大挑战。孤立的单克隆经过基因修饰以表达CAR，然后进行扩增。随后，修饰后的产品被冷冻保存并运输到医院进行给药。患者通常接受淋巴细胞耗竭化疗，也称为调节化疗，这增强了有利的细胞因子环境，同时减少了免疫抑制细胞。调节化疗对淋巴细胞计数的影响与CAR-T细胞的最佳疗效相关且必要。然后重新输注CAR-T细胞，它们专门识别目标抗原并在体内迅速增殖以发挥抗肿瘤作用。在重新输注期间以及随后的2至3周内，必须对患者的生命体征进行持续监测，以便及时检测和干预任何潜在的毒性不良反应，包括CRS和ICANS。此外，应对CAR-T治疗的疗效进行全面的长期随访评估。 2.4 CAR-T细胞治疗的临床应用  目前，CAR-T细胞治疗主要用于国内外市场上的血液肿瘤。其中，6种产品使用抗CD19 CAR-T细胞，针对复发或难治性（R/R）B细胞淋巴瘤和B细胞急性淋巴细胞性白血病（B-ALL），其余三种产品采用抗B细胞成熟抗原（BCMA）CAR-T细胞治疗R/R多发性骨髓瘤（MM）（表1）。 2.4.1 弥漫性大B细胞淋巴瘤 （DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（NHL）中最常见的侵袭性类型，其一线治疗方案为R-CHOP（利妥昔单抗联合环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松的免疫化疗），实现了70%至80%的缓解率。然而，30%至40%的患者对治疗无反应或复发，导致预后不佳，2年总生存率（OS）仅为20%至40%。CAR-T细胞疗法的开发和应用为R/R DLBCL的治疗提供了新的希望。 抗CD19 CAR-T细胞疗法是第三线治疗的金标准，并且作为R-CHOP治疗后难治性或早期复发的第二线治疗正在迅速发展。目前，有3种CAR-T产品上市用于DLBCL治疗：axicabtagene ciloleucel（axi-cel）、tisagenlecleucel（tisa-cel）和lisocabtagene maraleucel（liso-cel）。美国食品药品监督管理局（FDA）分别在2017年和2018年批准了axi-cel和tisa-cel用于治疗高级别B细胞淋巴瘤或DLBCL，这些患者复发或之前已经接受过2种或更多化疗方案的治疗。Liso-cel在2021年获得批准。一系列临床试验和现实世界证据已经证明了CAR-T细胞疗法在治疗R/R DLBCL中的有效性。ZUMA-1试验显示，axi-cel的客观缓解率（ORR）为83%，完全缓解（CR）率为53%，在大量预处理的大B细胞淋巴瘤（LBCL）患者中，中位OS超过2年。5年随访结果显示，中位OS为25.8个月，5年OS率为42.6%。ZUMA-7试验使用axi-cel与标准护理（SOC）作为R/R LBCL患者的二线治疗，并显示axi-cel和SOC组的中位无事件生存期（EFS）分别为8.3个月和2.0个月，ORR分别为83%和50%，CR率分别为65%和32%。ZUMA-12是第一个评估axi-cel作为高风险LBCL一线方案的研究，ORR为89%，CR率为78%。美国淋巴瘤CAR-T联盟的研究报告了axi-cel在批准适应症的标准护理环境中的ORR为82%，CR率为64%。在美国，一项关于axi-cel治疗LBCL的研究报告显示，ORR为73%，CR率为56%。中位OS和无进展生存期（PFS）分别为21.8个月和8.6个月。 2.4.2 急性淋巴细胞白血病 （ALL）在儿童中表现出高治愈率，5年总生存（OS）率超过90%，但成人的长期生存率仅为35%至45%，大多数复发是由于化疗耐药性。对于复发/难治性（R/R）ALL亚型，预后比原发性ALL要差得多，长期OS率为15%至50%。近年来，CAR-T细胞疗法在治疗R/R ALL方面取得了良好进展，研究最多的靶点是CD19。2017年8月，FDA批准了首个CD19-CAR-T细胞产品，即tisa-cel，用于儿童和青少年ALL的治疗。在一项tisa-cel的单中心I-IIa期研究中，3个月时的总缓解率为81%，6个月时的无事件和OS率分别为73%和90%。 与CD19一样，CD22也是ALL中研究得非常充分的靶点。在患有B-ALL的成人和儿童中，90%表达CD22。一项CD22+ CAR-T细胞的I期研究显示了剂量依赖性的完全缓解（CR）率，接受较高剂量的患者中有73%达到了CR。一项更大型的研究表明，使用抗CD22 CAR-T细胞的安全性和可行性。CRS的发生率是86.2%，90%为1-2级CRS，轻度短暂的神经毒性症状，CR率为70%。中位OS率为13.4个月。 管理与CAR-T细胞治疗R/R B-ALL相关的毒性反应和复发仍然是一个挑战。此外，需要更长时间的随访以获取更多临床数据，以确认其长期疗效。 2.4.3 多发性骨髓瘤 MM在很大程度上是不治之症，几乎所有患者最终都会复发，随着治疗选择的使用，缓解时间缩短。CAR-T细胞治疗是针对R/R骨髓瘤患者的有希望的新治疗选择。最广泛研究的MM CAR-T细胞靶点是BCMA，肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF17)的成员，其在浆细胞中而非造血干细胞中的优先表达使其成为理想的抗原靶点。2021年3月和2022年2月，FDA批准了2种抗BCMA CAR-T细胞产品用于MM治疗：ide-cel/Abecma和cilta-cel。2023年6月，国家药品监督管理局批准了第三种CAR-T细胞产品CT103A用于MM治疗。II期研究显示，接受ide-cel治疗的患者中有73%的反应率，33%的CR率，中位PFS为8.8个月。在最新的III期试验中，中位PFS分别为13.3和4.4个月，反应率分别为71%和42%，在ide-cel和标准方案组中。 设计用于评估cilta-cel安全性和临床活性的Ib/II期试验显示，总反应率为97%，CR率为67%，常见不良事件，CRS的发生率为95%；仅有9%的严重CRS，大约60%的患者在2年内没有疾病进展。FUMANBA-1试验的CT103A显示，ORR为95%，部分反应为4%，具有良好的安全性。在2023年ASCO年会上提出的更新数据显示治疗疗效显著提高。总反应率飙升至96.0%，显著的严格CR（sCR）率为74.3%。令人印象深刻的是，之前接受过CAR-T细胞治疗的12名受试者中有9人实现了缓解，其中5人实现了sCR，其中4人维持sCR超过18个月。 需要进一步的研究来验证这些发现。除了BCMA，还发现了其他靶点，包括CD138、CD38、CD19、GPRC5D、SLAMF7(CS1)、APRIL、TACI、CD229、CD56、MUC1、NKG2D配体、整合素b7、κ轻链、FcRH5、CCR10和CD44v6。POLARIS是第一个针对GPRC5D靶向CAR-T细胞(OriCAR-017)的人类、单中心、单臂、第一臂试验，专门招募中国患者，结果显示总反应率为100%，CR率为60%，没有严重的不良反应。 O’Neal等人开发了针对CS1(SLAMF7)的CAR-T细胞，尽管CD8+ CS1表达的CAR-T细胞杀死了CD8+ CS1细胞，但在高肿瘤负荷的骨髓瘤模型中显示出疗效。一项针对BCMA和CD38的人类化双特异性BM38 CAR-T细胞的I期试验显示，反应率为87%，CR率为52%，中位PFS为17.2个月。 表1 九种CAR-T细胞产品 CAR-T生产 靶标 应用Kymriah（tisagenlecleucel，tisa-cel）CD19复发/难治性B-ALL，复发/难治性DLBCL Yescarta（axicabtagene ciloleucel，axi-cel）CD19复发/难治性DLBCL Tecartus（brexucabtagene autoleucel）CD19复发/难治性MCL，复发/难治性B-ALL Abecma（idecabtagene vicleucel，ide-cel）BCMA复发/难治性MM Breyanzi（lisocabtagene maraleucel，liso-cel）CD19复发/难治性DLBCL Axicabtagene ciloleucel CD19复发/难治性DLBCL Relmacabtagene autoleucel CD19复发/难治性DLBCL；Carvykti（ciltacabtagene autoleucel，cilta-cel）BCMA复发/难治性MM CT103A，IBI326 BCMA复发/难治性MM CAR = 嵌合抗原受体，R/R B-ALL = 复发/难治性B细胞急性淋巴细胞性白血病，R/R DLBCL = 复发/难治性弥漫大B细胞淋巴瘤，R/R MCL = 复发/难治性套细胞淋巴瘤，R/R MM = 复发/难治性多发性骨髓瘤。 目前CAR-T细胞治疗通常用于MM治疗的后期；制备过程缓慢且成本高，一些患者不可避免地会复发。探索新靶标以减少CAR-T细胞毒性并提高其安全性是未来发展的方向。 2.4.4 套细胞淋巴瘤 除了一些接受异体骨髓（BM）移植的患者外，套细胞淋巴瘤（MCL）的治愈性是不确定的。标准化疗后的预后较差，中位生存期约为3年，长期无病生存罕见。CAR-T细胞治疗是一种新的有价值的治疗方式。目前市场上针对R/R MCL的CAR-T细胞产品是brexucabtagene autoleucel。ZUMA-2，一项II期多中心临床研究，在所有68名接受治疗的患者中，客观反应率为91%，完全反应为68%，中位随访时间为35.6个月。TRANSCEND研究报告称，接受liso-cel治疗的R/R MCL患者中，ORR为84%，CR为59%。 2.5 不良反应和毒性  2.5.1 细胞因子释放综合征  CRS是CAR-T细胞治疗中最常见的不良反应，是由CAR-T细胞在结合相应靶抗原时释放的炎症细胞因子和趋化因子触发的炎症状态。 在接受CAR-T细胞治疗的血液系统恶性肿瘤患者中，CRS的发生率是55.3%。美国移植和细胞治疗学会（ASTCT）将CRS定义为“任何免疫治疗后，由于内源性或输注的T细胞和其他免疫效应细胞的激活或参与，而产生的超生理反应。”CRS的发病机制目前尚不清楚。IL-6和IL-1，由单核细胞、巨噬细胞和树突细胞产生，在其中起关键作用。研究发现CAR-T细胞激活了gasmdermin E（GSDME）来介导细胞焦化，并通过大量释放穿孔素和颗粒酶B，随后引发CRS。动物实验表明，敲除GSDME、破坏巨噬细胞或阻断GSDMD的激活可以防止CRS的发展。症状可能是渐进的，首先是发烧，这可能发生在细胞输注后的几小时或几天内， 以及低血压、毛细血管渗漏（缺氧）和终末器官功能障碍。 其他症状类似于流感，包括肌肉痛、头痛、僵硬、不适和食欲不振。低级别的CRS是自限性的，而其他患者可能会出现低血压、败血症和毛细血管渗漏综合征，这些症状会因休克、播散性血管内凝血（DIC）和多器官衰竭而进一步恶化。 其进展和严重程度通常被认为与疾病负担、CAR结构和剂量、淋巴耗竭调节方案等因素有关。CRS的持续时间不同，取决于干预措施，通常在CAR-T细胞输注后2至3周完全解决。 管理CRS最重要的一步是仅在能够忍受CRS的患者中使用CAR-T细胞治疗，并提供适当的支持性护理和干预措施，包括直接靶向和非特异性免疫抑制策略，基于患者和CAR-T细胞产品。托珠单抗，一种IL-6受体拮抗剂，是FDA批准的用于CAR-T细胞相关CRS的唯一治疗方法。一些研究表明，早期使用托珠单抗和/或皮质类固醇治疗可降低3级或更高级别 2.5.2 免疫效应细胞相关神经毒性综合征 （ICANS）是CAR-T细胞疗法中另一种常见的不良反应，它可以与CRS同时发生、在CRS之后发生或独立于CRS发生。在血液系统恶性肿瘤患者中，有37.2%在接受CAR-T细胞治疗后会发生神经毒性。ICANS被ASTCT定义为“一种疾病，其病理过程涉及中枢神经系统，导致内源性或输注的T细胞和其他免疫效应细胞在任何免疫疗法后的激活或参与。”早期表现可能包括表达性失语和书写变化，随后进展为意识水平改变、昏迷、癫痫发作、虚弱和脑水肿。这一发生的机制尚不清楚。研究表明，脑壁细胞中CD19的表达是CAR-T细胞治疗中发生的神经毒性的原因，这表明了针对CD19导向治疗中的神经毒性的靶向机制。ICANS的治疗选择包括禁食、保持水化、营养支持疗法和改进的神经系统检查。糖皮质激素被认为是ICANS快速缓解的首选一线治疗。对于类固醇难治性ICANS，可以使用阿那白介素。这在统计上显著且迅速减少了发热、炎症细胞因子和与ICANS/CRS相关的生物标志物。对于有癫痫发作或中枢神经系统（CNS）疾病史的患者，可以使用左乙拉西坦预防。苯二氮卓类药物和额外的抗癫痫药物（左乙拉西坦和苯巴比妥）被推荐用于治疗活动性癫痫发作。ICANS是CAR-T细胞疗法的常见并发症，症状逐渐进展，早期诊断和预防是其管理的重要工具。不断改进控制不良反应的措施可以进一步突出CAR-T细胞疗法的优势。 2.5.3 其他相关毒性  严重的靶向肿瘤外毒性（OTOT）经常发生在CAR-T细胞治疗实体瘤的临床试验中，其主要机制是CAR-T细胞介导的正常细胞的识别和裂解，这些细胞表达目标抗原。尽管CAR-T细胞目前针对实体瘤的主要靶标是肿瘤相关抗原（TAAs），但它们也在非恶性组织中表达。当前减轻OTOT的策略包括：（1）修改CAR组分，提高CAR-T细胞对肿瘤细胞的特异性识别；（2）通过逻辑门控开关减少CAR-T细胞的毒性，提高细胞死亡的特异性；（3）使用药物通过调节其信号通路或CAR表达水平来限制CAR-T细胞的功能。由于针对正常细胞的抗CD19 CAR-T细胞的靶向非肿瘤效应，经常发生B细胞发育异常，导致低丙种球蛋白血症和随后的频繁感染表现。在接受针对B-ALL的抗CD19 CAR-T细胞治疗后，有报道称B细胞发育异常可长达5年。感染在接受CAR-T细胞治疗后非常常见，大多数发生在1至2年内，感染发生率约为55%。在CRS反应期间，合并感染的死亡率很高；因此，感染预防和控制是CAR-T细胞治疗的最高优先事项。血细胞减少症包括贫血、血小板减少症、白细胞减少症和中性粒细胞减少症。此外，CAR-T细胞治疗还会引起不良反应，包括播散性血管内凝血（DIC）、噬血细胞综合征、肿瘤溶解综合征和移植物抗宿主病（GVHD）。 2.6 复发  在接受CAR-T细胞治疗的B细胞恶性肿瘤患者中，复发被定义为通过T细胞输注实现CR后肿瘤细胞的持续存在。大约40%至60%的患者会发生复发；在R/R ALL中，30%至60%的患者在接受CAR-T细胞治疗后复发，其中10%至20%是CD19阴性复发。CAR-T细胞治疗失败最常归因于抗原逃逸，即抗原阴性复发；然而，抗原阳性复发也经常发生，这可能与CAR-T细胞的内在因素有关。因此，肿瘤细胞本身、肿瘤微环境（TME）和CAR-T细胞可能会影响复发。肿瘤细胞的固有异质性为肿瘤的克隆进化和恶性进展奠定了基础。在CAR-T细胞输注之前，表达低或阴性抗原的肿瘤细胞可能会逃逸并发生二次克隆扩张。输注后CAR-T细胞在体内的功能受损和持久性减少也可能导致复发。CD19外显子3中的点突变可以影响CD19 FMC63 CAR-T细胞识别的表位，并在患有高级别B细胞淋巴瘤的患者中诱导CD19阳性复发。大多数CAR中的单链可变片段（scFv）来源于小鼠，具有高抗原性、低持久性和高复发率。 3. 未来发展方向 3.1 应用扩展  针对血液恶性肿瘤，包括霍奇金淋巴瘤（HL）、T细胞淋巴瘤和急性髓系白血病（AML）的CAR-T细胞治疗仍处于探索阶段。尽管CAR-T细胞治疗的适用范围几乎涵盖所有肿瘤类型，但其临床应用仍受到肿瘤抗原多样性和TME异质性的挑战的制约。因此，将CAR-T细胞治疗转化为这些疾病的临床实践尚未实现。此外，CAR-T细胞的应用已经扩展到非肿瘤性疾病，如自身免疫性疾病、HIV等感染性疾病和心肌纤维化。 3.1.1 霍奇金淋巴瘤  HL是一种B细胞淋巴瘤，其特点是TME中恶性细胞数量少，免疫效应细胞数量多。HL的发病率较低，在英美两国大约为每10万人中有2.7到2.8例，男性发病率高于女性，最高发病率在年轻人和60岁以上的个体中。大多数经典HL患者可以通过一线治疗治愈；然而，大约15%的患者会在初次治疗反应后发展为原发性难治性疾病或复发。 对于一线治疗失败的患者，SOC是大剂量化疗后进行自体HSCT；大约50%的患者会在移植后复发，预后较差。针对HL的抗CD30 CAR-T细胞已进入临床试验，并且在一项I期研究中，7名复发HL患者中没有观察到任何毒性。一位患者在接受第二次输注后发展为完全反应（>2年）。Ramos等人进行了两项平行的I/II期临床试验，总体ORR为62%，没有剂量限制毒性，轻度血液学毒性，CRS发生率为24%。 3.1.2 T细胞恶性肿瘤 T细胞恶性肿瘤是一类异质性肿瘤的广泛谱系，包括前体T细胞恶性肿瘤，如T淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤（T-ALL/LBL），以及成熟的T细胞恶性肿瘤，如T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、成人T细胞白血病/淋巴瘤、T细胞前淋巴细胞白血病和许多外周T细胞淋巴瘤（PTCLs）。T-ALL是一种淋巴系统的恶性肿瘤，占儿童ALL病例的10%至15%，成人病例的大约25%。T淋巴细胞性淋巴瘤（T细胞淋巴瘤）是一种NHL，其生物学特征与T-ALL相似，被归类为皮肤T细胞淋巴瘤或PTCL。在T细胞淋巴瘤中，预后较差，通常是由于药物抗性和患者对化疗方案的不耐受。与B细胞恶性肿瘤的情况不同，CAR-T细胞治疗在对抗恶性T细胞自我破坏、T细胞再生和产品污染方面面临挑战。 针对T细胞恶性肿瘤，有许多CAR-T细胞靶标，包括CD7、CD7、CD99和Vβ8，所有这些都目前处于研究阶段。CD7是一种跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族，在T-ALL和T细胞淋巴瘤中高度表达。Lu等人报告了一项开放式、单臂I期临床试验，使用自然选择的CD7 CAR-T（NS7CAR）。在20名患有R/R T-ALL和T细胞淋巴瘤的患者中，19名在第28天的骨髓中实现了MRD阴性CR，14名在接受NS7CAR输注后接受了异体HSCT，并且至今没有复发。只有1名患者发生了3级CRS。89 2022年9月，Hu等人报告了一项使用CD7通用CAR-T细胞治疗T细胞恶性肿瘤的I期临床试验，11名可评估患者的总体反应率为81.8%，完全反应率为63.6%，没有剂量限制毒性、GVHD、ICANS或严重的CRS（≥3级）。Shi等人报告了在T-ALL中使用抗CD99 CAR-T细胞，并显示出体外和体内对肿瘤细胞的有效抑制增殖和诱导凋亡，同时对正常细胞没有细胞毒性。Li等人报告说，抗Vβ8 CAR-T细胞能够识别并杀死所有由克隆扩增产生的Vβ8+恶性T细胞，同时保留恶性或健康的Vβ8-T细胞，从而实现足够的T细胞介导的细胞免疫。 3.1.3 急性髓系白血病  AML是一种异质性的血液系统恶性肿瘤，是成人最常见的急性白血病形式。它的特点是髓母细胞在外周血、骨髓和/或其他组织中的克隆性扩张。93 在美国，AML的年发病率为每10万人中有4.3例，男性略高于女性。AML占所有亚型白血病死亡的高达62%。94 常规化疗后，年轻成人的复发率为10%至60%，老年人AML的复发率在年轻成人中为10%至60%，在60岁以上人群中为40%至60%，5年患者生存率约为27.4%。Jetani等人开发了一种针对Siglec-6的CAR-T细胞，在临床前模型研究中显示出对白血病有反应，并能在异种AML模型中诱导完全肿瘤缓解。Hebbar等人报告了一种GRP78-CAR-T细胞，在体内对AML有显著的抗白血病活性，且对造血祖细胞无毒性。CLL-1 CAR-T细胞的I期研究显示，完全缓解(CR)/不完全血液学恢复的完全缓解(CRi)率为70%，总生存(OS)率为60%。所有患者都经历了CRS，但没有神经毒性。Sugita等人评估了异基因基因编辑的CAR-T细胞对AML治疗的潜力。UCART123在体内外均有效消除AML，对正常细胞没有显著影响。一项针对自体抗CLL-1 CAR-T细胞的I/II期临床试验显示，在8名复发/难治性AML儿童中，有4人达到了无白血病的形态学状态，没有最小残留疾病，1人达到了CR。Wu等人报告了一项针对AML的抗CD70 CAR-T细胞的临床前研究，显示出与CD70+ AML细胞系共培养时的强细胞毒性和在小鼠模型中的强抗白血病活性。然而，这并没有在体内完全消除白血病。目前，尚未确定AML的理想CAR-T细胞靶标。最近的研究提出了使用单细胞转录组分析来预测在恶性细胞而非健康细胞（包括T细胞）上表达的靶抗原，以开发新的AML治疗CAR-T细胞。利用公开的RNA测序数据，包括来自15名AML患者的超过50万个单细胞和9名健康患者的组织，研究人员计算鉴定了2个潜在的新靶标，CSF1R和CD86。CSF1R-CAR-T和CD86-CAR-T细胞在AML细胞系和人源AML模型中的功能验证试验中显示出强大的疗效。 3.1.4 实体瘤  CAR-T细胞治疗的适应症多样，几乎涵盖了每种肿瘤类型。主要挑战可以概括为三个主要组成部分：识别、迁移和存活。实体瘤抗原异质性阻碍了肿瘤细胞特异性抗原的识别。相比之下，免疫抑制性TME干扰了T细胞的活性，包括分化和耗竭。之前的一项研究表明，抗GPC3-CAR-T细胞在原发性人类肝细胞异种移植模型中有效地抑制并消除了肿瘤。Cao等人开发了一种新型双特异性GPC3-BiTE CAR，与单靶点CAR-T细胞相比，在体外功能分析中显示出更好的抗肿瘤活性，并克服了由抗原异质性引起的肿瘤逃逸。Moghimi等人开发了一种GD2/B7H3 CAR-T细胞模型，证明了在抑制神经母细胞瘤生长和增加体内持久性方面的高特异性。CLDN18.2靶向CAR-T细胞（CT041）在胃肠道癌症中的I期中期试验显示，总响应率和疾病控制率分别为48.6%和73.0%。所有患者都经历了≥3级血液学毒性，没有观察到≥3级CRS或神经毒性。Meister等人开发了一种多功能mRNA基础的CAR-T细胞，显示出对胶质瘤的强烈抗肿瘤活性，在体内外试验中没有显示出毒性。Li等人开发了一种合成锌指转录调节因子，synZiFTR，通过编程药物依赖的、交付后控制体内T细胞抗肿瘤活性，调节CAR-T细胞在异种移植血液肿瘤模型中的体内疗效。他莫昔芬诱导的synZiFTR在体外以剂量和时间依赖性方式调节细胞因子的表达，包括IL-2和IL-12，安全且可控地增强了CAR-T的疗效。随后，Allen等人设计了一种增强型Notch受体包含CAR-T细胞，并表明工程化的synNotch诱导的IL-2电路在局部产生IL-2，推动CAR或TCR T细胞有效地渗透到胰腺癌和黑色素瘤的免疫排斥肿瘤模型中，增强免疫细胞渗透并减少系统毒性。一项临床前研究发现，局部注射靶向间皮素的CAR-T细胞在小鼠中清除了残留的肿瘤组织，没有显著的毒副作用。 3.1.5 心肌纤维化  心血管疾病约占全球所有死亡的31%，几乎所有与心力衰竭相关的心脏病都涉及心肌纤维化。以过量的细胞外基质蛋白沉积为特征的纤维化，是对慢性炎症的基本病理反应，在心血管疾病发展中具有重要的病理生理学意义。心肌纤维化的治疗策略仍处于研究阶段，CAR-T细胞治疗已取得显著进展。Rurik等人开发了一种在体内生成瞬时工程化CAR-T细胞的方法，该方法逆转了纤维化并在体外显著改善了心力衰竭。这不仅为心肌纤维化，也为其他纤维性疾病提供了可能性。然而，需要进一步的研究来验证安全性和有效性。 3.1.6 自身免疫疾病 自身免疫疾病源于免疫系统攻击身体自身的组织，通常被分类为器官特异性或系统性。目前的常规治疗包括非甾体抗炎药、糖皮质激素和疾病修饰性抗风湿药物；然而，彻底消除疾病已被证明是难以捉摸的。CAR修饰的T细胞可以杀死自身免疫疾病中的异常免疫细胞，如B细胞或分泌抗体的浆细胞，提供了潜在的治愈方法。Mougiakakos等人报告了使用自体CD19 CAR-T细胞成功治疗了一名患有严重难治性系统性红斑狼疮（SLE）的患者，该患者出现了活动性狼疮性肾炎，实现了血清学和临床缓解以及SLE疾病活动指数（DAI）评分从基线的16降至随访时的0，没有不良事件。随后，Mackensen等人报告了5名患有难治性SLE的患者接受了CAR-T细胞治疗。所有患者在3个月时实现了SLE缓解，中位SLE DAI评分为0，并实现了无药物缓解，在随访时没有观察到复发；他们也很好地耐受了CAR-T细胞治疗，没有或只有轻微的不良效应。这些数据表明，CD19+ CAR-T细胞移植是可行的、可容忍的，并有效治疗SLE。Müller等人报告了第二种自身免疫疾病通过CAR-T抗合成酶抗体综合征得到了治愈。经过6个月的CART细胞治疗，磁共振成像显示肌炎病变完全消退，肺炎消失，并实现了无药物缓解。目前，缺乏关于CAR-T细胞治疗在自身免疫疾病背景下有效性的全面长期数据。临床应用主要仍处于调查阶段，有限的病例正在进行临床试验，因此需要继续评估安全性和长期结果。尽管如此，这些有希望的结果突出了CAR-T细胞治疗作为自身免疫疾病治愈措施的潜力。 3.1.7 传染病  在传染病中，艾滋病是CAR-T细胞治疗研究的主要焦点。这种疾病没有治愈方法，患者需要终身服药。尽管抗逆转录病毒疗法的出现大大减少了与HIV感染相关的发病率和死亡率，但在潜伏感染的细胞中需要终身坚持治疗的稳定的HIV储库，中断抗逆转录病毒疗法可能导致病毒的快速重新激活。Liu等人开发了一种源自广泛中和抗体的CAR-T细胞治疗，产生针对HIV-1感染细胞的特异性细胞毒性活性，并有效地去除了HIV重新激活的感染CD4+ T淋巴细胞。最近的研究显示，通过外周静脉注射抗HIV duoCAR-T细胞可以定位到人源化小鼠脾脏中的活跃HIV感染部位，并消除了原发性HIV感染的细胞。 3.2 新靶标  目前，CAR-T细胞治疗在AML、HL、T细胞恶性肿瘤和实体瘤方面仍处于研究阶段，除了在B细胞恶性肿瘤方面的成功之外。人们希望新靶标的开发将有助于推进CAR-T细胞治疗在这些疾病治疗中的发展。例如，CD5+ CAR在针对各种T细胞癌症的临床前研究中已经显示出有效性。Feng等人开发了CD5-IL15/IL15sushi CAR-T细胞，这些细胞足以在几周内消除中枢神经系统淋巴细胞，并且患者只经历了短暂的T细胞发育不良事件。这些结果表明，这可能是T细胞恶性肿瘤的安全有效治疗方法，特别是那些涉及中枢神经系统的癌症。表皮生长因子受体（EGFR）在三阴性乳腺癌（TNBC）中高度表达，可能是相关的免疫治疗靶标；针对EGFR的CAR-T细胞在体内外对TNBC显示出强大且特异性的抗肿瘤活性。另一项研究表明，第二代针对EGFR的CAR-T细胞在小鼠中有效地根除了TNBC脑转移并提高了它们的生存率，进一步突出了EGFR作为TNBC治疗的有希望的靶标。单靶点CAR-T细胞通常会遇到诸如抗原逃逸和克隆阴性复发等问题。针对两个或更多肿瘤相关分子的靶向不仅可以防止肿瘤细胞的免疫逃逸，还可以克服实体瘤中的抗原异质性。针对CD19和CD22的双价CD19/CD22-4-1BB CAR-T细胞在20名R/R B-ALL患者的I期剂量递增试验中显示出60%的CR率和80%的骨髓CR率 双特异性CAR-T细胞，靶向BCMA和CD38，在临床试验中显示出87.5%的响应率和81.3%的严格完全缓解率，复发率低且CRS可控。田等人开发了一种BiCisCAR-T细胞系，同时靶向GPC2和CD276，能够通过靶向多种肿瘤相关抗原（TAAs）和实体肿瘤中的抗原异质性来克服神经母细胞瘤中的神经抗原异质性。戴等人表明，CD5/CD7双特异性CAR-T细胞在体外展现出良好的肿瘤杀伤能力和在持续抗原刺激下的增殖。此外，串联双靶向CAR比并行双靶向CAR在活性和防止肿瘤逃逸方面更有效（见图2）。 3.3 新的CAR设计 自杀基因切换可以消除体内的CAR-T细胞并防止潜在的危及生命的不良事件。基因组编辑技术是推动CAR-T细胞治疗进展的重要驱动力。诱导型半胱氨酸蛋白酶9（iC9）是一种自杀基因，可被一种惰性小生物分子AP1903激活。在CAR构建设计中包含iC9可以作为一个有效的安全开关来控制恶性CAR+ B细胞。布尔逻辑门控开关是数学运算符“如果/那么”，“和”，“或”和“非”。在CAR-T细胞设计中使用逻辑门控开关可以进一步控制它们的激活，提高细胞杀伤的特异性，并减少毒性副作用。针对癌胚抗原和间皮素的逻辑门控CAR-T细胞显示出对同时表达两种抗原的肿瘤细胞的特异性毒性，而不会影响单一抗原阳性肿瘤细胞的生长。 图2. CAR-T领域的发展方向（A）B细胞白血病/淋巴瘤、T细胞白血病/淋巴瘤、AML、HL、MM和实体瘤的CAR-T细胞治疗的新靶标；（B）利用自杀或逻辑门控开关改进CAR-T细胞设计，提高其安全性和可控性；（C）CAR-T细胞与免疫检查点抑制剂、溶瘤病毒或放疗的联合应用；（D）下一代CAR-T细胞，包括通用CAR-T、CAR-NK、CAR-MΦ和CAR-γδ T。AML = 急性髓系白血病，CAR = 嵌合抗原受体，CAR-MΦ = CAR巨噬细胞，HL = 霍奇金淋巴瘤，MM = 多发性骨髓瘤，NK = 自然杀伤细胞，UCAR-T = 通用CAR-T。 3.4 下一代CAR  3.4.1 通用CAR-T  自体CAR-T细胞生产成本高且生产周期长，患者淋巴细胞数量少且功能差；来自健康供体的通用CAR-T（UCAR-T）细胞似乎克服了这些限制，但可能引发移植物抗宿主病（GVHD），并且它们的持久性会被宿主免疫系统干扰。多重基因组CRISPR/Cas9编辑的UCAR-T细胞在体外和动物模型中展现出强大的抗肿瘤活性，与非基因编辑CAR-T细胞相似。CRISPR/Cas9设计的通用CD19/CD22 CAR-T细胞展现出可控的安全特性和卓越的无血细胞减少活性。通用双靶标CAR-T细胞治疗可能为R/R ALL患者提供替代治疗。通过TALEN介导的基因编辑产生的产品可以避免自然杀伤细胞和异体反应T细胞的攻击，并在体外和体内在NK细胞中延长它们的持久性和抗肿瘤活性。 3.4.2 其他可替代细胞  由于以下因素——它们的天然杀伤功能；丰富的来源，如NK92细胞系、脐带血、外周血和诱导多能干细胞；以及不引发GVHD——CAR-NK细胞目前正在被探索。刘等人在11名复发或难治性CD19阳性癌症患者中使用抗CD19 CAR-NK细胞，显示出73%的缓解率和64%的CR率。对于不适合单细胞分离的患者，使用原始人类造血干/祖细胞在体外产生功能性CAR巨噬细胞（CAR-MΦs），具有与CAR-T细胞相同的靶向激活。陈等人随后使用靶向胶质瘤干细胞的CAR-MΦs的局部注射有效地消除肿瘤细胞并抑制术后胶质母细胞瘤复发。γδ T细胞缺乏同种型，可以安全地用于半相合移植，并介导天然的抗肿瘤反应。Rozenbaum等人发现，γδ T细胞的CAR转导效率与标准CAR-T细胞在生产中一样高；在抗肿瘤效果方面，CD19导向的γδ T细胞对CD19阳性和阴性的白血病细胞都有效。 3.5 改变CAR-T细胞的给药计划 3.5.1 优化药物递送  增加单次或多次CAR-T细胞输注的作用持续时间是提高它们持久性的有效方法。李等人开发了一种具有可回收能力的CAR（CARKR-T），并显示出显著抑制CAR下调和增强内化CAR循环至细胞表面，促进长期杀伤能力。CD19 CAR-T细胞治疗在R/R B细胞恶性肿瘤中非常有效，但大多数情况下未能诱导持久反应。第二次输注（CART2）可能会改善结果。与第一次输注相比，第二次输注观察到更高的总响应率、更长的PFS和更低的严重毒性发生率。在R/R B-ALL患者中第二次CAR-T细胞输注对一些患者有益，而在其他患者中，CAR-T细胞扩张减少和抗原下调阻碍了对CART2的有力反应。静脉注射是CAR-T细胞给药的主要方式；然而，这对于治疗实体瘤并不理想。鞘内注射CAR-T细胞可以局部治疗复发性髓母细胞瘤和脑室内脑膜瘤，绕过血脑屏障，在小鼠模型中显示出优越的抗肿瘤效果。Grosskopf等人制造了一种可注射的水凝胶，控制了CAR-T细胞和刺激性细胞因子的共同递送，有效地消除了肿瘤，达到了100%的响应率；它没有引起不良的炎症反应，并且在几周内完全在体内降解。 3.5.2 联合疗法  CAR-T联合疗法将CAR-T细胞治疗与其他选项结合起来，如放疗、化疗、免疫检查点抑制剂和溶瘤病毒，这可以提高其安全性和有效性。放疗和化疗是传统的肿瘤治疗方式。周等人发现，将针对EGFR的CAR-T细胞与放疗相结合，在免疫缺陷的原位TNBC小鼠中有效地增强了免疫功能和抗肿瘤效果。有效的化疗减少改善了高肿瘤负荷的R/R DLBCL患者CAR-T细胞治疗的短期ORR和长期OS，使结果与低肿瘤负荷患者相当。PD-1抑制T细胞在TME中的功能通过PD-1抗体检查点阻断、细胞内PD-1 shRNA阻断或PD-1显性负性受体恢复了CD28 CAR-T细胞的效应功能。同时下调3个抑制性免疫检查点受体——PD-1、Tim-3和Lag-3——在CAR-T细胞中增强了肿瘤浸润和抑制肿瘤生长。地西他滨处理的CAR-T细胞在体内外都表现出增强的抗肿瘤活性和更持久的抗肿瘤潜力。布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）是B细胞受体依赖性细胞生长的关键介导因子，在多种B细胞恶性肿瘤中上调。BTK抑制剂（BTKis）在治疗MCL和慢性淋巴细胞性白血病中非常有效。伊布替尼是市场上第一种BKTi产品，与抗CD19 CAR-T细胞联合使用增强了疗效。同时给予CAR-T细胞治疗和伊布替尼导致了比单独CAR-T细胞治疗更高的ORR（83%对56%）。在小鼠实验中，伊布替尼与CD19 CAR-T细胞联合使用有协同效应；小鼠中的CAR-T细胞显著扩张，扩张比例高于单独CAR-T细胞治疗，显著减少了肿瘤负荷。溶瘤病毒疗法是一种新型的癌症治疗方式，使用裂解病毒直接攻击或在感染的癌细胞中表达病毒抗原，导致细胞毒性T细胞的识别和破坏。Evgin等人将CAR-T细胞装载了囊泡性口炎或真兽病毒，用于治疗小鼠模型中的实体瘤。系统递送大大增强了CAR-T细胞治疗黑色素瘤和胶质瘤肿瘤的疗效，并提高了生存率。 4. 结论  总之，CAR-T细胞治疗在血液系统恶性肿瘤中的成功已有充分记录，其在其他疾病领域的潜力也很明显。然而，与治疗相关的毒性反应和复发所带来的挑战需要进一步研究。旨在识别新靶标、改进或设计新的CAR结构、改变给药方法以及探索联合疗法的策略有潜力提高CAR-T细胞的安全性和有效性，同时减少毒性和降低复发率。此外，正在开展对其他免疫细胞疗法的调查，如CAR-NK细胞。未来有望开发出可定制的CAR细胞疗法，用于精确和个性化治疗一系列疾病。 识别微信二维码，添加细胞基因研究圈小编 请注明：姓名+研究方向！ 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(wibplib@126.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

近年来，CAR-T免疫疗法除了被用来治疗急性白血病和非霍奇金淋巴瘤之外，经改进后，也被用来治疗实体瘤、自身免疫疾病、HIV感染和心脏病等疾病，具有更广阔的应用空间。基于此，针对CAR-T 细胞疗法取得的最新进展，小编进行一番盘点，以飨读者。1. Science子刊：新型CD229 CAR-T细胞疗法有望更安全地治疗多发性骨髓瘤doi:10.1126/scitranslmed.add7900在一项新的研究中，来自美国马里兰大学医学院的研究人员设计出了一种新型 CAR-T 细胞疗法，在临床前研究中，这种细胞疗法能选择性地攻击癌细胞，同时保护健康细胞，从而降低了这种创新癌症疗法产生毒副作用的可能性。这些CAR-T 细胞专为攻击多发性骨髓瘤而设计，多发性骨髓瘤是一种存在于人体骨髓中的浆细胞癌症。相关研究结果发表在2023年7月19日的Science Translational Medicine期刊上，论文标题为“Systematic single amino acid affinity tuning of CD229 CAR T cells retains efficacy against multiple myeloma and eliminates on-target off-tumor toxicity”。CD229在CAR-T细胞中的表达。在CAR-T细胞生产第9天，通过流式细胞术检测CD229在CAR-T细胞产品表面上的表达，以及来自两名健康人类供体的未刺激T细胞的表达。图片来自Science Translational Medicine, 2023, doi:10.1126/scitranslmed.add7900。论文通讯作者、马里兰大学医学院微生物学与免疫学助理教授Tim Luetkens博士说，“我们在临床前研究中清楚地看到，这种新疗法能有效地消灭肿瘤细胞，而不会攻击健康细胞。我们非常看好它作为一种更安全的新型癌症疗法的潜力。”在此前发表在Nature Communications期刊上的一项研究中，Luetkens 博士、马里兰大学医学院医学教授 Djordje Atanackovic 博士和威斯康星医学院助理教授 Sabarinath Radhakrishnan 博士开发了一种新的 CAR T 细胞疗法，它靶向攻击的蛋白与目前的 CAR-T 细胞疗法不同（Nature Communications, 2020, doi:10.1038/s41467-020-14619-z）。他们决定把重点放在一种名为 CD229 的蛋白上，这种蛋白在多发性骨髓瘤癌细胞中非常普遍，而在健康细胞中则不常见。然而，他们证实，CD229 CAR-T 细胞仍然会攻击一些健康的血细胞，这是一种潜在的严重毒副作用。在这项新的研究中，Luetkens 博士和他的同事们旨在利用一种称为亲和力调整（affinity tuning）的复杂方法，设计出只攻击恶性肿瘤细胞而不攻击健康细胞的 CD229 CAR-T 细胞。他们交换了单个氨基酸，测试了305种不同的变体，煞费苦心地确定了最佳的CAR-T细胞序列，以达到最佳效果：容易识别癌细胞，同时忽略健康细胞。最初，这些作者失望地发现，他们设计出的优化 CAR受体显然会导致 CAR-T 细胞生长得更慢。从理论上讲，这种缓慢的生长可能会导致这种细胞疗法对患者的疗效不佳。他们采用了斯坦福大学研究人员之前开发的一种新方法（Nature, 2019, doi:10.1038/s41586-019-1805-z），从而克服了这一障碍。2. Cell：一种疫苗增强的工程化T细胞反应或能帮助清除人类的实体瘤doi:10.1016/j.cell.2023.06.002利用工程化的T细胞来破坏癌细胞目前在治疗某些类型的癌症上已经表现出了成功，比如白血病和淋巴瘤，然而，其对于实体瘤的治疗效果并不理想。而缺乏成功的原因之一在于T细胞仅能靶向作用一种抗原（肿瘤上发现的靶向性蛋白），如果某些肿瘤细胞不表达这种抗原的话，其就会逃避T细胞的攻击。近日，一篇发表在国际杂志Cell上题为“Vaccine-boosted CAR T crosstalk with host immunity to reject tumors with antigen heterogeneity”的研究报告中，来自MIT等机构的科学家们通过研究发现了一种克服这一障碍的方法，其能利用一种疫苗来增强名为嵌合抗原受体（CAR）T细胞的工程化T细胞的反应，同时还能帮助免疫系统产生新的T细胞从而靶向作用其它的肿瘤抗原；在对小鼠进行的研究中，研究人员发现，这种方法或许会使得肿瘤更有可能被根除。一种疫苗增强的工程化T细胞反应或能帮助清除人类的实体瘤。图片来源：Cell (2023). DOI:10.1016/j.cell.2023.06.002研究者Darrell Irvine教授说道，这种疫苗的增强似乎能驱动一种名为抗原扩散（antigen spreading）的过程，在该过程中，机体自身的免疫系统就能与工程化的CAR T细胞合作从而拒绝那些并非所有细胞都表达被CAR T细胞所靶向作用的抗原的肿瘤。目前FDA批准了多种T细胞疗法来治疗血液癌症，这些疗法都是基于CAR-T细胞，其能被工程化改造来展示受体从而识别癌细胞上存在的特殊抗原。为了尝试将这种疗法应用到胶质母细胞瘤（一类脑癌）中，研究人员设计了CAR-T细胞来靶向作用EGFR受体的一个突变版本，然而，并非所有的胶质母细胞瘤细胞都会表达这种抗原，而且当其被CAR-T细胞攻击时，有些胶质母细胞瘤细胞就会通过停止靶向性抗原的产生来产生反应。在2019年的一项研究中，研究者Irvine及其同事通过在使用工程化T细胞后不久将疫苗直接输注到小鼠体内来增强CAR-T细胞抵御胶质母细胞瘤的疗效，这种携带被CAR-T细胞靶向作用的相同抗原的疫苗就会被淋巴结中的免疫细胞所摄取，而CAR-T细胞则会在淋巴结中接触到它。这项研究中，研究人员发现，这种疫苗的提升不仅能帮助工程化的CAR-T细胞攻击肿瘤，还会产生另一种意想不到的效应，其或许还有助于产生靶向作用其它肿瘤抗原的宿主T细胞。这种被称之为“抗原扩散”（antigen spreading）的现象是可取的，因为其能产生一类特殊的T细胞群，当其在一起发挥作用时就能完全根除肿瘤病预防肿瘤再生。研究者Irvine表示，这或许正是能帮助你处理实体瘤中抗原异质性的东西，因为如果让宿主T细胞来攻击其它抗原，其就能够进来并杀灭CAR-T细胞无法杀灭的肿瘤细胞。3. Lancet：临床试验表明CAR- T细胞疗法liso-cel有望治疗难复发性的慢性淋巴细胞白血病和小淋巴细胞淋巴瘤doi:10.1016/S0140-6736(23)01052-8一项新的临床试验表明单次输注嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法可诱导复发或难治性慢性淋巴细胞白血病（CLL）或小淋巴细胞淋巴瘤（SLL）患者完全缓解。相关研究结果近期发表在Lancet期刊上，论文标题为“Lisocabtagene maraleucel in chronic lymphocytic leukaemia and small lymphocytic lymphoma (TRANSCEND CLL 004): a multicentre, open-label, single-arm, phase 1–2 study”。论文共同作者、美国西北大学医学教授Shuo Ma博士说，“CAR-T细胞疗法利用患者自身的免疫细胞来对抗癌症。这种新型细胞免疫疗法是治疗复发性B细胞淋巴瘤的一大进步。我们在这项临床试验中报告了CAR-T细胞疗法Liso-cel治疗CLL/SLL的首个多中心研究。”在这项新的临床研究中，这些作者旨在评估CAR- T细胞疗法---特别是lisocabtagene maraleucel（liso-cel）---的疗效和安全性，该疗法用于治疗117例复发或难治性CLL或SLL成人患者，这些患者此前平均接受过5种疗法。CAR-T细胞疗法利用经过基因增强的T细胞更有效地定位和消灭癌细胞。在这项临床试验中，所有患者都接受了两种剂量水平之一的liso-cel一次性静脉输注。Ma说，在49名接受高剂量治疗的双重难治性CLL/SLL患者中，总反应率为47%，完全缓解率为18%，与0～5%的历史反应率相比，明显更高。这些作者说，缓解时间约为一个月，而且在获得完全缓解的患者中，没有人在20个月的随访中复发，这表明这种缓解具有持久性。4. Lancet Neurol：小型临床试验表明一种改良的CAR-T细胞有望治疗重症肌无力doi:10.1016/S1474-4422(23)00194-1来自一项小规模临床试验的证据表明，一种称为CAR-T细胞的先进血癌免疫疗法的改进形式经调整后可能能够用于治疗重症肌无力（myasthenia gravis），即一种神经系统的自身免疫性疾病。这项临床试验使用的改良型CAR-T疗法提供了更持久地减少重症肌无力症状的潜力，而且耐受性良好，没有明显的不良反应。相关研究结果发表在2023年7月的Lancet Neurology期刊上，论文标题为“Safety and clinical activity of autologous RNA chimeric antigen receptor T-cell therapy in myasthenia gravis (MG-001): a prospective, multicentre, open-label, non-randomised phase 1b/2a study”。美国国家神经病与中风研究所小型企业项目主任Emily Caporello博士说，“重新利用CAR-T这样的突破性疗法来治疗一种神经系统疾病，显示了免疫疗法在治疗方案有限甚至没有的情况下的多功能性。”在这项新的研究中，14名全身性重症肌无力患者接受了不同剂量的称为Descartes-08的改良型CAR-T细胞疗法，这种细胞疗法靶向负责产生导致重症肌无力的抗体的细胞。理想的剂量被确定为每周一次，为期六周。关于这种细胞疗法有效性的早期数据是有希望的，但还需要更多的临床研究来评估该疗法的疗效。接受Descartes-08治疗的三名患者显示他们的症状完全或接近完全消除，这种情形在治疗后持续了六个月。另外两名患者不再需要接受目前针对一些严重的重症肌无力病例的长期静脉注射免疫球蛋白。5.NEJM：新研究表明经过碱基编辑的供者CAR-T细胞有望治疗T细胞白血病doi:10.1056/NEJMoa2300709作为英国伦敦大学学院（UCL）和大奥蒙德街儿童医院（GOSH）之间“从实验室到临床”合作的一部分，三名患有复发T细胞白血病的年轻患者如今接受了经过碱基编辑的CAR-T细胞的治疗。这项初步的临床试验的数据表明供者CAR-T细胞如何利用前沿的基因编辑技术进行基因改造从而改变它们的DNA代码中的单个碱基，以便它们能够对抗白血病。相关研究结果于2023年6月14日在线发表在NEJM期刊上，论文标题为“Base-Edited CAR7 T Cells for Relapsed T-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia”。作为这三名患者中的一员，来自英国莱斯特市的13岁的Alyssa是去年世界上第一个因患有T细胞急性淋巴细胞白血病（T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL）而参与这项临床试验的人。T-ALL是一种白细胞癌症，通常用化疗来治疗，但如果它复发，就很难清除。在接受这种经过碱基编辑的CAR-T细胞治疗后的四周内，Alyssa的白血病就检测不出来了，她接着成功地进行了骨髓移植，在将近一年后，她仍然健康在家。第二位参加这项临床试验的青少年在类似的时间段内清除了体内的白血病，如今他们在接受这种经过碱基编辑的CAR-T细胞移植后正在家里康复。遗憾的是，虽然第三名参加这项临床试验的孩子对这种经过碱基编辑的CAR-T细胞疗法有反应，但其病程因严重感染而变得复杂，这名孩子的家人与临床团队达成一致，转为缓和照顾（palliative care）。6.NOA：靶向HER2的CAR-T细胞有望治疗DIPG脑瘤doi:10.1093/noajnl/vdad024弥漫内生型脑桥胶质瘤（Diffuse Intrinsic Pontine Glioma, DIPG）通常发生在5至7岁的儿童身上，是一种侵袭性的脑瘤，每年影响澳大利亚的20名儿童。这种快速生长的肿瘤形成于儿童大脑中负责呼吸、吞咽和运动等重要功能的部分，这意味着它无法通过手术切除。被诊断为DIPG的儿童不可能在诊断后存活一年，目前没有治疗这种毁灭性疾病的方法。图片来自Neuro-Oncology Advances, 2023, doi:10.1093/noajnl/vdad024。在一项新的研究中，来自澳大利亚沃尔特和伊丽莎-霍尔医学研究所（WEHI）等研究机构的研究人员发现，用一种创新的新型免疫疗法---CAR-T细胞疗法---来治疗DIPG是有希望的。他们指出CAR-T细胞疗法对DIPG肿瘤具有有效的靶向作用。相关研究结果于2023年5月4日发表在Neuro-Oncology Advances期刊上，论文标题为“HER2 chimeric antigen receptor T cell immunotherapy is an effective treatment for diffuse intrinsic pontine glioma”。在WEHI实验室负责人Misty Jenkins副教授的领导下，这些作者发现在临床前模型中，这些经过特别设计的CAR-T细胞能够进入大脑，并通过减少肿瘤负荷而产生抗癌效果。Jenkins说，“与放疗不同，放疗既能杀死癌细胞，也能杀死健康的脑组织，而CAR-T细胞疗法使用患者自身的免疫细胞，并对它们进行基因改造以识别和杀死肿瘤。CAR-T细胞提供了一种治愈的可能性，没有长期的副作用。这些经过基因修饰的CAR-T细胞作为一种‘活的药物’起作用，这意味着患者将在体内保留抗肿瘤反应的活记忆，如果肿瘤再次复发，也可能起到杀死肿瘤的作用。这些细胞可以完全消除肿瘤，并在未来持续存在于体内，这是CAR-T细胞疗法令人兴奋的地方，也是免疫疗法是精准医学未来的原因。”7.Nat Med：在1期临床试验中 CAR-自然杀伤性T细胞疗法或有望表现出潜在的治疗结局doi:10.1038/s41591-023-02363-yVα24突变的自然杀伤性T细胞（NKTs）具有一定的抗肿瘤特性，其能通过嵌合抗原受体（CARs）来增强；近日，一篇发表在国际杂志Nature Medicine上题为“Anti-GD2 CAR-NKT cells in relapsed or refractory neuroblastoma: updated phase 1 trial interim results”的研究报告中，来自贝勒医学院等机构的科学家们通过研究报告了首个人类1期临床试验的中期结果，该试验中，研究人员评估了一种遗传工程化的自然杀伤性T细胞（NKT）免疫疗法在治疗成神经细胞瘤（neuroblastoma）上的安全性、抗肿瘤活性和免疫特征，成神经细胞瘤是一种儿童肿瘤，其最常会发生在机体肾上腺部位，相关研究结果表明，这种疗法耐受性良好，且研究人员观察到了其能产生强大的抗肿瘤活性的早期证据。在1期临床试验中 CAR-自然杀伤性T细胞疗法或有望表现出潜在的治疗结局。图片来源：Nature Medicine (2023). DOI:10.1038/s41591-023-02363-y自然杀伤性T细胞能被修饰从而表达GD2特异性嵌合抗原受体（GD2 CAR），该受体能促使免疫细胞靶向作用成神经细胞瘤细胞表面的特殊分子以及白介素-15（IL-15），IL-15是一种能支持自然杀伤性T细胞生存的天然蛋白，在此前的研究中，研究人员报道了该试验中所招募的前三名儿童的中期研究结果。这篇研究中，研究人员描述了在对其它疗法耐受的12名处于4期复发性成神经细胞瘤患者机体中的研究结果，他们发现，该疗法在四个剂量的水平下对所有12名患者都是安全的，且关于剂量限制毒性上并没有相关报道，3名患者会对疗法表现出客观反映，包括一组完全的反应和两个部分反应。另外两名患者也表现出了具有抗肿瘤活性的重要证据，比如清除骨髓受累并减少转移性肿瘤的负担，但目前尚未达到部分反应标准。研究者Andras Heczey说道，我们对在几名患者机体中所观察到的抗肿瘤活性结果感到鼓舞，尤其是因为这项临床试验还处于剂量递增阶段。此前研究结果表明，自然杀伤性T细胞在临床前模型中能定位到肿瘤位点，这一试验在人类机体中也呢狗验证安置额观察性结果，此外，研究人员还发现较高的抗肿瘤活性和所输注的CAR-自然杀伤性T细胞在体内增殖之间的关联。Leonid Metelitsa说道，我们并不能总是预测书诸侯自然杀伤性T细胞扩张的程度，在这项研究中，我们发现，在临床前工作中所识别出的输注自然杀伤性T细胞所表达的CD62L生物标志物或许能预测更高的自然杀伤性T细胞在体内扩张以及患者机体更高的抗肿瘤活性。8. Molecular Therapy Nucleic Acids: 一种先进治疗药物慢病毒载体在CAR-T细胞中的应用doi:10.1016/j.omtn.2023.03.018基因疗法已经被证明是一种真正的替代疗法，可以用来治疗几种没有适当治疗的疾病。然而，一些基因治疗策略的治疗效果并不是最好的，因为传递不充分或缺乏对转基因的控制。在基因治疗药物中，随着6种CAR-T药物的批准，嵌合抗原受体(CAR)-T细胞已成为治疗血液病最有前途的药物之一。然而，目前的CAR-T细胞经常出现严重的副作用(有时会导致致命的后果)，而且它们对实体瘤的治疗并不有效。这两个限制都可以通过产生智能CAR-T细胞来部分解决，这些细胞可以在外部进行控制，以决定何时何地活跃，或者分泌有效的生物分子。LOPIs2 LV是一种通用的工具，可以产生表达不同转基因的无反式激活子诱导细胞系。图片来源：https://doi.org/10.1016/j.omtn.2023.03.018近日，来自格拉纳达大学的研究者们在Molecular Therapy Nucleic Acids杂志上发表了题为“Lentiviral vectors for inducible, transactivator-free advanced therapy medicinal products: Application to CAR-T cells”的文章，该研究描述了第一个无反式激活剂的、能够产生Dox诱导的ATMP的一体化系统。通过外用诱导剂控制转基因表达被认为是提高基因治疗方法安全性和有效性的有效策略。一般来说，可诱导的ON系统需要一个嵌合的转录因子(反式激活因子)，该因子被诱导剂激活，由于其毒性，这对临床翻译并不是最佳的。研究者之前成功构建了第一个一体化、无反式激活剂、多西环素(Dox)反应(Lent-on-Plus或LOP)的慢病毒载体(LV)，能够控制转基因在人类干细胞中的表达。在本研究中，研究者已经产生了新版本的LOP LV，并分析了它们在产生可诱导的高级治疗药物(ATMP)方面的适用性，特别是对原代人类T细胞的关注。研究者已经证明，与所分析的所有其他细胞类型相反，为了控制人类原代T细胞中的转基因表达，必须在LOP LV的30个末端重复序列中插入Is2绝缘体。重要的是，由LOPIs2 LV产生的可诱导原代T细胞对超低剂量的Dox有反应，与未转导的T细胞相比，在表型或功能上没有变化。通过产生可诱导的CAR-T细胞来验证LOPIs2系统，该细胞在Dox存在的情况下选择性地杀伤CD19+细胞。9.Sci Adv：科学家开发出新型CAR-T细胞疗法治疗人类骨转移性前列腺癌doi:10.1126/sciadv.adf0108前列腺癌经常会发生骨转移且是无法治愈的，近日，一篇发表在国际杂志Science Advances上题为“γδ-Enriched CAR-T cell therapy for bone metastatic castrate-resistant prostate cancer”的研究报告中，来自H. Lee Moffitt癌症研究中心等机构的科学家们通过研究有望开发出治疗前列腺癌骨转移的患者。文章中，研究者表示，嵌合抗原受体T细胞疗法（CAR-T细胞疗法）或许在前列腺癌骨转移的小鼠模型中作为一种有效的抗肿瘤方法。科学家开发出新型CAR-T细胞疗法治疗人类骨转移性前列腺癌。图片来源：Science Advances (2023). DOI:10.1126/sciadv.adf0108研究者Conor Lynch博士说道，骨转移的前列腺癌是一种无法治愈的疾病，其会通过极度的骨痛来明显影响患者的生存，诸如唑来膦酸盐（zoledronate）等双磷酸盐（Bisphosphonates）能减缓患者的问题并减少其病理性的骨折，但对于患者的生存影响不大；因此，研究人员就迫切需要开发出新型的治疗手段。文章中，研究人员想通过研究调查利用CAR-T细胞疗法治疗骨转移性前列腺癌的可能性，以及这种疗法的治疗效果是否能通过与唑来膦酸盐的结合而被增强；CAR-T细胞疗法是一种相对交心的癌症疗法，这种形式的细胞免疫疗法2017年首次获批用于治疗特定类型的血液癌症，对于这种疗法而言，研究人员首先从患者体内分离到其T细胞，对其进行遗传工程化修饰来靶向作用肿瘤特异性的标志物，随后T细胞会在培养物中进行扩增并重新输注回患者体内，在患者体内其就能靶向摧毁患者机体的肿瘤细胞了。研究者Abate-Daga指出，与传统的α/β T细胞相比，我们对这些细胞的研究相对较少，但其近些年来却吸引了很多生物技术部门的关注和极大兴趣。研究人员创造了对肿瘤生物标志物前列腺干细胞抗原（PSCA，prostate stem cell antigen）具有特异性的CAR-T细胞，这类抗原在骨转移性前列腺癌中会高度表达；研究者认为，CAR-T细胞能杀灭细胞培养物中的前列腺癌细胞，并能刺激增强免疫细胞活性的化学信使分子的产生。接下来研究人员开始对小鼠模型进行研究，结果发现，CAR-T细胞能明显减少肿瘤的尺寸并改善小鼠的生存且毒性非常有限；此外，利用唑来膦酸盐预先处理小鼠或能通过一种CAR非依赖性的机制来帮助激活CAR-T细胞，并能提高其识别和破坏肿瘤的能力；重要的是，除了能消除肿瘤外，这种疗法还能保护骨骼的健康。10.Nat Commun：T细胞研究的新发现或能帮助改善对人类实体瘤的治疗doi:10.1038/s41467-023-36160-5瞬时表达肿瘤靶向受体的工程化T细胞或能作为一种有吸引力的工程化T细胞疗法形式，因为其并不会引入插入突变或长期不良副作用的风险，然而，患者往往需要进行多轮治疗，而这往往增加了患者的不适和治疗费用。近日，一篇发表在国际杂志Nature Communications上题为“G9a/GLP inhibition during ex vivo lymphocyte expansion increases in vivo cytotoxicity of engineered T cells against hepatocellular carcinoma”的研究报告中，来自新加坡A*STAR研究所等机构的科学家们通过研究发现，在细胞治疗生产过程中，抑制G9a和GLP两种蛋白的功能后，免疫细胞或许就能更加有效地抵御癌症了，相关研究结果或有望帮助开发让癌症患者获益的新型创新性疗法，并能让研究人员更加接近开发出针对实体瘤的更为有效的靶向性疗法。T细胞研究的新发现或能帮助改善对人类实体瘤的治疗。图片来源：Nature Communications (2023). DOI:10.1038/s41467-023-36160-5实体瘤是全球范围为内癌症相关死亡的主要原因，诸如化疗、放疗和外科手术等传统疗法是可行的，但其在治疗人类实体瘤上的疗效并不同，尤其是对于癌症晚期患者；T细胞疗法就在治疗诸如血液癌症等液体肿瘤方面非常成功，但在治疗诸如乳腺癌、肝癌或脑癌方面却并未观察到同样的治疗效果。作为治疗的一部分，工程化的T细胞通常会被引入到患者的血液中，其与液体肿瘤一样处于相同的环境中，这或许就能促使其定位并更加容易地靶向作用液体肿瘤，然而，在实体瘤存在的情况下，工程化的T细胞就会面临物理和分子障碍，比如在体内通过致密组织结构来进行迁移，且遇到可能负面影响其功能的其它细胞或分子。文章中，研究人员通过联合研究揭示了一种能改善T细胞疗效的新方法，T细胞是一种能识别并消除癌细胞的特殊免疫细胞。研究者Andrea Pavesi表示，我们对特殊的表观遗传学药物进行了全面的分析，这些药物能影响工程化T细胞在增加机体抗肿瘤活性上的疗效。我们使用了2D和新型3D分析方法来模拟T细胞所遭遇的物理环境，从而发现并靶向作用人类机体中的癌细胞。在实验室所进行的细胞疗法的细胞扩增过程中，研究人员对免疫细胞施用了一种能靶向作用G9a和GLP蛋白的特殊药物，随后将这些药物洗掉，然后再将工程化的免疫细胞重新输注到患者体内并消除药物所产生的副作用，相关研究结果表明，这种药物或呢过帮助增加工程化免疫细胞的抗肿瘤功能，其会增加颗粒酶的产生，而颗粒酶是一种能帮助定位和消除目标肿瘤细胞的蛋白质。研究人员利用其对免疫细胞的分析能力以及杜克大学-新加坡国立大学的研究人员提供的患者样本进行研究，相关研究结果或能利用成熟的细胞系和患者机体所衍生的免疫细胞来进行验证，从而确认阻断G9a和GLP活性在改善T细胞疗法治疗效率方面的功效。会议推荐会议详情会议名称：2023（第14届）细胞与基因治疗国际研讨会暨抗体工程与创新免疫治疗技术论坛暨2023细胞免疫治疗专业委员会年会主办单位：生物谷、梅斯医学、同济大学附属同济医院、南京可缘大会时间：9月22-23日大会地点：上海 大会规模：1500人2010年至今，生物谷联合各合作单位已经顺利召开了13届细胞与基因治疗国际研讨会，与全球致力于细胞治疗行业同仁们一同成长沉淀，在提供行业信息交流平台的同时，也为基础研究提供了技术/产品等产业化的孵化平台。基于此，本届会议将继续以转化医学为切入点，以基础研究与临床应用相结合，针对细胞治疗的临床前沿研究、临床监管、治疗规范、细胞治疗安全性，免疫细胞新型疗法、实体瘤治疗、干细胞与癌症、抗体药物、核酸药物、基因编辑、肿瘤免疫治疗等热门议题进行讨论，诚邀国内外产学研医专家共聚，共绘产业发展新蓝图！长按识别二维码立即报名参会

摘要：嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法是癌症治疗中的重大突破，它使得血液瘤治疗，尤其是复发/难治性（R/R）B细胞恶性肿瘤，得到了前所未有的成功。目前，CD19和BCMA是CAR-T疗法中最常见的靶点，当然，许多新兴的靶点仍在探索中。但是，CAR-T治疗所引发的不良反应可能很严重甚至会危及生命，比如细胞因子风暴（CRS）、CAR-T细胞相关的脑病综合征（CRES）、感染、血细胞减少、以及CRS相关凝血障碍。另外，由于抗原逃逸、CAR-T细胞短暂的持久性和免疫抑制的肿瘤微环境，相当一部分患者在接受CAR-T治疗后复发。因此，在这篇综述中，我们着重关注CAR-T细胞治疗在血液瘤中的进展和挑战，比如更具吸引力的治疗靶点、CAR-T相关毒性以及CAR-T治疗的耐药性，并提供一些实用的建议。背景一般来说，血液瘤的治疗主要包括化疗、放疗以及造血干细胞移植（HSCT）。但是随着肿瘤免疫学的进展，免疫靶向疗法为肿瘤治疗开辟了新路径，比如单克隆抗体、双特异性抗体、抗体偶联药物和嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法。特别是CAR-T细胞治疗已经使血液瘤的治疗方式发生了变革，并且近年来在复发/难治性（R/R）B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）、非霍奇金淋巴瘤（NHL）和多发性骨髓瘤（MM）中取得了前所未有的反响。目前已有六款用于治疗R/R B细胞恶性肿瘤的CAR-T细胞产品获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，包括包括tisagenleckeel（Kymriah；诺华）、axicabtagene cilloucel（Yescarta；吉利德）、brexucabtagene autoleucel（Tecartus；吉利德）、lisocabtagene maraleucel（Breyanzi；百时美施贵宝）、idecabtagene vicleucel（Abecma；百时美施贵宝和蓝鸟生物）和西达基奥伦赛（Carvykti；传奇和杨森），它们靶向最常见的靶抗原CD19和B细胞成熟抗原（BCMA）（表1里程碑式临床试验）。另外，还有大量的新抗原等待开发。但是，尽管CAR-T治疗在B细胞恶性肿瘤中有了显著的突破，与CAR-T细胞治疗相关的严重毒性事件可能会使其疗效大打折扣，甚至可能危及生命，比如多器官功能障碍、败血症和弥漫性血管内凝血（DIC）。细胞因子释放综合征（CRS）是最常见的并发症，这是由于CAR-T细胞和内源性免疫细胞，过度激活而产生的一种全身的炎症反应，其中内源性免疫细胞包括巨噬细胞和树突状细胞。其表现形式多种多样，与感染症状相似。此外，严重CRS与CAR-T细胞相关脑病综合征（CRES）和凝血障碍的风险增加相关。因此，阐明其潜在机制有助于预防和管理这些不良事件。此外，CAR T细胞治疗后的耐药性也不容忽视。因此，本综述旨在介绍CAR-T细胞治疗的进展和挑战，如有吸引力的治疗靶点、与CAR-T细胞疗法相关的毒性和CAR-T细胞治疗的耐药性，并探讨其潜在机制和有效的治疗策略，以促进CAR-T细胞治疗的应用和管理。CAR-T细胞治疗总览为了生产CAR-T细胞，需要从病人或捐赠者的外周血中收集T细胞，然后通过体外基因工程技术，在T细胞上表达嵌合抗原受体（CAR）。因此，CAR-T细胞识别的是肿瘤细胞表面的特异性抗原，不需要抗原加工和递呈，这表明CAR-T细胞的抗原识别不依赖于主要组织相容性复合体（MHC）限制性。经过基因修饰后，它们在体外进行广泛的扩增。然后，患者接受淋巴清除化疗，为这些过继性CAR-T细胞腾出空间，随后这些基因工程改造的CAR-T细胞回输到患者体内。这些CAR-T细胞特异性识别靶抗原并快速增殖，从而在体内发挥抗肿瘤作用。CAR结构由胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域组成。胞外结构域是一段单链可变片段（scFv），能够特异性地识别肿瘤表面抗原。通常，肿瘤抗原分类为肿瘤相关抗原（TAAs）和肿瘤特异性抗原（TSAs），它们大多会选择TAA。一旦单链抗体识别出TAA，CAR-T细胞就会被激活并将激活信号传输到胞内结构域。第一代CAR结构包含一个抗原识别结构域scFv和CD3ζ激活结构域。由于缺乏共刺激信号，它们的增殖能力和抗肿瘤作用有限。第二代CAR结构增加了一种共刺激因子结构域，如CD28、4-1BB、OX40或ICOS，使自身具有更好的增殖能力并且释放更多的细胞因子。目前，这些商业化的CAR-T细胞产品都采用的第二代CAR结构。第三代CAR结构包含两种不同的共刺激分子，如CD28和4-1BB。第四代CAR结构，也称为TRUCK或装甲CAR，增加了额外的修饰，来分泌细胞因子或表达自杀基因，如IL-7、IL-12、IL-15、IL-21和iCaspase-9（图1）。第四代CAR-T细胞通过激活内源性免疫反应可能更有效地清除肿瘤细胞。然而，第四代CAR-T细胞的特性在很大程度上是未知的。此外，2020年美国血液学学会（ASH）年会宣布了两项关于FasT CAR-T细胞的研究，包括治疗B-ALL（急性B淋巴细胞白血病）患者的CD19-CD22 FasT双靶点CAR-T细胞（GC022F）和治疗R/R MM（复发难治性多发性骨髓瘤）患者的BCMA-CD19 FasT双靶点CAR-T细胞（GC012F）。这些FasT CAR-T产品可以在24至36小时内完成生产，在临床前研究中显示出卓越的疗效，这表明它们可能更适合病程快速进展的B细胞恶性肿瘤。表1 美国食品药品监督管理局批准的CAR-T细胞产品的里程碑式临床试验目前，所有商业化的CAR-T细胞产品都是使用自体T淋巴细胞制造的，但制造成本高、制造周期长、以及经过多线化疗后病人体内淋巴细胞数量和功能的减少限制了它们的进一步应用。然而，来自健康供体的通用CAR-T（UCAR-T）细胞似乎能够克服这些限制。UCAR-T细胞的大规模生产使其成为“现成”产品，这可以降低制造成本并增加其可及性。不幸的是，这些同种异体的UCAR-T细胞可能会诱导移植物抗宿主病（GVHD）（14）。此外，宿主免疫系统会排斥这些供体来源的UCAR-T细胞并损害它们的持久性。另外，由于NK细胞具有优异的天然杀伤功能及其丰富的来源，如NK92细胞系、脐带血、外周血和诱导多能干细胞，以及其不会诱导GVHD反应，CAR-NK细胞目前正在探索中。图1 四代CAR构造CAR-T细胞治疗血液系统恶性肿瘤的潜在靶点目前，CD19和BCMA是CAR-T细胞治疗中最常见的靶点。尽管抗CD19 CAR-T细胞和抗BCMA CAR-T细胞在治疗B细胞恶性肿瘤中取得了显著的疗效，但CAR-T细胞治疗后复发的情况经常出现。另外，由于急性髓系白血病（AML）的抗原异质性，以及霍奇金淋巴瘤（HL）和T细胞恶性肿瘤中CD19缺乏表达，许多潜在靶点正在研究中（图2）。CAR-T细胞治疗B细胞淋巴细胞白血病/淋巴瘤的靶点CD19是B细胞恶性肿瘤中最重要的靶抗原之一，包括B-ALL和NHL。近年来，抗CD19 CAR-T细胞疗法在R/R B-ALL和NHL患者中取得了快速而持久的疗效，并显著改变了B细胞恶性肿瘤的治疗前景。到目前为止，四种抗CD19 CAR-T细胞产品已被美国食品药品监督管理局批准用于治疗R/R B-ALL和NHL。尽管抗CD19 CAR-T治疗的临床效果显著，但经常观察到CD19抗原丢失。因此，治疗R/R BALL和NHL的CAR-T细胞疗法的备选靶点已经在开发中。CD20在90%以上的B细胞淋巴瘤中过表达，并被确定为CD20阳性B细胞淋巴瘤的一个潜在靶点，并且过去几年中，抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗在治疗NHL显示出优异的疗效。在一项早期临床试验中，DLBCL患者使用抗CD20 CAR-T细胞治疗的总体响应率（ORR）为86%。在随后的1期和2期试验中，17名R/R NHL患者接受了抗CD20 CAR-T细胞治疗，54.5%的患者实现了完全缓解（CR），12名患者仍处于缓解状态，中位随访时间为20个月。为了防止抗原逃逸，研究了抗CD19和抗CD20 CAR-T细胞联合治疗R/R DLBCL，并证明这种联合治疗是安全可行的。CD22在大多数B细胞恶性肿瘤中高表达，包括B-ALL和DLBCL。特别是，它在正常B细胞上限制性表达，而在造血干细胞上不表达，因此它是R/R B-ALL和DLBCL中CAR-T细胞治疗的理想靶点。在几项临床试验中，抗CD22 CAR-T细胞疗法在既往接受过抗CD19 CAR-T细胞治疗失败的R/R B-ALL和R/R DLBCL患者中显示出优异的疗效。此外，人源化抗CD22 CAR-T细胞对低CD22表达的白血病细胞表现出强大的活性。图2 血液系统恶性肿瘤的潜在治疗靶点CAR-T细胞治疗T细胞淋巴细胞白血病/淋巴瘤的靶点R/R T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）和T细胞淋巴瘤患者往往预后不佳。与抗CD19 CAR-T细胞疗法在B细胞恶性肿瘤中的卓越临床结果相比，CAR-T细胞治疗在T细胞恶性肿瘤的疗效和安全性在很大程度上是未知的并且尚在研究中。CD7在95%的T-ALL患者中高表达，是治疗TALL的理想靶点。在一项开放标签和单臂临床试验中，2名R/R TALL患者接受同种异体抗CD7 CAR-T细胞治疗。其中一名患者病情缓解超过1年，而另一名患者在输注CAR-T细胞后48天复发。在另一项I期临床试验中，20名R/R T-ALL患者接受了供体来源的抗CD7 CAR-T细胞输注，90%的患者获得了完全缓解。此外，一项案例研究报告称，一名11岁的T-ALL患者采用自体抗CD7 CAR-T细胞治疗，他在第17天病情缓解，随后接受了HSCT。CD5在大约85%的T细胞恶性肿瘤中表达，例如T细胞淋巴细胞淋巴瘤（T-LBL）和外周T细胞淋巴瘤（PTCL）。最近的一项研究表明，抗CD5 CAR-T细胞能有效地消除了恶性T细胞。在一项I期临床试验中，一名患有中枢神经系统（CNS）浸润的难治性T-LBL患者接受了抗CD5 CAR-T细胞治疗，并在4周内获得了完全缓解。此外，在临床前研究中，抗CD4 CAR-T细胞对T细胞恶性肿瘤显示出优越的活性但CD4、CD5和CD7这三个靶点都在正常T细胞上表达，因此靶向它们可能导致正常T细胞的清除和CAR-T细胞的自相残杀。恶性T细胞表达T细胞受体β链恒定结构域1（TRBC1），因此抗TRBC1 CAR-T细胞能够选择性地清除TRBC1阳性的恶性T细胞。重要的是，它可以保留体内大多数正常T细胞。CD99在新诊断的T-ALL患者中高表达，它代表了TALL的一个新靶点。此外，趋化因子受体CCR9在70%以上的T-ALL患者中表达，并且仅在不到5%的正常T细胞中表达。此外，它还与多药耐药性和不良预后有关。因此，它是CCR9阳性T-ALL的理想靶点。在临床前研究中，抗CCR9 CAR-T细胞表现出强大的抗白血病活性，并能阻止CAR-T细胞的自相残杀。此外，CD30在间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）中高表达，在PTCL亚型中可变表达。而且，CD30在正常T细胞上被限制性表达。因此，CD30是这些淋巴瘤的理想靶点，并且抗CD30抗体药物偶联物布伦妥昔单抗-韦多汀（BV）在新诊断的PTCL患者中显示出高响应率。鉴于BV出色的临床疗效，开发了抗CD30 CAR-T细胞，并在临床前研究中对CD30阳性淋巴瘤表现出显著的细胞毒性。霍奇金淋巴瘤CAR-T细胞治疗的靶点抗CD19 CAR-T细胞疗法在R/R B细胞NHL中显示出优异的结果。然而，HL缺乏CD19的表达。有趣的是，CD30在经典HL中普遍表达。目前，已经进行了几项临床试验来评估抗CD30 CAR-T细胞治疗R/R HL的安全性和有效性。在一项来自中国的临床试验中，6名HL患者中有5名在输注第三代抗CD30 CAR-T细胞后获得CR，3名患者的长期缓解持续了24个月以上。在另一项1/2期临床试验中，27名患者接受了抗CD30 CAR-T细胞治疗，67%的患者在6周内达到CR，但63%的患者经历了疾病进展，中位随访时间为9.5个月。此外，抗CD30 CAR-T细胞治疗后，HL中CD30的表达下调。CAR-T细胞治疗急性髓细胞白血病的靶点AML是最常见的成人急性白血病。不幸的是，由于抗原的异质性，CAR-T细胞治疗AML并没有取得与ALL相同的成功。最近，CD123、CD33、CD38、CD70、C型凝集素样分子-1（CLL-1）、白细胞免疫球蛋白样受体-B4（LILRB4）、FMS样酪氨酸激酶3（FLT3）和唾液酸结合免疫球蛋白类凝集素6（Siglec-6）已被探索出来。CD123和CD33在80%以上的AML患者的白血病干细胞上高度表达，但在造血干细胞上也表达。因此，靶向它们可能会增加骨髓抑制的长期风险。为了降低血液学毒性，制备了可快速切换的通用抗CD123 CAR-T细胞。在一项小型研究中，3名R/R AML患者接受了这种通用抗CD123 CAR-T细胞的治疗，在停止开关介导的共刺激后，所有患者都获得了快速血液学恢复的临床响应。在另一项1期试验中，3名R/R AML患者接受了自体抗CD33 CAR-T细胞回输。不幸的是，他们都死于疾病进展。CD38在大多数AML母细胞上表达，并且抗CD38 CAR-T细胞治疗被证明对同种异体HSCT（造血干细胞移植）后复发的AML有疗效。CLL-1已被鉴定为髓细胞表面标志物，在白血病干细胞上过表达。重要的是，它在造血干细胞中不表达。CLL-1靶向的CAR-T细胞在临床前研究中特异性消除了CLL-1阳性白血病。CD70在AML母细胞上表达，但不在正常髓系细胞表达，使其成为治疗AML的有前景的靶点。目前，抗CD70 CAR-T细胞治疗的安全性和有效性正在研究中。此外，LILRB4在单核细胞AML细胞上高表达，是单核细胞性AML的一个有吸引力的靶点。Siglec-6在大约60%的AML患者中表达，而且在正常造血干细胞和祖细胞中不表达。在临床前研究中，Siglec-6 CAR T细胞在AML小鼠异种移植模型中有效地清除了AML母细胞。因此，它可以作为CAR-T细胞治疗AML的一个确定有效的靶点。此外，在30%-35%的AML患者中观察到了NPM1突变，它们被认为是白血病细胞中的起始突变。在临床前小鼠模型中，靶向由HLA-A2呈递的NPM新表位的CAR-T细胞表现出强大的特异性抗白血病活性。FLT3是一种跨膜酪氨酸激酶，表达于约30%的AML患者中存在恶性母细胞。FLT3突变包括点突变和内部串联重复（ITD），且与不良预后相关。在临床前研究中，FLT3靶向的CAR-T细胞成功地清除了FLT3阳性AML细胞，FLT3抑制剂克替诺尼促进了其抗肿瘤作用。不幸的是，FLT3在正常的造血干细胞和祖细胞上也表达，因此FLT3靶向的CAR-T细胞可能影响正常的造血功能。CAR-T细胞治疗多发性骨髓瘤的靶点MM仍然是一种无法治愈的浆细胞恶性肿瘤。随着新型试剂的应用，如蛋白酶体抑制剂、免疫调节药物和抗CD38单克隆抗体，MM患者的生存结果显著改善。然而，几乎所有MM患者都不可避免地复发。BCMA在恶性浆细胞上特异性过表达，因此它是MM最有前途的治疗靶点之一。目前，抗BCMA CAR-T细胞疗法已被证明对R/R MM有效，并获得了前所未有的反应，两种抗BCMA CAR-T细胞产物，艾基维仑赛和西达基奥仑赛，已被美国食品药品监督管理局批准用于R/R MM的治疗。此外，抗BCMA CAR-T细胞疗法还对患有髓外疾病的R/R MM患者有效。然而，一些MM患者在抗BCMA CAR-T治疗后仍然复发，并且在治疗压力下BCMA表达出现了下调。因此，新的靶抗原亟待发现。目前，已经研究了几种潜在的靶抗原，比如CD38、CD138、CD229、SLAMF7、增殖诱导配体（APRIL）和G蛋白偶联受体GPRC5D。CD138在MM细胞上高表达并促进其存活和增殖。在一项临床前研究中，抗CD138 CAR-T细胞有效地清除了MM细胞。在一项小型临床试验中，5名患者接受了抗CD138 CAR-T细胞治疗，其中4名患者出现临床响应，并且至少稳定保持了三个月。CD38不仅在MM细胞上高表达，而且在造血细胞和激活的淋巴细胞上也表达。不幸的是，尽管抗CD38 CAR-T细胞在小鼠模型中表现出显著的抗肿瘤作用，但它们损害了正常的造血细胞和淋巴细胞。临床上，CD38常与其他靶标（如BCMA和CD138）联用，构建双特异性CAR-T细胞，从而降低抗原逃逸的风险。CD229是一种在MM细胞上高表达的表面抗原。在临床前研究中，抗CD229 CAR-T细胞有效地清除了MM细胞。SLAMF7，也称为CS1，在95%以上的MM患者中高度表达。与CD38类似，SLAMF7也在正常淋巴细胞上表达，包括活化的T细胞、NK细胞和B细胞。因此，抗SLAMF7 CAR-T细胞可以杀死正常淋巴细胞，并增加CAR-T细胞自相残杀的风险。目前，抗SLAMF7 CAR-T细胞的临床试验正在进行中。APRIL是一种天然配体，可直接与BCMA和跨膜激活剂以及CAML相互作用因子（TACI）结合。因此，APRIL靶向的CAR-T细胞识别MM细胞上表达的BCMA和TACI，这可能降低抗原逃逸的风险，并且保留其三聚体构象可以提高抗肿瘤活性。此外，TGPRC5D在50%以上的MM患者骨髓中CD138阳性的恶性浆细胞上表达，这也是MM治疗的潜在靶点。CAR-T细胞治疗的毒性及其潜在机制尽管CAR-T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤已经获得了巨大的成功，与CART细胞治疗相关的不良事件仍然是一个主要挑战，如CRS、CRES、B细胞再生障碍、细胞减少和CRS相关的凝血障碍。如果没有积极有效的干预措施，这些并发症可能会危及生命。为了有效地治疗这些并发症，重要的是探索其潜在机制并在发生早期识别出它们。细胞因子释放综合征CRS是CAR-T细胞治疗中最常见的毒性之一。CRS的发病率取决于多种因素，包括疾病特征、CAR结构、肿瘤负荷和CART细胞剂量。CRS的临床表现多种多样，但多以发热、疲劳、肌痛、食欲差、缺氧、低血压甚至器官功能障碍为特征。如果不及时治疗，它可能会迅速发展为危及生命的疾病，如血液动力学不稳定和多器官功能障碍。然而，最近的研究表明，与<2级CRS患者相比，≥2级CRS患者的缓解率更高，无进展生存期（PFS）更长，这表明适当的CRS可能有助于CAR-T治疗的疗效。由于CRS主要由IL-6介导，因此主要推荐IL-6受体拮抗剂托珠单抗来缓解CRS的临床症状。根据CRS分级的不同，采用不同的治疗方案。症状治疗和支持治疗适用于1级CRS。托珠单抗和皮质类固醇推荐用于3级和4级CRS以及伴有严重症状的2级CRS。此外，IL-1是参与CRS和CRES的另一种重要细胞因子，IL-1受体拮抗剂阿那白滞素已被证明可以改善CRS和CRES。此外，GM-CSF缺乏或抑制不仅可以通过抑制髓细胞和T细胞的局部浸润来缓解CRS和CRES，还可以增强CAR-T细胞的抗肿瘤作用。此外，CRS的严重程度与患者的肿瘤负荷呈正相关为了减少肿瘤负荷，传统的化疗和放疗可以作为CAR-T细胞输注前的有效桥接策略。CRS的详细机制尚未可知。在识别靶抗原后，CAR-T细胞被迅速激活，并分泌大量颗粒酶、穿孔素、IFN-γ和TNF-α。穿孔素在肿瘤细胞膜上形成孔隙，使颗粒酶B进入肿瘤细胞。颗粒酶B激活广泛表达于CD19阳性恶性B细胞上的GSDME，导致肿瘤细胞焦亡和损伤相关分子模式（DAMPs）的释放，如高迁移率族蛋白B1（HMGB1）。然后，DAMPs募集并激活内源性先天免疫细胞，如巨噬细胞和树突状细胞，从而放大炎症反应并增加细胞因子的释放，包括IL-1β和IL-6。目前，已经证明巨噬细胞和单核细胞是这些细胞因子的主要来源并导致了CRS，而不是CAR-T细胞，并有助于CRS。此外，CAR-T细胞与宿主抗原呈递细胞（APC）以及肿瘤细胞上CD40和CD40配体（CD40L）的相互作用在免疫激活和细胞因子释放中也发挥着重要作用。CD40在多种APC上表达，包括B细胞、巨噬细胞、树突状细胞（DC）和单核细胞，并在各种血液系统恶性肿瘤中高度表达，如NHL、AML、MM。CD40L在活化的T细胞上高度表达，包括CAR-T细胞。接触依赖性CD40/CD40L相互作用增强APC和CD40阳性恶性肿瘤的抗原呈递，并促进细胞因子的分泌，如IL-1β、IL-6和TNF-α（图3）。此外，由于内皮细胞作为条件先天免疫细胞并表达CD40，CD40/CD40L相互作用也参与内皮细胞的激活。由于淋巴瘤病变大多是局限性的，CRS在淋巴瘤中表现出一些不同的表现，如局部CRS，其特征是局部红肿和发热。然后，CAR-T细胞持续扩增并进入循环中，并重新分布和介导组织损伤。最后，炎症消退，受损组织逐渐修复。因此，局部CRS的早期治疗有助于减少后续系统性CRS的发生。图3 CRS的机制CAR-T细胞相关脑病综合征CRES，也称为CAR-T细胞相关神经毒性，是CAR-T细胞治疗过程中的另一种常见毒性。它通常与CRS同时发生或晚于CRS发生。CRES的表现包括头痛、头晕、谵妄、癫痫发作和脑水肿。由于缺乏合适的动物模型，CRES的潜在病理机制尚不完全清楚。严重的CRS、高肿瘤负荷和过度CAR-T细胞扩增可能与CRES风险增加有关。目前，免疫介导的内皮激活是CRES发生的一个公认机制。CAR-T细胞一识别靶抗原就会迅速扩增并分泌细胞因子以激活内源性免疫细胞，如巨噬细胞，巨噬细胞继而释放大量细胞因子并激活脑微血管内皮细胞，最终导致紧密连接的破坏和血脑屏障（BBB）通透性的增加。然后，血清中高浓度的细胞因子通过被动转运进入血脑屏障，CSF中促炎细胞因子水平的升高似乎与CRES有关，包括IL-1β、IL6、IL-8、IFN-γ、GM-CSF、MCP-1和颗粒酶B。此外，已经证明，由于血脑屏障的破坏，T细胞和巨噬细胞，包括CAR-T细胞，可以渗透到CNS（中枢神经系统）中。这些浸润的免疫细胞和细胞因子可诱导作为脑内巨噬细胞的小胶质细胞的激活，进一步放大局部炎症反应，最终导致神经毒性。因此，免疫介导的内皮损伤是CRES的触发因素。由于托珠单抗不能穿过血脑屏障，它在治疗CRES方面表现出有限的疗效。鉴于皮质类固醇对中枢神经系统的渗透增加，建议用于治疗CRES，并且它不会影响CAR-T细胞的增殖和抗肿瘤作用。B/T细胞发育不全与感染CD19和CD20在多分化的B谱系细胞以及恶性B细胞上表达，是CAR-T细胞疗法治疗B-ALL和淋巴瘤的有吸引力的靶点。BCMA是一种浆细胞选择性蛋白，在MM细胞、成熟B细胞和正常浆细胞上高度表达。因此，CD19靶向、CD20靶向和BCMA靶向的CAR T细胞在B细胞恶性肿瘤中表现出优异的抗肿瘤活性，但它们也会攻击正常B细胞，这可能导致体液免疫受损，如B细胞再生障碍和低丙种球蛋白血症。此外，在输注CAR-T细胞之前进行的淋巴清除化疗也可能损害宿主免疫力。由于宿主免疫力受损，患者更容易受到感染。已经证明，大多数感染事件发生在CAR-T细胞输注的前30天，细菌感染占主导地位，主要包括血液感染和呼吸道感染。在一项1/2期研究中，31%接受抗CD19 CAR-T治疗的患者在第31天至第180天期间出现感染。因此，长期随访和检测丙种球蛋白水平可能会有所帮助。为了恢复体液免疫，补充免疫球蛋白对这些免疫受损的患者来说至关重要。此外，高剂量CAR-T细胞输注似乎与CAR-T细胞注射后的感染有关。因此，CAR-T细胞可以以剂量递增方案给药。此外，CAR-T细胞治疗增加了那些由于持续的B细胞再生障碍而导致HBV感染已经恢复的患者再次感染HBV的风险，因此建议进行抗病毒预防和定期病毒监测。不幸的是，随着CAR-T细胞疗法在T细胞恶性肿瘤中的应用，可能会观察到T细胞再生障碍，因为大多数靶抗原在正常T细胞上共表达。然而，由于相似的临床表现，如发热和促炎细胞因子和C反应蛋白（CRP）水平升高，很难区分CRS和感染。此外，CRS很可能与感染同时发生。为了避免CAR-T细胞治疗过程中出现危及生命的感染，早期识别和治疗感染很重要。然而，通过血液培养鉴定感染通常并不及时。因此，检测特异性生物标志物或建立感染预测模型至关重要。IL-6是参与感染诱导的细胞因子风暴和CAR-T细胞治疗诱导的CRS的关键细胞因子之一。典型的与CRS相关的血清IL-6升高发生在CAR-T细胞输注后3周内，因此“IL-6双峰”被确定为危及生命的感染的特征之一。与血液培养相比，采用“IL-6双峰”模式预测危及生命的感染似乎更快。当怀疑感染时，采集血液和痰液样本，一旦检测到病原微生物，应立即开始经验性抗感染治疗，尤其是中性粒细胞减少症患者。此外，在几项临床试验中偶尔观察到疱疹病毒感染。为了预防疱疹病毒感染，建议从淋巴清除化疗到CAR-T细胞输注后至少6个月，每天预防性给予400 mg阿昔洛韦两次。细胞减少在CAR-T细胞治疗期间经常观察到细胞减少并持续数天至数月，包括贫血、血小板减少和白细胞减少，以及在临床试验中，细胞减少的发病率在30%到100%不等。已经证明，细胞减少与严重CRS有关。在炎症条件下，CD40在粒细胞祖细胞/前体细胞上显著上调，这些细胞也表达低水平的CD40L，并且粒细胞祖/前体之间的CD40/CD40L相互作用显著促进其自身的凋亡。此外，促炎细胞因子，如IL-1、TNF-α和HMGB1，可以抑制红细胞生成素的产生，活化的巨噬细胞可以破坏红细胞。先前化疗和HSCT介导的有限造血能力也可能与细胞减少有关。此外，一些靶抗原在正常造血干细胞或祖细胞上共表达，因此CAR-T细胞可以直接介导造血细胞的破坏。临床上，红细胞和血小板输注以及造血生长因子，如粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和血小板生成素（TPO），以及TPO受体激动剂和西罗莫司，这些都能够改善细胞减少。CRS相关凝血病作为一种新鉴定的毒性事件，凝血障碍经常发生在CAR-T细胞输注后1个月内。其严重程度与CRS分级以及IL-6水平呈正相关，因此也称为CRS相关凝血病。最近的研究报告称，CAR-T治疗期间凝血障碍的发生率约为50%。CRS相关凝血障碍患者存在多种凝血参数异常，主要表现为D二聚体水平升高、纤维蛋白原降解产物增加、纤维蛋白蛋白原水平降低以及凝血酶原时间延长。CRS相关凝血病的进展可分为三个阶段，包括高凝期、消耗性低凝期和高纤溶期。在高凝期，患者主要表现为过度的微血栓形成，可以用抗凝血药物，如低分子肝素。在消耗性低凝期，患者出现出血，伴有纤维蛋白原水平下降以及APTT和PT延长，因此需要进行替代治疗。在高纤溶期，纤维蛋白原水平显著降低，D-二聚体水平显著上调。一旦血浆中的纤维蛋白原水平低于1.5 g/L，则应给予纤维蛋白原浓缩物或冷冻沉淀替代物（表2与CAR-T细胞治疗相关的毒性）。鉴于细胞因子风暴在CRS相关的凝血病中起着重要作用，CRS的早期有效治疗可能有助于降低凝血病的发生率。如果没有及时有效的干预，部分凝血障碍患者可能会进一步发展为弥散性血管内凝血（DIC），并伴随不良预后。表2 CAR-T细胞治疗相关毒性及有效解决方案CRS相关凝血障碍的机制尚不清楚。活化的血小板、单核细胞和内皮细胞以及它们之间的CD40/CD40L相互作用可能共同导致CRS相关的凝血病。活化的CAR-T细胞上表达的CD40L在血液循环中以CD40非依赖性的方式诱导血小板活化。活化的血小板易于形成单核细胞血小板聚集体（MPAs），并且高度表达CD40L，其可以通过与CD40的直接相互作用诱导单核细胞和内皮细胞中组织因子（TF）的表达。TF可以激活外源性凝血级联反应，单核细胞是TF的主要来源。除了CD40/CD40L相互作用外，还有多种诱导剂可以刺激单核细胞上调TF的表达，如C-反应蛋白（CRP）、IL-1β和TNF-α。此外，它们之间的CD40/CD40L相互作用也促进细胞因子的过量产生，如IL-1β、TNF-α和IL-6。高水平的细胞因子进一步介导内皮损伤，导致TF、促凝颗粒Weibel-Palade小体（WPBs）和血管性血友病因子（VWF）的释放以及胶原纤维的暴露。暴露的胶原纤维触发内在的凝血途径。此外，细胞因子IL-6、TNF-a和IFN-g可以直接抑制ADAMTS13的产生和活性，其有助于血液中VWF水平的升高并促进血小板粘附和聚集。此外，CAR-T细胞治疗诱导的严重肝损伤会影响凝血因子的产生，一些血液系统恶性肿瘤患者在CAR-T细胞疗法之前已处于高凝状态（图4）。CAR-T细胞治疗的耐药性及潜在的有效策略然而，随着CAR-T细胞疗法在R/R B细胞恶性肿瘤中的广泛应用，相当一部分患者在CAR-T细胞治疗后复发。有多种因素导致CAR-T细胞治疗后复发，包括抗原逃逸、CAR-T细胞有限的持久性和免疫抑制的肿瘤微环境。有一些治疗策略可以克服对CAR-T细胞治疗的耐药性，包括应用双特异性或铠装CAR-T细胞、优化CAR结构、联合其他疗法，如小分子药物、局部放疗和溶瘤病毒。克服抗原逃逸尽管CAR-T细胞治疗在R/R B细胞恶性肿瘤方面取得了令人印象深刻的成就，但大多数患者仍会复发。CAR-T细胞治疗后复发的主要机制之一是抗原丢失。CAR-T细胞治疗压力下的抗原突变是抗原丢失的最常见机制，包括剪接变异体、谱系转换和双等位基因突变。除了抗原突变外，由CAR-T细胞的内吞作用诱导的细胞表面抗原低密度也可以促进肿瘤免疫逃逸。但最重要的是，一项研究报告称，在CAR-T细胞制造过程中，抗CD19 CAR偶发转移到白血病B细胞中，然后与白血病母细胞上的CD19表位结合，因此“表位掩蔽”阻止了白血病母细胞被抗CD19 CAR-T细胞识别。图4 CRS相关凝血障碍的机制靶向不同的抗原是克服由于抗原丢失而复发的最有效方法之一。可以识别两种不同靶抗原的双重靶向CAR-T细胞已被证明可以降低抗原阴性复发的风险，例如B细胞淋巴瘤/白血病中的双特异性CAR-T细胞和MM中同时靶向BCMA和TACI的基于APRIL的CAR-T细胞。还对多靶向CAR-T细胞进行了探索。在一项临床前研究中，已经证明三特异性靶向CD19-CD20-CD22的CAR-T细胞可以快速消除B细胞淋巴瘤，并且基于BAFF配体的CAR-T细胞同时靶向三种受体，包括BAFFR、BCMA和TACI。除了同时靶向不同的抗原外，增加靶细胞的免疫原性可能也是一个可行的策略。例如，小分子γ分泌酶抑制剂可以减少BCMA的脱落，并促进CAR-T细胞对MM细胞的识别。γδT细胞（γδT）是外周血毒性T细胞中的一小部分，表达两种T细胞受体（TCRs）和自然杀伤受体（NKRs），并参与抗肿瘤免疫。特别是在血液系统恶性肿瘤中，γδT上表达的NKR对肿瘤细胞的识别发挥着重要作用。因此，除了scFvs介导的抗原识别外，γδ CAR-T细胞还可以通过NKRs以MHC非依赖的方式识别抗原阴性的白血病细胞。此外，在异基因和HLA单倍体造血干细胞移植中，γδT细胞不会诱导移植物抗宿主病（GVHD），这表明γδT淋巴细胞不会引发同种异体反应性。因此，它们更适合于开发通用CAR-T细胞。调节CAR-T细胞的持久性CAR-T细胞的持久性短限制了其抗肿瘤疗效，并可能导致抗原阳性复发。有多种策略可以提高CAR-T细胞的持久性，例如优化CAR-T细胞的构建，利用记忆T细胞，以及合理设计CD4与CD8 CAR-T细胞的比例。迄今为止，CD28和4-1BB是CAR-T细胞中最常见的共刺激分子。然而，已经证明，与CD28共刺激相比，4-1BB共刺激可以改善CAR-T细胞耗竭。值得注意的是，结合CD28和4-1BB可以同时增强CAR-T细胞的抗肿瘤作用并增加持久性。此外，CAR-T细胞结构可以通过全人源化的CAR进行优化。人源化CAR-T细胞可以避免宿主免疫系统的排斥反应，并且它们对先前小鼠CAR-T细胞治疗失败的R/R患者仍然有效。CD4+T细胞也具有发育可塑性，可以直接杀死肿瘤细胞，但它们清除肿瘤细胞的速度较慢，释放的颗粒酶B水平低于CD8+T细胞。因此，CD4+CAR-T细胞表现出优异的持久性，并且CD4/CD8 CAR-T细胞的比例可能会影响治疗效果。目前，CD4/CD8 CAR-T细胞以1:1的比例已被证明具有优异的抗肿瘤作用。CAR-T细胞被认为是“活的药物”，但缺乏精准调控。鉴于CAR-T细胞的过度扩增可能导致危及生命的CRS，因此有必要通过添加安全开关来调节CART细胞的扩增和持续性，以减轻意外或严重的毒性。众所周知的诱导型胱天蛋白酶9（iCasp9）自杀基因和小分子控制系统已在探索中。在小分子控制系统中，美国食品药品监督管理局批准的小分子药物是特异性调节抗原识别或清除CAR-T细胞的关键开关，如来那度胺、甲氨蝶呤、阿仑单抗、利妥昔单抗和西妥昔单抗，以及正交IL-2。上述单克隆抗体通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）或补体依赖的细胞毒作用（CDC）介导CAR-T细胞的清除。然而，在这种策略中，CAR-T细胞的清除是缓慢的，可能不适合具有严重毒性的患者。通过组合策略提高CAR-T细胞治疗的抗肿瘤效果CAR-T细胞的低活性也可能限制CAR-T细胞治疗的疗效。多种免疫刺激分子，包括某些细胞因子或共刺激分子，已被证明在调节T细胞的发育和功能中发挥重要作用，如IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40L。它们可以促进CAR-T细胞的强大扩增，增加记忆表型CAR-T细胞，并提高其持久性。除了添加这些外源性细胞因子外，组成性表达这些免疫刺激分子或其受体的基因修饰也可以改善CAR-T细胞的功能。这些第四代CAR-T细胞通过以自分泌或旁分泌方式刺激自身或内源性免疫细胞的激活，显示出改善的抗肿瘤活性。为了提高CAR-T细胞治疗的疗效，结合用小分子药物进行CAR-T细胞治疗似乎很有前景，并可能产生协同作用。选择性核输出抑制剂塞利尼索、来那度胺和卡非佐米已被批准用于治疗MM。有趣的是，将它们与CAR-T细胞结合也取得了令人鼓舞的结果，CAR-T细胞的细胞毒活性和细胞因子的产生得到了改善。特别是，最近的临床研究表明，对抗BCMA CAR-T细胞治疗有耐药性的R/R MM患者也可以受益于基于塞利尼索的方案和基于卡非佐米的方案，一项研究报告称，抗BCMA CAR-T细胞治疗联合来那度胺对先前在抗BCMA CAR-T细胞治疗后复发的R/R MM-患者有效。伊布替尼是一种著名的布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂，已被批准用于治疗CLL和MCL。重要的是，伊布替尼不仅在临床前和临床研究中提高了CAR T细胞的抗肿瘤疗效，但也降低了严重CRS的风险。此外，已经证明去甲基剂阿扎胞苷和地西他滨也可以增强CAR-T细胞的细胞毒性作用。此外，CAR-T细胞治疗结合抗凋亡蛋白抑制剂可以克服抗凋亡蛋白诱导的耐药性。然而，CAR-T细胞治疗结合小分子药物仍处于起步阶段，许多联合策略正在探索中。此外，对于淋巴瘤或患有大体积疾病的MM患者，局部放疗可以作为白血病和CAR T细胞输注之间耐受性良好且有效的桥接策略。一方面，这种联合治疗可以阻止疾病进展，减轻肿瘤负担；另一方面，它可能通过脓肿效应使CAR-T细胞增敏，脓肿效应可能与肿瘤内趋化因子和细胞因子的上调、新抗原的释放以及内源性免疫细胞的激活。尽管如此，最佳辐照剂量和分级仍有待确定。克服免疫抑制性微环境虽然直接靶向肿瘤细胞很重要，但克服免疫抑制的肿瘤微环境也很关键。尽管肿瘤微环境被认为在血液系统恶性肿瘤的耐药性中起着相对较小的作用，但MM、白血病和淋巴瘤微环境也含有肿瘤促进成分，如基质细胞、骨髓增生、抑制细胞、调节性T细胞、肿瘤相关巨噬细胞和肿瘤相关中性粒细胞，它们与恶性细胞密切相互作用，促进其存活和免疫逃逸。此外，这些免疫抑制成分损害CAR-T细胞的细胞毒性作用，并导致CAR-T细胞衰竭。因此，克服血液系统恶性肿瘤的免疫抑制微环境也是必要的。除了铠装的CAR-T细胞外，CAR-T细胞治疗联合免疫检查点阻断或溶瘤病毒似乎也是一种有吸引力的策略。PD-1/PD-L1通路在T细胞耗竭中起主要作用，而且肿瘤免疫逃逸的主要机制。因此，阻断PD-1/PD-L1的相互作用可以促进免疫系统对抗癌症细胞，近年来PD-1阻断剂在多种肿瘤类型中取得了巨大成功，特别是在淋巴瘤中。PD-1阻断剂通常与常规化疗或其他免疫疗法联合使用。目前，多项研究已经探索了这种CAR-T细胞和PD-1阻断剂的联合治疗（表3与CAR-T细胞治疗的组合策略）。在一项纳入11名NHL患者的临床试验中，45.5%的患者在这种联合治疗后达到CR，并且毒性是可以耐受的。其机制可能主要归因于CAR-T细胞耗竭的减少。此外，已经开发出能够分泌PD-1阻断scFv的CAR-T细胞。临床前研究表明，这种CAR-T细胞的疗效与CAR-T细胞和PD-1抑制剂的联合治疗等同甚至更优。TIM-3是另一种抑制性免疫检查点，以及TIM-3阻断与CAR-T细胞的组合也发挥协同抗肿瘤活性。表3 CAR-T细胞治疗的组合策略在临床研究中的报道CAR-T细胞治疗和溶瘤病毒的结合是克服免疫抑制微环境的创新策略。携带病原体相关分子模式（PAMP）的病毒感染的肿瘤细胞可以募集宿主免疫细胞，从而促进宿主免疫系统对TAAs的识别，溶瘤病毒也可以用免疫刺激分子进行基因修饰，以增强CAR-T细胞的抗肿瘤活性。此外，溶瘤病毒直接裂解肿瘤细胞，并导致TAAs和损伤相关分子模式（DAMP）的释放，这可以增加肿瘤免疫原性，并通过模式识别受体（PRR）激活APC，最终激活肿瘤特异性T细胞。此外，表达免疫调节分子如IL-15、IL-18、CD40L以及TGF-β显性阴性受体II的铠装CAR-T细胞能够重塑肿瘤微环境。肿瘤微环境中的肿瘤代谢产物可以抑制CAR-T细胞的代谢和功能，因此抑制肿瘤代谢产物的积累是一种潜在的治疗选择。犬尿氨酸（Kyn）是一种存在于淋巴瘤和白血病等各种造血系统恶性肿瘤中的肿瘤代谢产物，其酶催化Kyn的降解。因此，抗CD19 CAR-T细胞用犬尿氨酸基因进行了基因修饰，并且它们在具有高Kyn的免疫抑制肿瘤微环境中对Nalm6 GL细胞表现出改善的抗肿瘤活性。有趣的是，一些靶抗原在肿瘤微环境中的免疫抑制细胞上共表达，因此靶向这些抗原可以同时消灭恶性细胞和免疫抑制细胞。例如，抗CD123 CAR-T细胞靶向HL中的恶性细胞和TAM。总结在CAR-T细胞治疗中存在许多挑战和机遇。随着新的治疗靶点的确定和CAR结构的优化，CAR-T细胞治疗将在血液系统恶性肿瘤以外的邻域具有更广泛的临床应用。然而，随着CAR-T细胞疗法的快速商业化，CAR-T细胞管理面临的重大挑战，例如与CAR-T治疗相关的毒性和CAR T细胞治疗后的复发。因此，探索其潜在机制并克服这些限制将有助于R/R患者从这一疗法中获得更多益处。目前，CAR-T细胞治疗的多种组合方法正在探索中，而且看上去是一种很有前途的免疫疗法。此外，UCAR-T细胞和CAR-NK细胞由于其低制造成本和现成商品性，在癌症治疗中也显示出巨大潜力。由生物制品圈&抗体圈主办的“2023生物制品工艺发展大会”将于9月22-23日在上海举办，本次大会将主要聚焦生物制品前沿技术、CMC、生产、工艺等热点话题进行探讨交流，涉及人用疫苗、兽用疫苗、抗体药、细胞治疗、基因治疗等生物制品领域。届时将邀请生物制品领域经验权威的专家进行报告，欢迎各界同仁参会学习交流。1.会议名称：2023生物制品工艺发展大会2.会议时间：2023年9月22-23日（周五、周六）3.会议地点：上海（酒店定向通知）4.主办单位：生物制品圈、抗体圈5.媒体支持：药时空、药创客、细胞基因研究圈6.报名方式及费用：扫描识别下方二维码进行报名登记。转发分享福利：生物医药研发企业、科研院校和监管机构人员，前100位报名人员转发分享至朋友圈本通知可免费参会（不含餐饮）报名后，加微信13585867695发截图给工作人员即可。组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请，最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。各类商务合作咨询：13585867695（同微信）大会日程识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。