RNF4

当前许多共价药物发现方案，包括共价 EGFR 和 BTK 抑制剂的计划，都涉及向确定的配体添加反应性官能团。然而，新兴技术使得从亲电试剂的角度来发现共价配体成为可能，其中在基于结构的优化之前识别出针对感兴趣的蛋白质靶标的共价配体。在本文，我们将讨论共价药物发现的新兴技术的工具。 1. 共价化合物筛选平台总结 许多新兴的共价配体筛选平台涉及基于质谱的检测，通过化合物和蛋白质之间的共价键形成来实现。还使用了其他表型筛选、DNA 编码库或计算方法，然后将其与基于 MS 的验证、基于 ABPP 的实验相结合，为选择性和结构生物学提供信息，从而实现共价药物苗头。表1 总结了最重要的共价筛选方法。商业化的亲电子片段类化合物库的增长是促成这些亲电子优先发现策略兴起的关键因素。 表1 共价药物发现筛选方法比较 ２. 完整蛋白质 MS 最初，基于 MS 的化合物筛选源于“束缚(tetehering)”，这是一种自 2000 年以来采用的技术，它使用与二硫化物连接的化合物库来识别与半胱氨酸相邻口袋结合的片段。结合的分子（可以是内源的、或工程化的）与半胱氨酸进行二硫键交换，与蛋白质形成加合物，并通过 MS 检测进行混合(pooled)筛选可以识别结合的化合物。结合片段可以以基于片段的方法，以鉴定高亲和力配体。该策略最初旨在识别具有挑战性的靶标的可逆配体，可以通过用丙烯酰胺等亲电子试剂替换二硫键来维持共价结合，就像最初的共价 KRAS(G12C) 抑制剂(10.1038/nature12796)的情况一样。这种方法还用于发现调节蛋白质-蛋白质相互作用的化合物，最近的一项研究采用了类似的束缚策略，即使用醛与赖氨酸残基形成亚胺(10.1002/anie.202008585) 。 KRAS(G12C) 共价抑制剂 基于亚胺的束缚实现蛋白质-蛋白质相互作用的基于片段的稳定剂 最近，使用完整 MS 筛选了 993 种丙烯酰胺和氯乙酰胺的商业化文库，以鉴定去泛素酶 OTUB2 和焦磷酸酶NUDT7 的共价配体 10.1021/jacs.9b02822。作者使用 OTUB2 和 NUDT7 与命中化合物的共晶结构来片段延伸片段以增加效力。 使用完整 MS 筛选方法结合结构引导设计来识别针对蛋白质靶标的共价片段配体。 相同的化合物库还用于筛选肽基脯氨酸顺反异构酶-Pin1，该酶在多种肿瘤类型中过表达或激活，但选择性靶向具有挑战性 10.1038/s41589-021-00786-7 。在共价抑制剂靶点识别 (CITe-Id) 化学蛋白质组学实验中，所得共价抑制剂对 Pin1 具有选择性，并且可有效抑制小鼠神经母细胞瘤的生长。 Sulfopin 是 Pin1 的共价抑制剂。 共价配体筛选的另一个例子是筛选了一系列共价化合物，导致了第一个批准的 KRAS(G12C) 抑制剂 sotorasib。通过三种测定法筛选了 3,300 种丙烯酰胺化合物文库：硫醇反应性测定法、RAF 偶联核苷酸交换测定法和完整 MS 测定法 10.1021/acsmedchemlett.9b00258 。结合共结晶结构显示配体结合如何KRAS口袋，这项工作为快速发现 KRAS(G12C) 抑制剂提供了基础。 KRASG12C 共价抑制剂 3. 共价 DNA 编码文库 DNA 编码文库(DEL, DNA-encoded libraries) 提供了一种替代方法，可以筛选大型小分子文库。与 MS 或 ABPP 方法不同，共价在 DEL 筛选方面没有特殊优势，但 DEL 允许通过固定、富集、扩增和测序的工作流程筛选更大的共价文库。在过去的 5 年中，半胱氨酸靶向 DNA 编码或蛋白-核酸编码文库已被用于识别溴结构域分子（PCAF 和 BRD4），以及 JNK1、MEK2 和 HER2。进一步的工作探索了共价 DEL 筛选工作流程的富集步骤的改进，其不同之处在于共价接合阻止了 DNA 标记分子的洗脱。通过针对 DNA 编码蛋白库筛选，还鉴定出了 MAP2K6 的共价配体10.1021/jacs.7b04880。随着共价 DEL 文库规模的扩大和 DEL 商业可用性的增加，包含亲电分子的 DEL 将在共价配体发现中变得更加广泛，尽管必须牢记富集工作流程和化合物稳定性方面的独特考虑。 从 DNA 编码的小分子文库 × 蛋白质文库 筛选发现共价激酶抑制剂 4. 共价分子对接 大多数共价对接计算程序依赖于在小分子配体和相应氨基酸位点之间的预定义键的约束下进行对接。共价对接平台 GOLD 使用的一个例子是虚拟筛选 NEDD8 激活酶 (NAE) 的共价抑制剂，其中三个命中化合物被确认为新型 NAE 抑制剂10.1021/ci5002058。 针对共价配体的有效虚拟筛选策略：新型 NEDD8 激活酶抑制剂的鉴定 用于虚拟筛选的 DOCKovalent 方法的开发促进了硼酸 AmpC β-内酰胺酶抑制剂以及 JAK3 的氰基丙烯酰胺抑制剂的发现169。 筛选亲电性小分子大型虚拟库的通用方法（DOCKovalent） DOCKovalent 使用非共价对接方法预先生成亲电虚拟库的构象和状态，然后针对目标亲核试剂对每个状态进行采样。相同的方法已用于鉴定激酶 MKK7 的新共价抑制剂，以及结合 KRAS（G12C）以破坏蛋白质稳定性并加速核酸交换的化合物。 除了筛选之外，共价对接也是研究已知共价配体的结合模式的有用工具。例如，GOLD 已用于模拟含醛蛋白酶体抑制剂 MG132 的结合。AutoDock 使用灵活的侧链方法，将共价配体视为氨基酸侧链，并使用基于物理的评分函数对这种灵活的“侧链”的姿势进行评分，该评分函数评估配体-蛋白质相互作用的能量学，如蛋白质的其余部分保持刚性。另一种方法称为 CovDock，基于薛定谔GLIDE对接算法和 Prime 结构细化方法。CovDock 使用传统的非共价对接方法将配体与蛋白质靶标对接，然后对共价键连接进行建模并完善复合物。这种方法没有考虑亲电子试剂的反应性，这可能限制虚拟研究具有不同亲电官能团的对接配体差异的能力。 总的来说，当亲电子试剂的反应性和修饰位点已知时，共价对接软件可以提供有关配体-蛋白质相互作用的有用信息。 5. 化学蛋白质组学的发现 化学蛋白质组学平台能够直接在复杂的生物系统中鉴定共价化合物及其靶蛋白上相应的配位位点。化学蛋白质组学的进步促进了针对不可成药靶标的共价配体的药物发现，并能够对整个蛋白质组中的共价配体进行选择性分析，以识别这些配体的靶标和脱靶。接下来将讨论反应性配体热点的化学蛋白质组学分析、ABPP 筛选平台和靶点识别。 5.1 反应性配体热点的化学蛋白质组学 ABPP 有助于发现复杂生物样品中的共价配位位点和相应的配体。ABPP 是由 Cravatt 和 Bogyo 发明，使用活性位点定向化学探针，共价靶向各种酶类的催化残基，包括水解酶、蛋白酶和激酶。该技术通常使用基于凝胶的测定，用于获得生物环境中活性酶的功能读数。ABPP探针包含与亲核氨基酸（例如半胱氨酸）共价反应的弹头和用于监测探针结合的报告基团，例如用于后续点击化学应用的荧光团、生物素或炔部分（下图a ）。 同位素串联正交蛋白水解 - 基于活性的蛋白质分析。a|. 用于基于活性的蛋白质分析 (ABPP) 的反应探针。b|. 竞争性 isoTOP-ABPP（同位素串联正交蛋白水解 - 基于活性的蛋白质分析）方法的示意图。 最近的 ABPP 方法不再关注活性位点，而是使用 MS 和广泛反应的化学探针来绘制变构位点。在 isoTOP-ABPP（同位素串联正交蛋白水解 - 基于活性的蛋白质分析）方法中，使用带有炔烃的碘乙酰胺探针来识别蛋白质组中的高反应性半胱氨酸（图b） 。炔烃基团可用于将探针修饰的蛋白质连接到TEV 蛋白酶可切割标签，该标签包含由同位素轻或重缬氨酸分隔的叠氮基团和生物素部分。这些功能能够富集探针修饰的肽，并使用 MS 对轻质和重质样品进行串联分析，在控制运行间变异性后，可以在样品之间进行定量比较，包括共价化合物的竞争分析。使用这种方法，发现半胱氨酸的高反应性预测了它们在催化和翻译后修饰位点的功能。 总体而言，反应性分析生成了数千种蛋白质的大量信息，最终提供了亲核（通常是半胱氨酸）氨基酸反应性的图像。该信息可用于在药物发现计划中选择适当的蛋白质靶标，或识别先前可能被认为不可配体或不可成药的感兴趣蛋白质上的变构位点。 5.2 基于活性的蛋白质分析筛选平台 竞争性 isoTOP-ABPP 的使用扩展到通过将单个丙烯酰胺和氯乙酰胺片段与碘乙酰胺-炔探针竞争来识别小型共价片段库的蛋白质组中的靶标。在这项研究中，鉴定了 700 多个可配体半胱氨酸，并提供了有关文库中每个共价片段的蛋白质组选择性的信息。通过这种方法发现的共价配体及其相应的可结合位点被用来帮助阐明 caspase 8 和 caspase 10 在 T 细胞外源性细胞凋亡中的作用，表明这种方法可以快速识别靶向具有生物学意义的蛋白质的化合物。在此工作的基础上开展了多项研究，利用 isoTOP-ABPP 寻找新的共价配体。例如，在突变型  KEAP1 中绘制了半胱氨酸反应性和可配位位点，并与野生型 KEAP1 NSCLC 系中的进行比较。作者发现了与核受体 NR0B1 上可结合半胱氨酸结合的化合物，该受体受 NRF2（KEAP1 的底物）调节。 5.3 化学蛋白质组学平台的靶标识别 IsoTOP-ABPP 还可用于识别已知亲电子药物的蛋白质靶标。例如，这种方法应用于富马酸二甲酯，用于治疗自身免疫性疾病。尽管富马酸二甲酯用于治疗牛皮癣已有三十年的历史，并于 2013 年被 FDA 批准用于治疗多发性硬化症，但富马酸二甲酯的直接共价靶点直到最近仍不清楚。在一项研究中，化学蛋白质组学方法用于鉴定蛋白激酶 Cθ (PKCθ) 和 IRAK4 作为富马酸二甲酯的靶标。在这两种情况下，半胱氨酸残基的共价结合破坏了蛋白质-蛋白质相互作用以调节免疫细胞功能。破坏 PKCθ 与共刺激受体 CD28 的相互作用会减少 T 细胞活化，破坏 IRAK4-MYD88 相互作用会抑制浆细胞样树突状细胞中干扰素-α 的产生。 5.4 邻近诱导的共价配体发现 共价配体不仅可用作功能抑制剂，而且在新兴的邻近诱导中也具有重要作用。共价药物发现平台通过发现针对 E3 泛素连接酶的共价招募剂，促进了靶向蛋白质降解方法的扩展。尽管大多数双功能降解分子（蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC)）会招募 E3 连接酶 cereblon (CRBN) 或 von Hippel–Lindau (VHL) 蛋白来降解靶蛋白，但仍有超过 600 种具有不同底物范围的 E3 连接酶。自 2019 年以来，共价招募已被用于验证大部分用于靶向蛋白质降解的 E3 连接酶，包括 RNF114、RNF4、DDB1 和 DCAF16、DCAF11、 KEAP1 以FEM1B。在一项研究中，使用双功能 FKBP12 和 BRD4 降解剂，作者将 DCAF16 确定为负责降解的目标 E3 连接酶 。这些发现导致了现在可用的各种共价 E3 募集分子。 除了降解之外，非抑制性共价配体的鉴定还有可能有助于发现新的接近诱导分子。例如，使用共价去泛素酶招募剂开发了一种称为去泛素酶靶向嵌合体（DUBTAC）的靶向蛋白质稳定平台。一般来说，通过共价配体筛选鉴定非抑制性变构配体有可能促进其他酶（例如激酶和脱乙酰酶）的招募以靶向蛋白质并将蛋白质功能引导至新底物以获得治疗益处。 5. 亲核共价配体 大多数蛋白质反应性共价药物往往是亲电子的，以便能够与亲核氨基酸发生反应。相比之下，亲核药物可以与亲电辅因子和翻译后修饰发生反应。几种含肼化合物充当单胺氧化酶 (MAO) A 和 B 的基于机制的抑制剂，通过 MAO 的激活能够使黄素辅助因子烷基化，从而抑制该酶。ABPP 原理和“反极性”探针已用于研究亲电翻译后修饰，例如可与含肼化合物发生反应的 N 末端丙酮酰基和乙醛酰基修饰。基于肼的探针也被用来帮助鉴定和表征具有亲电辅因子或翻译后修饰的蛋白质的配体。 6. 靶向赖氨酸的共价配体 半胱氨酸的低丰度可以实现选择性，但限制了共价靶向特定目标蛋白质的机会。这个问题促使科学家们研究其他亲核氨基酸的靶向，特别是赖氨酸。由于赖氨酸的ε-氨基在生理条件下亲核性较低，发现有效的赖氨酸靶向共价配体需要鉴定异常反应性的赖氨酸。使用多种赖氨酸导向探针的 IsoTOP-ABPP 实验已证明在分析整个蛋白质组的赖氨酸反应性方面非常有效。通过 isoTOP-ABPP 实验，鉴定出超过 9,000 个可配位的赖氨酸，并且更精细的含五氟苯酚或含N-羟基琥珀酰亚胺酯的化合物可以选择性地标记感兴趣的特定蛋白质。在这些实验的基础上，合成了大约 180 个亲电子试剂的文库，然后进行 isoTOP-ABPP 实验以评估不同化学型的选择性并鉴定可与小分子配位的赖氨酸。这项研究产生了更广泛的反应性亲电子试剂，例如二醛，可用于进一步的赖氨酸分析实验，但也鉴定了反应性较低的亲电子试剂，包括N-酰基-N-烷基磺酰胺，其以前曾被用作生物共轭的工具。 人类蛋白质组中亲氨基化合物-赖氨酸相互作用的全局图。 大多数赖氨酸靶向配体都是使用基于结构的方法从现有配体设计的，通常是通过将亲电子磺酰氟、氟硫酸盐或乙烯基砜合理地放置在适当的方向与邻近已建立的结合位点的赖氨酸的ε-氨基反应。此类配体包括动力学运甲状腺素蛋白稳定剂 、异构体选择性PI3Kδ抑制剂以及细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2) 和Hsp90的抑制剂。结合全面的亲电子分析、赖氨酸导向的化学蛋白质组学和结构引导的方法将使科学家能够利用配体结合位点附近丰富的赖氨酸残基来增强共价药物的发现。 参考: doi.org/10.1038/s41573-022-00542-z 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）是指由于在DNA复制时插入或缺失突变引起的微卫星序列长度改变的现象，由错配修复功能（Mismatch repair, MMR）缺陷引起，是公认的重要致癌途径之一。MSI是一种遗传缺陷，常见于多种癌症中，包括结直肠癌、子宫内膜癌等。WRN（Werner syndrome RecQ helicase）作为一种RecQ家族的DNA解旋酶，在多项大规模基因组筛选证实是MSI癌症的合成致死靶点。 WRN参与合成致死的机制如下：当 DNA 在复制过程中发生错配，正常细胞主要由 DNA 错配修复蛋白（MSH2或 MLH1）进行 DNA 错配修复，而微卫星不稳定性肿瘤细胞由于缺乏错配修复基因（或错配修复系统存在缺陷），存在大量的TA重复序列，形成十字形的二级结构，使复制叉停滞，并引起ATR依赖的WRN磷酸化，来解旋二级结构及完成复制。当WRN缺失时，结构特异的MUS81-EME1核酸内切酶和SLX4一起切割二级结构以试图恢复复制叉的功能。但是，过多的MUS81切割最终导致了DNA末端切割，染色体破碎甚至细胞死亡。因此，发现WRN的抑制剂对于MSI肿瘤具有重要的治疗前景。 为了获得该抑制剂，来自诺华公司的研究人员利用基于ATP结合的筛选方法，从15万个化合物中筛选到化合物1，并通过基于结构的药物设计，改善渗透性和脂溶性效率得到化合物；继而降低化合物logP并改善渗透性，引入邻甲基苯胺和羟基嘧啶得到化合物3和4。其中化合物4（HRO761）具有良好的物理化学性质和药代动力学，且无明显脱靶效应。 共晶结构显示，HRO761作用于WRN解旋酶核心结构域，结合在D1-D2界面上的一个非保守变构位点，诱导D1和D2结构域发生约180°的相对旋转从而发挥功能。相互作用分析发现几乎所有HRO761上的重原子都参与了与WRN的极性相互作用，从而将WRN锁定在非活性状态。 在高ATP条件下，HRO761在SW48细胞（MSI细胞）中测定的半数生长抑制浓度（GI50）为40nM，而对CAL33（microsatellite-stable, MSS细胞）无显著抑制作用。为了系统评估HRO761的细胞活性，他们对20个MSI（红色）和8个MSS（蓝色）细胞系中普筛了其抗增殖活性，发现HRO761在纳摩尔浓度(IC50:50-1000 nM)下选择性抑制MSI细胞系的克隆形成，且其敏感性与细胞内WRN的依赖性(DRIVE score)相关，对MSS细胞系无影响。 在CellTiter-Glo（CTG）试验中, HRO761与WRN的结合在所有检测的MSI和MSS细胞系中都是相似的，其蛋白稳定化IC50(PS50)在10-100 nM范围内，而带有突变C727A或C727S会降低与HRO761的结合，并削弱其细胞增殖抑制和PD效应，说明尽管HRO761在所有细胞中都能有效结合WRN，但只在MSI细胞中抑制WRN从而产生选择性的细胞毒性。 免疫印迹分析发现，HRO761处理MSI细胞后诱导产生DNA损伤反应，包括ATM、CHK2激酶磷酸化，p53激活和γH2AX增加等，而在MSS细胞系中未见此反应。同时还发现，HRO761可诱导WRN降解和染色质结合增加；蛋白质组学分析表明HRO761处理后的WRN蛋白丰度仅在MSI细胞系中显著下调。之前文献报道，当WRN受到抑制时，WRN在染色质上被困上并被PIAS4 泛素化修饰。泛素化的WRN被泛素E3连接酶RNF4识别，然后泛素化WRN导致p97/vcp介导的染色质提取并运送到蛋白酶体进行降解。RNA测序分析显示，HRO761在4个MSI细胞系中显著调控了多个基因的表达，包括CDKN1A、MDM2等p53靶基因，而在MSS细胞和WRN敲除细胞中没有观察到基因表达变化。因此，WRN抑制剂HRO761仅在MSI细胞中具有细胞毒作用，并诱导WRN蛋白降解。 为了明确HRO761对MSI细胞的治疗作用，研究人员使用不同浓度HRO761 24h处理MSI细胞，发现其剂量依赖性激活ATM和CHK2、增加p21蛋白诱导并对p53依赖的基因呈剂量式调控。免疫荧光分析显示，随HRO761浓度升高，细胞核内绿色荧光显著增强，表明γ-H2AX含量明显升高，DNA损伤增加；细胞周期分析发现HRO761处理会使细胞阻滞在G2/M期。进一步机制研究发现，WRN降解并非细胞周期阻滞的原因，且经HRO761处理后，总CHK2蛋白水平虽有下调，但是由于在HRO761抑制生长的浓度并未导致CHK1/CHK2降解，说明HRO761致死不太可能是由于CHK2（或CHK1）丢失引起。 体外实验显示，HRO761在HCT116 p53野生型和敲除型细胞中的IC50相似，且HRO761处理后两种细胞后均表现出抗增殖活性，表明HRO761作用机制不依赖于p53；同时，在p53野生型和敲除型细胞中，均可以观察到给药后ATM和CHK2磷酸化增加且WRN降解增加。上述结果说明，HRO761选择性诱导持续的DNA损伤反应，并引起细胞周期阻滞和凋亡，主要由ATM-CHK2通路驱动，而非依赖于p53。 为了评价HRO761通过WRN的合成致死性能，研究人员对携带SW48移植瘤小鼠每日1次口服HRO761，发现给药后肿瘤增殖停滞，并在较高剂量下导致75-90%的肿瘤消退长达60天，之后肿瘤由于耐药性会出现剂量依赖性复发。在第7天及91天采集血样分析，HRO761的抗肿瘤功效与与血液中化合物浓度有关，且不会在体内蓄积，在GI90曲线上方的AUC与不同剂量下HRO761对肿瘤的疗效关系密切。小鼠给药后取样发现，HRO761在体内可有效抑制WRN，诱导DNA损伤反应（pKAP1增加）并激活p53通路(p21诱导)，这些变化在60 mg/kg剂量下给药后第8天后达到稳态，并随肿瘤消退而逐渐减弱。组织学分析也证实，HRO761剂量依赖性地抑制肿瘤细胞增殖（Ki67阳性），并引起细胞核增大。 对不同MSI适应症的小鼠肿瘤模型和病人来源异种移植瘤（Patient-derived xenograft, PDX）模型进行大规模体内筛选，发现HRO761展现出广谱的抗肿瘤活性，其中2例完全缓解的模型分别为p53突变型（LS411N）和p53敲除型；同时。HRO761在p53敲除细胞中展现出比p53野生型细胞更好的抑制作用，再次印证了HRO761的p53非依赖性抗肿瘤机制。进一步，研究人员评估了HRO761与伊立替康联用的疗效。体外试验表明，HRO761与伊立替康在低于各自有效浓度时即可产生协同的细胞毒作用，并在高浓度HRO761处理下抑制了细胞再生长。体内研究证实，HRO761与伊立替康联用可在多个剂量组合下诱导肿瘤完全消退。这提示联合用药可能降低HRO761和伊立替康所需的个体给药剂量，从而拓宽治疗窗。     综上，本研究运用化学筛选、药物设计等方法，得到具有高效抑制WRN活性的候选新药HRO761，评估了其在不同癌细胞系中的效果，验证了在MSI癌细胞模型中HRO761的合成致死效应，并对HRO761诱导合成致死效应的分子机制进行研究。目前HRO761正在开展I期临床试验，以评估其在结直肠癌等MSI实体瘤中的安全性和初步疗效。 参考文献 1. van Wietmarschen, N., Sridharan, S., Nathan, W.J. et al. Repeat expansions confer WRN dependence in microsatellite-unstable cancers. Nature 586, 292–298 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2769-8 2. Pérez, Fernando Rodríguez et al. “WRN Inhibition Leads to its Chromatin-Associated Degradation Via the PIAS4-RNF4-p97/VCP Axis.” bioRxiv (2023): n. pag. https://doi.org/10.1101/2023.12.08.570895 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

Rishi R. Shah等人的综述报道了首个共价 VHL 配体的设计和优化过程，以及将其纳入 PROTACs 以用于 TPD 应用的过程。已知 VHL 结合体的羟脯氨酸基团可以被磺酰氟分子取代，并通过结构指导优化生成了一种配体，将它们加入双功能降解剂中可诱导 BRD4 或雄激素受体的靶向蛋白降解，而无需进一步优化链接。文章要点如下：这是首次报道缺乏羟脯氨酸基团并通过磺酰氟分子与 VHL 共价结合的 VHL 配体也是首次通过设计而非筛选开发的共价 E3 连接酶结合剂扩大了共价 E3 连接酶 PROTAC 的底物范围01研究背景蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）是一种异多功能分子，通过利用细胞蛋白水解降解机制诱导靶向蛋白质降解（TPD）。（VHL）蛋白是 PROTAC 广泛使用的 E3 连接酶之一。以共价方式与 E3 连接酶配位的 PROTACs 引起了人们的浓厚兴趣，可将三元复合物转化为修饰 E3 与底物之间的简单二元相互作用（图 1A），因而比可逆配位的 PROTACs 具有潜在优势。迄今为止，已报道的共价 PROTACs 包括 DCAF1、DCAF11、DCAF16、RNF4、RNF114 和 FEM1B，每种都带有半胱氨酸靶向亲电弹头（如氯乙酰胺或 α、β-不饱和羰基），而且都是通过筛选而非设计发现的。然而，通过设计发现具有广泛兴趣蛋白（POI）范围的共价 PROTACs 具有挑战性。02第一代磺酰氟共价 VHL 配体VH032 是迄今为止在 PROTACs 中应用最广泛的 VHL 配体， VHL-SF1 是探究 VHL 共价修饰的合理起点。VHL-SF1 的合成首先通过一系列简短的反应生成 (S)-羟脯氨酸（方案 S1）。用硫代乙酸酯置换甲磺酸盐 1 得到化合物 2，化合物 2 通过磺酰氯 3 转化为磺酰氟 4（方案 1）。虽然这一反应生成了所需的磺酰氟，但脯氨酸环发生了外嵌合，导致 LC-MS 分析检测到非对映异构体混合物。为了避免这种情况，研究者开发了新的反应条件，直接从硫代乙酸酯 2 一步合成所需的磺酰氟，只得到所需的立体异构体 5。方案 1. 开发在 VHL-SF1 和 VHL-SF1 生物素中引入磺酰氟分子的新合成路线为了评估 VHL-SF1 对 VHL 进行共价修饰的能力，研究者首先开发了一种链霉亲和素转移试验，通过这项检测得出结论：室温下培养 2 小时后，10 μM VHL-SF1 生物素修饰了 32% 的 VHL，进一步证实这与探针的浓度有关。在竞争性荧光偏振（FP）试验中，浓度高达 100 μM 的 VHL-SF1 无法取代荧光团标记的 HIF1α 肽，而已知 HIF1α 肽同时占据了 VH032 结合位点和第二个 VHL 结构域。接下来开发第二代共价 VHL 结合剂，提高其效力和占据率。03第二代磺酰氟 VHL 共价配体为了提高共价配体的效力，优化羟脯氨酸外围基团可以增强对 VHL 的亲和力。研究 VHL-SF1 类似物的对接姿势，包括 VHL-SF2，其中的叔亮氨酸分子换成了甲基异噁唑，连接载体移到了苄基位置（图 2A）。与 VHL-SF1 不同的是，这一分析表明 VHL-SF2 可与 Ser110 共价结合，同时保持与 VH032 的许多非共价相互作用（图 2B）。VHL-SF2在链霉亲和素转移试验中显示出比第一代VHL-SF1更高的VHL修饰效率（44% vs 32%）。此外，VHL-SF2在荧光偏振（FP）试验中能够以35 μM的IC50值置换标记肽，表明其能够有效占据VHL的HIF1α结合位点。在活细胞中，VHL-SF2通过竞争性牵引试验进一步证实了其与VHL的结合，且这种结合可以通过预处理进行剂量依赖性竞争。磺酰氟弹头在生理pH和40°C下的稳定性降低可能是导致细胞试验中效力降低的原因之一。总体而言，VHL-SF2的开发和评估表明了其作为一种有效的共价VHL配体的潜力，能够在细胞内特异性地修饰VHL并诱导目标蛋白的降解。VHL-SF2 的合成分为 11 个步骤。04基于 VHL-SF2 的 PROTAC 可诱导蛋白酶体依赖性的 BRD4 TPD在离体蛋白和完整细胞中验证了 VHL-SF2 与 VHL 的接合后，研究者合成了一种 BRD4 靶向 PROTAC--BRD-SF2，其中包含 VHL-SF2 和一种已知的 BRD4 配体（图 3A），并使用 BRD4 HiBiT 检测法评估了靶蛋白降解情况。而 VHL-SF2 本身并不影响 BRD4 水平（图 3B），在这些条件下，BRD-SF2 和 VHL-SF2 没有显示出细胞毒性。用蛋白酶体活性抑制剂或 NEDDylation 抑制剂（分别为 epoxomicin 和 MLN4924）处理时，BRD4 在 BRD-SF2 存在的情况下不会被耗尽，这证明蛋白酶体和 Cullin E3 连接酶依赖机制与 VHL 的招募是一致的。05基于VHL-SF2的PROTACs诱导AR的TPD为了进一步证实 VHL-SF2 在加入 PROTAC 时招募 VHL 诱导靶蛋白降解的多功能性，研究者合成了两种 AR 配体衍生的 VHL-SF2 共轭物 AR-VHL-SF2 和 AR2-VHL-SF2，它们基于具有诱人细胞效力的已知 AR 配体，这些配体以前曾被加入 AR 双功能降解剂中（图 3F）。在 LNCaP 前列腺癌细胞中使用 AR HiBiT 检测法评估了这些化合物诱导 AR 降解的情况，其中内源性 AR 被标记了 HiBiT 肽（图 3G）。AR-VHL-SF2和AR2-VHL-SF2都能诱导AR降解，此外，Arvinas的AR降解临床候选药物ARV110也能诱导AR降解。根据 MLN4924 存在下的 AR 降解阻断，AR-VHL-SF2- 和 AR2-VHL-SF2- 介导的蛋白质降解都是蛋白酶体和 E3 连接酶依赖性的（图 3H、I），并且在这些条件下没有表现出细胞毒性。与非共价 PROTACs 的标准三元复合物相比，共价 E3 连接酶招募剂在催化效率和延长预测的二元复合物功效方面具有优势。未来，应通过全蛋白质组学进一步研究这种加合物群对 VHL 天然底物的影响，以确定最小的占有率是否足以在不改变 VHL 功能的情况下促进 TPD。06共价 VHL PROTACs 的优势  为了进一步研究共价 VHL 配体的潜在优势，在Washout实验中对 BRD-SF2 和 MZ-1 进行了正面比较。在该实验中，BRD-SF2 的降解活性相对于 MZ-1 的降解活性降低了（图 4A,B），分别为 27% 和 48%。在有竞争浓度的 VH032 正交存在的情况下进行的 BRD4 HiBiT 检测证实，在 6 小时后，MZ-1 降解 BRD4 受竞争者存在的影响更大。这些结果进一步支持了 BRD-SF2 的共价作用机制，并强调了在去除游离 PROTAC 或存在竞争性结合剂的情况下延长降解活性的潜力。总结本研究为羟脯氨酸中心的其他结构修饰铺平了道路，最终可改善针对 VHL 的 PROTAC 的药代动力学和药效学特性。并为进一步优化 VHL 共价配体以提高药效和稳定性的药物化学研究奠定了基础。本文还报告了 BRD4 和 AR 的新型双功能降解剂，这些降解剂可作为开发具有更好药代动力学和药效学特性的 PROTACs 的起点。参考文献https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.3c02123声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓